41 Trong 7 thí nghiệm sau này, các mô sẹo đƣợc tách nhỏ (khoảng 3 mm) trƣớc khi cấy chuyển lên môi trƣờng thanh lọc lần 3. Kết quả là các mô sẹo chuyển màu nâu đen rất nhiều (hình 4.5 B). Đây là các mô sẹo chết. Quan sát trên một số mô sẹo hóa nâu thấy có xuất hiện các mô sẹo mới. Các mô sẹo này có thể là những mô sẹo đƣợc chuyển nạp gen. Hình 4.5. Mô sẹo mẫu lây nhiễm giống Coker 312 sau 2 tuần trên môi trƣờng thanh lọc lần 3. A: Mô sẹo không tách nhỏ, B: Mô sẹo tách nhỏ 4.1.2. Tỷ lệ hình thành mô sẹo Trong nuôi cấy mô, sự phát sinh hình thái của mẫu cấy có một ý nghĩa rất quan trọng. Các mẫu cấy có thể phát sinh hình thái theo các hƣớng: hình thành mô sẹo, phát sinh phôi hay tái sinh thành cây. Tỷ lệ hình thành mô sẹo là một trong những chỉ tiêu quan trọng trong nuôi cấy mô thông thƣờng và chuyển gen. Tỷ lệ hình thành mô sẹo cho chúng ta biết đƣợc khả năng hình thành mô sẹo của mẫu nuôi cấy. Trong thí nghiệm, tỷ lệ hình thành mô sẹo đƣợc theo dõi ở thời điểm sau 7 ngày. 42 Bảng 4.1. Tỷ lệ hình thành mô sẹo của giống Coker 312 (sau 7 ngày trên môi trƣờng phục hồi) Thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu tạo mô sẹo (sau 7 ngày) Tỷ lệ (%) Đối chứng MLN Đối chứng MLN Đối chứng MLN 1 60 160 60 158 100 98,75 2 60 130 60 128 100 98,46 3 60 155 60 154 100 99,35 4 60 120 60 120 100 100 Trung bình 100 99,14 Ghi chú: MLN (mẫu lây nhiễm) Bảng 4.2. Tỷ lệ hình thành mô sẹo của giống SSR60F (sau 7 ngày trên môi trƣờng phục hồi) Thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu tạo mô sẹo (sau 7 ngày) Tỷ lệ (%) Đối chứng MLN Đối chứng MLN Đối chứng MLN 1 60 185 59 169 98,33 91,35 2 60 176 58 160 96,67 90,91 3 60 190 60 176 100 92,63 4 60 190 59 176 98,33 92,63 5 60 200 57 180 97,67 90,00 Trung bình 96,67 91,50 Ghi chú: MLN (mẫu lây nhiễm) Tỷ lệ hình thành mô sẹo giữa các giống có sự khác nhau. Sau 7 ngày (sau 10 ngày) trên môi trƣờng phục hồi, mẫu lây nhiễm có tỷ lệ hình thành mô sẹo cao nhất ở giống Coker 312 đạt 99,14%, giống SSR60F đạt 91,50%. Các mẫu lây nhiễm ở giống Coker 312 hình thành mô sẹo ngay khi còn trên môi trƣờng phục hồi. Trong khi đó, các mẫu lây nhiễm của giống SSR60F hình thành mô sẹo chậm hơn (hình 4.6). 43 Hình 4.6. Mô sẹo trên môi trƣờng phục hồi. A: Mô sẹo mẫu đối chứng giống SSR60F, B: Mô sẹo mẫu lây nhiễm giống SSR60F, C: Mô sẹo mẫu đối chứng giống Coker 312, D: Mô sẹo mẫu lây nhiễm giống Coker 312 Tất cả các mẫu đối chứng của giống Coker 312 đều hình thành mô sẹo ngay khi còn ở trên môi trƣờng phục hồi và đạt tỷ lệ 100%. Trong khi đó mẫu đối chứng của giống SSR60F hình thành mô sẹo chậm hơn và chỉ đạt tỷ lệ 96,67%. Các mẫu đối chứng hình thành mô sẹo mạnh hơn các mẫu lây nhiễm. Điều này có thể giải thích là do mẫu lây nhiễm bị tổn thƣơng do các tác nhân nhƣ: vật lý (thao tác khi cấy, va chạm giữa các mẫu, rửa mẫu…), hóa học (nƣớc, kháng sinh, môi trƣờng…). Tuy nhiên, sau khi chuyển lên môi trƣờng thanh lọc lần một tất cả các mẫu đều hình thành mô sẹo. Những mẫu chƣa tạo mô sẹo trên môi trƣờng phục hồi đều đƣợc cấy chuyển lên môi trƣờng thanh lọc lần 1 và sau 14 ngày trên môi trƣờng thanh lọc lần 1, tất cả những mẫu này đều hình thành mô sẹo. Kết quả bảng 4.1 và bảng 4.2 cho thấy hai giống đáp ứng hình thành mô sẹo tốt. Trong khi đó Chaudhary và ctv. (2003) báo cáo một tỷ lệ hình thành mô sẹo thấp hơn (78% của mẫu lây nhiễm sau 10-15 ngày). Tỷ lệ hình thành mô sẹo khác nhau này có thể là do Chaudhary và ctv. (2003) đã chuyển các mẫu lây nhiễm lên môi trƣờng thanh lọc (tác nhân thanh lọc là kanamycin) ngay. Hơn nữa, giống bông vải sử dụng cũng khác nhau (giống Coker 310). Tuy nhiên, tỷ lệ hình thành mô sẹo ở mẫu đối 44 chứng lại giống nhau (100%). Điều này có nghĩa là sự khác nhau trong tỷ lệ hình thành mô sẹo của mẫu lây nhiễm là do thời điểm quan sát khác nhau và việc mẫu ngay lên môi trƣờng thanh lọc có ảnh hƣởng tới tỷ lệ hình thành mô sẹo. Theo Firoozabady (1987) và Rajasekaran (1996) khả năng tái sinh của cây bông còn phụ thuộc rất lớn vào kiểu gen và mẫu nuôi cấy. Điều này cho thấy rằng sự khác nhau trong tỷ lệ hình thành mô sẹo giữa các giống bông vải ở trên một phần cũng do ảnh hƣởng của kiểu gen. Ngoài ra không loại trừ khả năng sự khác nhau trong tỷ lệ hình thành mô sẹo giữa các giống còn do thác tác trong thí nghiệm. Các thao tác giữa các lần thí nghiệm về mặt chi tiết có thể khác nhau. Ví dụ nhƣ trong thao tác rửa vi khuẩn chỉ cần để các mẫu lây nhiễm lâu hơn một chút trong nƣớc là cũng có thể làm cho mẫu thâm đen và do đó làm kéo dài thời gian hình thành mô sẹo. 4.2. Kết quả thanh lọc Trong chuyển nạp gen, thanh lọc mẫu là điều rất quan trọng. Thanh lọc các mẫu giúp loại bỏ bớt các mẫu không đƣợc chuyển nạp gen. Các mẫu không chuyển nạp gen đƣợc loại bỏ bằng cách đặt các mẫu trên môi trƣờng chứa tác nhân thanh lọc. Những mẫu không chuyển nạp gen sẽ không phát triển hoặc phát triển chậm trên môi trƣờng có tác nhân thanh lọc. Trong khi đó, các mẫu đƣợc chuyển nạp lại sống sót và phát triển tốt trên môi trƣờng có tác nhân thanh lọc. Kết quả thanh lọc đƣợc đánh giá dựa trên số mẫu sống sót trên môi trƣờng thanh lọc. 4.2.1. Thanh lọc lần 1 Sau bảy ngày trên môi trƣờng phục hồi, các mẫu đƣợc chuyển lên môi trƣờng thanh lọc lần 1 (MSS1). Môi trƣờng MSS1 có chứa 1% glucose và 2,5% mannose. 45 Bảng 4.3. Kết quả thanh lọc lần 1 giống Coker 312 (sau 14 ngày trên MSS1) Thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống sót Tỷ lệ (%) Đối chứng MLN Đối chứng MLN Đối chứng MLN 1 60 160 60 157 100 98,13 2 60 130 60 126 100 96,92 3 60 155 60 153 100 98,71 4 60 120 60 115 100 95,83 Trung bình 100 97,40 Ghi chú: MLN (mẫu lây nhiễm) Bảng 4.4. Kết quả thanh lọc lần 1 giống SSR60F (sau 14 ngày trên MSS1). Thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống sót Tỷ lệ (%) Đối chứng MLN Đối chứng MLN Đối chứng MLN 1 60 185 60 180 100 97,29 2 60 176 60 173 100 98,29 3 60 190 60 185 100 97,36 4 60 190 60 188 100 98,94 5 60 200 60 197 100 98,50 Trung bình 100 98,08 Ghi chú: MLN (mẫu lây nhiễm) Nhận xét: - Sau 14 ngày trên môi trƣờng MSS1, các mô sẹo hình thành tốt. Giữa mẫu đối chứng và mẫu lây nhiễm không có sự khác biệt (hình 4.7). Nguyên nhân chính là do trong môi trƣờng MSS1 có chứa 1% (w/v) đƣờng glucose nên các mẫu cả đối chứng và lây nhiễm đều sử dụng dạng đƣờng này trƣớc để phát triển. - Một số mẫu chết trong lần thanh lọc thứ nhất có mầu nâu đen và gần nhƣ không hình thành mô sẹo. Các mẫu này chết là do các tác nhân lý hóa học. - Sau 14 ngày trên môi trƣờng thanh lọc lần 1 MSS1, mô sẹo của các mẫu lây nhiễm có kích thƣớc nhỏ hơn so với mô sẹo của các mẫu đối chứng. 46 - Tỷ lệ mẫu mô sẹo sống sót giữa mẫu đối chứng và mẫu lây nhiễm của mỗi giống lần lƣợt là: - Giống Coker312: 100% và 97,40%. - Giống SSR60F: 100% và 98,08%. Hình 4.7. Mô sẹo giống Coker 312 sau 14 ngày trên môi trƣờng MSS1. A: mẫu đối chứng, B: mẫu lây nhiễm. 4.2.2. Thanh lọc lần 2 Sau 14 ngày trên môi trƣờng MSS1, các mẫu đƣợc cấy chuyển lên môi trƣờng thanh lọc lần 2 (MSS2). Môi trƣờng MSS2 là môi trƣờng thanh lọc lần 2 có chứa 0,5% glucose và 3% mannose. Bảng 4.5. Kết quả thanh lọc lần 2 giống Coker 312 (sau 14 ngày trên MSS2) Thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống sót Tỷ lệ (%) Đối chứng MLN Đối chứng MLN Đối chứng MLN 1 60 157 60 150 100 98,12 2 60 126 60 125 100 96,92 3 60 153 60 147 100 98,71 4 60 119 60 117 100 99,17 Trung bình 100 97,28 Ghi chú: MLN (mẫu lây nhiễm) 47 Bảng 4.6. Kết quả thanh lọc lần 2 các mẫu lây nhiễm giống SSR60F (sau 14 ngày trên MSS2). Thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống sót Tỷ lệ (%) Đối chứng MLN Đối chứng MLN Đối chứng MLN 1 60 180 60 179 100 99,44 2 60 173 60 172 100 99,42 3 60 185 60 180 100 97,29 4 60 188 60 183 100 97,34 5 60 197 60 193 100 97,97 Trung bình 100 98,29 Ghi chú: MLN (mẫu lây nhiễm) Nhận xét: - Sau 14 ngày trên môi trƣờng thanh lọc lần 2 (MSS2), các mô sẹo ra tăng kích thƣớc rất nhanh và theo quan sát thì kích thƣớc khối mô sẹo ra tăng gấp đôi so với kích thƣớc khi mới đặt lên trên môi trƣờng thanh lọc lần 1 (hình 4.8 A, B). - Giữa mô sẹo mẫu đối chứng và mô sẹo mẫu lây nhiễm vẫn chƣa có sự khác biệt rõ ràng (hình 4.8 C, D). Các khối mô sẹo của mẫu đối chứng và mẫu lây nhiễm trên môi trƣờng có tác nhân thanh lọc phát triển nhƣ nhau. - Trên môi trƣờng thanh lọc lần 2, các mẫu đối chứng chƣa có dấu hiệu chậm phát triển lại, điều này có thể giải thích do trên môi trƣờng thanh lọc lần 2 có 0,5% (w/v) glucose nên các mẫu đối chứng vẫn phát triển đƣợc. - Tỷ lệ mô sẹo sống sót giữa mẫu đối chứng và mẫu lây nhiễm của mỗi giống lần lƣợt: - Giống Coker312: 100% và 97,28%. - Giống SSR60F: 100% và 98,295. - So sánh tỷ lệ sống sót của mô sẹo mẫu đối chứng và mẫu lây nhiễm thì thấy rằng tỷ lệ sống sót của mô sẹo mẫu đối chứng cao hơn mô sẹo mẫu lây nhiễm. Điều này có thể do tác nhân thanh lọc chƣa có ảnh hƣởng nhiều tới mô sẹo. Hơn nữa, các mẫu lây nhiễm phải chịu các tổn thƣơng trƣớc khi cấy chuyển lên môi trƣờng thanh lọc. 48 Hình 4.8. Các khối mô sẹo giống Coker 312 trên môi trƣờng thanh lọc. A: trên môi trƣờng thanh lọc lần 2, B: trên môi trƣờng thanh lọc lần 1, C, D: mẫu lây nhiễm và mẫu đối chứng 2 tuần trên môi trƣờng thanh lọc lần 2. 4.2.3. Thanh lọc lần 3 Trên môi trƣờng thanh lọc MSS3, trong 2 thí nghiệm đầu tiên, các khối mô sẹo không đƣợc tách nhỏ, sau 14 ngày trên môi trƣờng MSS3 thì thấy rằng: - Ở các khối mô sẹo lây nhiễm xuất hiện hai loại mô sẹo: một có màu trắng xám và một có màu xanh vàng mọc ra ngay bên cạnh các mô sẹo màu trắng xám. Các mô sẹo màu trắng xám có thể do hai nguồn gốc: một là từ các tế bào già chết và một từ các tế bào không chuyển nạp gen chết. Các khối mô sẹo của mẫu lây nhiễm có nhiều mô sẹo màu trắng xám hơn các khối mô sẹo của mẫu đối chứng. - Không có sự khác biệt rõ ràng giữa mẫu đối chứng và mẫu lây nhiễm về mặt hình thái (hình 4.9 A, B). Nguyên nhân có thể do các khối mô sẹo không đƣợc tách nhỏ trƣớc khi chuyển lên môi trƣờng MSS3 nên trong các khối mô sẹo của mẫu đối chứng có thể có sự tích tụ đƣờng glucose. Tuy nhiên, sau 28 ngày trên môi trƣờng 49 MSS3, trên mẫu lây nhiễm có một số khối mô sẹo chuyển sang màu nâu xám và sậm màu dần, mẫu đối chứng cũng chuyển màu tƣơng tự (hình 4.10 A, B). Các khối mô sẹo này đƣợc cho kết luận đã chết. Ở mẫu đối chứng cũng có các khối mô sẹo tƣơng tự. Nhƣ vậy, có thể thấy rằng thanh lọc lần 3 chỉ có hiệu quả khi các mẫu đƣợc nuôi cấy ít nhất khoảng 28 ngày trên môi trƣờng MSS3. Tuy vậy, nồng độ mannose vẫn đƣợc đề nghị tăng lên ở các lần thanh lọc. Nồng độ mannose có thể bắt đầu là 3% (w/v) và thanh lọc lần 3 sẽ là 4% (w/v). Bởi vì hiệu quả thanh lọc chƣa cao. Hơn nữa, trƣớc khi đƣợc cấy chuyển lên môi trƣờng thanh lọc lần 3 (MSS3) các khối mô sẹo nên đƣợc tách nhỏ để rút ngắn thời gian thanh lọc. Hình 4.9. Mô sẹo giống Coker 312 (không tách nhỏ, sau 14 ngày) trên môi trƣờng thanh lọc lần 3 (A: mẫu lây nhiễm, B: mẫu đối chứng, C, D: khối mô sẹo có các tế bào hóa nâu và các cụm mô sẹo mới) 50 Hình 4.10. Mô sẹo giống Coker 312 sau 28 ngày trên môi trƣờng thanh lọc lần 3. A: mẫu lây nhiễm, B: mẫu đối chứng chết. Trong 7 thí nghiệm sau , sau 14 ngày trên môi trƣờng thanh lọc MSS2, các khối mô sẹo đƣợc tách nhỏ (khoảng 3 mm) và chuyển lên môi trƣờng MSS3 có 3,5% mannose và 0% glucose. Kết quả thanh lọc lần 3 các mẫu lây nhiễm (sau 14 ngày trên MSS3) đƣợc tóm tắt ở bảng 4.7 và bảng 4.8. Kết quả cho thấy, hiệu quả chọn lọc mannose có biểu hiện rõ. Các cụm mô sẹo đều chuyển sang màu nâu đen (cả đối chứng và mẫu lây nhiễm). Các cụm mô sẹo này không phát triển gia tăng kích thƣớc và chết (hình 4.11 A và B). Tuy nhiên một số mô sẹo sau khi hoá đen lại phát triển các mô sẹo mới ở các mẫu chuyển nạp gen. Ở mẫu đối chứng không chuyển nạp gen, tỷ lệ chết là 100% ở cả 2 giống; ở mẫu chuyển nạp gen, tỷ lệ sống sót là 1,73% ở giống Coker 312 và 3,67% ở giống SSR60F. Việc tách nhỏ các khối mô sẹo trƣớc khi cho thanh lọc lần 3 là rất cần thiết để tránh tình trạng thoát (escape) trong thanh lọc. . các mẫu chuyển nạp gen. Ở mẫu đối chứng không chuyển nạp gen, tỷ lệ chết là 100% ở cả 2 giống; ở mẫu chuyển nạp gen, tỷ lệ sống sót là 1,73% ở giống Coker 312 và 3,67% ở giống SSR60F. Vi c tách. A: Mô sẹo mẫu đối chứng giống SSR60F, B: Mô sẹo mẫu lây nhiễm giống SSR60F, C: Mô sẹo mẫu đối chứng giống Coker 312, D: Mô sẹo mẫu lây nhiễm giống Coker 312 Tất cả các mẫu đối chứng của giống. mô sẹo của các mẫu đối chứng. 46 - Tỷ lệ mẫu mô sẹo sống sót giữa mẫu đối chứng và mẫu lây nhiễm của mỗi giống lần lƣợt l : - Giống Coker3 1 2: 100% và 97,40%. - Giống SSR60F: 100% và 98,08%.