Nghiên cứu khả năng chuyền nạp Gen của hai giống bông vải SSR60F và COKER 312

Nghiên cứu khả năng chuyền nạp Gen của hai giống bông vải SSR60F và COKER 312

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI GIỐNG BÔNG VẢI SSR60F VÀ COKER 312 BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: PHẠM QUYẾT THẮNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI GIỐNG BÔNG VẢI SSR60F VÀ COKER 312 BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS Trần Thị Cúc Hồ Phạm Quyết Thắng Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 LỜI CẢM TẠ Chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Ban chủ nhiệm Bộ Mơn Cơng Nghệ Sinh Học Các Thầy ngồi Trƣờng Đại Học Nông Lâm Đã truyền đạt cho em kiến thức khoa học thời gian em học tập trƣờng Đặc biệt xin chân thành cảm ơn: TS Trần Thị Cúc Hịa- Trƣởng mơn Cơng Nghệ Sinh Học- Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, TS Trần Thị Dung- Trƣởng môn Công Nghệ Sinh Học- Trƣờng Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ em nghiên cứu thực khóa luận TS Trần Ngọc Thạch tận tình hƣớng dẫn, bảo em suốt thời gian em thực khóa luận Các anh chị môn Công Nghệ Sinh Học Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long Xin cảm ơn bạn lớp động viên giúp đỡ suốt q trình học tập làm khóa luận tốt nghiệp Con xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, ngƣời sinh thành, nuôi dƣỡng, dạy dỗ bên thời điểm Thủ Đức, ngày 15 tháng 09 năm 2005 Phạm Quyết Thắng TĨM TẮT PHẠM QUYẾT THẮNG, Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI GIỐNG BÔNG VẢI SSR60F VÀ COKER 312 BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens” Giảng viên hƣớng dẫn: TS TRẦN THỊ CÚC HÒA Nghiên cứu chuyển nạp gen vào vải nhằm đƣa vào đặc tính mong muốn: kháng sâu bệnh, kháng thuốc diệt cỏ, tăng cƣờng chất lƣợng sợi… điều cần thiết ngành trồng nƣớc ta Việc ứng dụng hệ thống lọc đƣờng mannose chuyển nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens bơng cịn mẻ Việt nam Việc sử dụng hệ thống lọc đƣờng mannose có ƣu điểm khơng tạo lo ngại an toàn sinh học nhƣ hệ thống lọc chất kháng sinh Khóa luận “Nghiên cứu khả chuyển nạp gen hai giống vảI SSR60F Coker 312 vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” đƣợc thực nhằm mục đích nhằm tìm hiểu khả chuyển nạp gen hai giống vải SSR60F Coker 312, tập trung nghiên cứu sử dụng hệ thống chọn lọc mannose để lọc mô sẹo vải sau đƣợc chuyển nạp Trong nghiên cứu này, véctơ (vector) pManCa đƣợc thiết kế mang gen đánh dấu chọn lọc pmi (để sử dụng hệ thống chọn lọc mannose) gen gus đƣợc chuyển nạp khúc cắt trụ hạ diệp mầm in vitro - ngày tuổi qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Sau đƣợc chuyển nạp, mẫu đƣợc nuôi cấy môi trƣờng tạo mơ sẹo có chứa mannose qua vịng lọc Kết đƣợc ghi nhận nhƣ sau: Các mơ sẹo hai giống bơng phát triển bình thƣờng qua hai vịng lọc mơi trƣờng có chứa mannose Ở vòng lọc thứ 3, hiệu chọn lọc mannose biểu rõ Ở mẫu đối chứng không chuyển nạp gen, tỷ lệ chết 100% giống; mẫu chuyển nạp gen, tỷ lệ sống sót 1,73% giống Coker 312 3,67% giống SSR60F Việc tách nhỏ khối mô sẹo trƣớc cho lọc lần cần thiết để tránh tình trạng (escape) lọc việc chọn mẫu sống sót chuyển nạp gen thành cơng đƣợc xác Cần tiếp tục nghiên cứu để chuẩn hoá nồng độ mannose lần lọc, kích thƣớc mơ sẹo, v.v để nâng cao hiệu chọn lọc mannose vải Chú ý giống bơng vải SSR60F để sử dụng chƣơng trình tạo giống biến đổi gen Việt Nam ABSRACT PHAM QUYET THANG, Nong Lam University August 2005 “STUDY ON THE ABILITY OF GENE TRANSFORMATION OF TWO COTTON CULTIVARS SSR60F AND COKER 312 BY USING AGROBACTERIUM TUMEFACIENS ” Supervisor: Dr Tran Thi Cuc Hoa Study on gene transformation of cotton in order to tranfer of desirable traits like pest resistance, herbicide reistance, improved fiber quality …is necessary for the cotton industry of our country at present The application of mannose selection and Agrobacterium tumefaciens- mediated transformation method are still new in Vietnam The application of mannose selection system has an advantage because it does not cause concerns on biosafety as the selection systems using antibiotics The assignment “Study on the ability of gene transformation of two cotton cultivars SSR60F and Coker 312 by using Agrobacterium tumefaciens” were carried out to investigate the reponse ability of two cotton cultivars SSR60F and Coker 312 to gene transformation, in which the study was focused on the use of mannose to screen calli of cotton after transformed In this study, the vector pManCa was constructed carryring the selective marker gene pmi (to facilate selection with mannose) and gene gus The hypocotyl segments of - old seedlings in vitro of the two cotton cultivars were transformed by using Agrobacterium tumefaciens After transformed the explants were cultured on the medium containing mannose passing three cycles of selection The results were recorded as follows During the 1st and 2nd cycle selection with manose, calli of both cotton cultivars grew normally At the 3rd cycle of selection, the effect of mannose appeared obviously It was recorded that all the non-transformed calli died, while with the transformed calli, the surivial percentage were 1.73% for the cultivar Coker and 3.67% for the cultivar SSR60F The separation of calli into smaller pieces before culturing on the medium at the cycle of selection was necessary to prevent escape of non-transformed calli and to make the selection of putative transformed calli more precise rd Further studies are needed to standardize the concentrations of mannose at each cycle of selection, the size of calli, etc to improve the efficiency of mannose selection for cotton Attention should be given to the cultivar SSR60F to be used in the breeding program to develop transgenic cotton cultivars in Vietnam MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ iii Tóm tắt iv Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt viii Danh sách hình ix Danh sách bảng .x LỜI MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu .3 1.3 Hạn chế khoá luận .3 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cây vải 2.1.1 Vị trí phân loại 2.1.2 Tính đa dạng, nguồn gốc phân bố 2.1.2.1 Gossypium hirsutum 2.1.2.2 Gossypium arboreum 2.1.2.3 Gosypium barbadense 2.1.3 Tình hình sản xuất bơng Việt Nam .6 2.1.4 Tình hình sản xuất giới .7 2.2 Một số nghiên cứu chuyển nạp gen vải .10 2.2.1 Hạn chế phƣơng pháp tạo giống truyền thống 10 2.2.2 Một số nghiên cứu chuyển nạp gen vải 10 2.3 Chuyển nạp gen vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 12 2.3.1 Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .13 2.3.2 Plamid Ti 14 2.3.2.1 Chức T-DNA 15 2.3.2.2 Chức gen Vir .17 2.3.2.3 Cơ chế lây nhiễm .19 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 22 3.1 Vật liệu 22 3.2 Địa điểm thời gian thực 22 3.3 Phƣơng Pháp 22 3.3.1 Quy trình chuyển nạp gen .22 3.3.1.1 Chuẩn bị vật liệu nuôi cấy 22 3.3.1.2 Nguồn Plasmid 23 3.3.1.3 Chuẩn bị vi khuẩn 24 3.3.1.4 Đồng nuôi cấy 24 3.3.1.5 Thanh lọc tái sinh 25 3.3.2 Các tiêu theo dõi 26 3.3.2.1 Tỷ lệ hình thành mơ sẹo 26 3.3.2.2 Kết lọc .26 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .28 4.1 Sự hình thành mơ sẹo 28 4.1.1 Đặc điểm hình thái mơ sẹo 28 4.1.2 Tỷ lệ hình thành mơ sẹo 31 4.2 Kết lọc 34 4.2.1 Thanh lọc lần 34 4.2.2 Thanh lọc lần 36 4.2.3 Thanh lọc lần 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43 5.1 Kết luận 43 5.2 Đề nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AMP Adenosine 5’- monophosphate ATP Adenosine 5’- triphosphate AS Acetosyringone CaMV35S Vùng khởi động phiên mã ctv cộng tác viên DNA Deoxyribonucleotic acid gus gen gus (gen thị) GUS enzyme β-glucuronidase lacZ gen β-galactosidase LB Bờ trái (Left border) MLN mẫu lây nhiễm MS Murashige and Skoog (1962) MSCo Môi trƣờng đồng nuôi cấy MSS1, MSS2, MSS3 Môi trƣờng lọc lần 1, 2, OD600 Độ hấp thụ tối đa bƣớc sóng 600 nm ori Vùng khởi động tự tái PEG polyethylene glycol PMI Enzyme Phosphomannose isomerase pmi gen pmi plasmid Ti Plasmid kích thích tạo khối u (pTi) RB Bờ phải (Right border) rpm vòng/phút (round per minute) T-DNA DNA đƣợc chuyển (transferred DNA) YEP Yeast extract pepton Vir gen vir Vir virulence protein 2,4-D 2,4-dichlorophenoxy acetic acid v/v thể tích/thể tích (volume/volume) w/v trọng lƣợng/thể tích (weight/volume) DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình Trang Hình 2.1 Một số khối u vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo 13 Hình 2.2 Một khối u vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo 14 Hình 2.3 Quá trình tạo phức hợp sợi đơn T-DNA 19 Hình 2.4 Q trình hồ hợp T-DNA vào gen tế bào 20 Hình 2.5 Mơ hình chuyển nạp T-DNA từ tế bào vi khuẩn vào tế bào .21 Hình 3.1 Cây mầm mơi trƣờng nảy mầm 23 Hình 3.2 Sơ đồ vectơ pManCa mang gen pmi 24 Hình 4.1 Các khúc trụ hạ diệp môi trƣờng đồng MSCo 28 Hình 4.2 Mơ sẹo giống Coker 312 sau ngày mơi trƣờng MSRe 29 Hình 4.3 Mô sẹo mẫu lây nhiễm tuần môi trƣờng MSS1 29 Hình 4.4 Mơ sẹo giống Coker 312 sau tuần môi trƣờng MSS2 .30 Hình 4.5 Mơ sẹo giống Coker 312 sau tuần mơi trƣờng MSS3 .31 Hình 4.6 Mơ sẹo môi trƣờng MSRe 33 Hình 4.7 Mơ sẹo giống Coker 312 sau 14 ngày mơi trƣờng MSS1 36 Hình 4.8 Các khối mô sẹo giống Coker 312 môi trƣờng lọc 38 Hình 4.9 Mơ sẹo giống Coker 312 mơi trƣờng MSS3 39 Hình 4.10 Mô sẹo giống Coker 312 sau 28 ngày mơi trƣờng MSS3 40 Hình 4.11 Mơ sẹo giống Coker 312 (tách nhỏ) môi trƣờng MSS3 41 10 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1 Diễn biến tình hình sản xuất bơng Việt Nam Bảng 2.2 Mƣời nƣớc có diện tích trồng bơng lớn giới Bảng 2.3 Mƣời nƣớc có sản lƣợng bơng cao giới Bảng 3.1 Nồng độ mannose glucose qua ba lần lọc 25 Bảng 3.2 Tóm tắt quy trình chuyển nạp gen vào vải 27 Bảng 4.1 Tỷ lệ hình thành mơ sẹo giống Coker 312 32 Bảng 4.2 Tỷ lệ hình thành mơ sẹo giống SSR60F .32 Bảng 4.3 Kết lọc lần giống Coker 312 35 Bảng 4.4 Kết lọc lần giống SSR60F .35 Bảng 4.5 Kết lọc lần giống Coker 312 36 Bảng 4.6 Kết lọc lần mẫu lây nhiễm giống SSR60F 37 Bảng 4.7 Kết lọc lần giống Coker 312 41 Bảng 4.8 Kết lọc lần giống SSR60F .41 ... NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI GIỐNG BÔNG VẢI SSR60F VÀ COKER 312 BẰNG VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS 13 1.2 Mục tiêu Khóa luận: “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI GIỐNG... luận ? ?Nghiên cứu khả chuyển nạp gen hai giống vảI SSR60F Coker 312 vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” đƣợc thực nhằm mục đích nhằm tìm hiểu khả chuyển nạp gen hai giống vải SSR60F Coker 312, ... 8/2005 “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI GIỐNG BÔNG VẢI SSR60F VÀ COKER 312 BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens” Giảng viên hƣớng dẫn: TS TRẦN THỊ CÚC HÒA Nghiên cứu chuyển nạp gen vào