Trong đề tài này nhằm nghiên cứu thiết lập kỹ thuật real-time PCR với đường chuẩn tự dựng để định lượng HBV-DNA trên vùng pre-S 89bp ở các mẫu máu của bệnh nhân đến xét nghiệm viêm gan B. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết của đề tài nghiên cứu này.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG HEPATITIS B VIRUS DNA BẰNG KỸ THUẬT REAL–TIME POLYMERASE CHAIN REACTION VỚI ĐƯỜNG CHUẨN TỰ DỰNG Nguyễn Trần Minh Thắng*, Trịnh Thùy Dương*, Nguyễn Kim Thạch*, Đỗ Như Hiền* TÓM TẮT Đặt vấn đề: HBV loại Hepadnavirus gây bệnh viêm gan cấp mãn Người nhiễm virus viêm gan B mãn thường kết hợp với bệnh cảnh lâm sàng khác nhau, từ gây chết khoảng 500,000 – 700,000 người năm Vì vậy, kỹ thuật real-time PCR đời để định lượng HBV-DNA xác hơn, nhanh hơn, hiệu suất cao áp dụng nhiều nơi nước Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu thiết lập kỹ thuật real-time PCR với đường chuẩn tự dựng để định lượng HBV-DNA vùng pre-S 89bp mẫu máu bệnh nhân đến xét nghiệm viêm gan B Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả tiến hành 46 bệnh nhân bị nhiễm virus viêm gan B Tất bệnh nhân định lượng HBV-DNA kỹ thuật real-time PCR với đường chuẩn tự dựng mơn Hóa Sinh – Sinh Học Phân Tử Trường ĐHYKPNT Kết so sánh với kết real-time PCR sử dụng đường chuẩn thương mại Sự tương đồng hai kỹ thuật chứng minh qua test Wilcoxon, test Spearman biểu đồ Bland Altman Kết nghiên cứu: Qua khảo sát, chúng tơi tối ưu hóa điều kiện cho kỹ thuật real-time PCR với nhiệt độ bắt cặp mồi 600C, nồng độ mồi 400 nM, nồng độ mẫu dò Taqman 100 nM độ nhạy phản ứng 100 copies/ml Kiểm tra đường chuẩn thiết lập có R2 ≥ 0,99 E% 100% hệ số góc -3,58 đạt chuẩn với cặp mồi lựa chọn đặc hiệu cho virus viêm gan B Từ đó, chúng tơi phát định lượng HBV-DNA 34 46 trường hợp So sánh với kết real-time PCR sử dụng đường chuẩn thương mại, kết real-time PCR sử dụng đường chuẩn tự dựng cho thấy có tương đồng Kết luận: Qua nghiên cứu này, thiết lập kỹ thuật Real-time PCR dùng để định lượng HBV- DNA với đường chuẩn tự dựng mơn Hóa Sinh – Sinh Học Phân Tử trường ĐHYKPNT Từ khóa: viêm gan, HBV-DNA, real-time PCR ABSTRACT DETECTION AND QUANTITY Hepatitis B VIRUS DNA BY REAL-TIME Polymerase Chain Reaction WITH SELF-DEVELOPMENT STANDARDS Nguyen Tran Minh Thang, Trinh Thuy Duong, Nguyen Kim Thach, Do Nhu Hien * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 182 - 189 Introduction: HBV is a Hepadnavirus causing acute or chronic hepatitis People infected with chronic hepatitis B virus are often associated with many different clinical situations, thereby it has caused the death of about 500.000 to 700.000 patients every year Thus, real-time PCR technique was born to quantify HBV-DNA more accurately, more efficiently and faster and has been applied in many places in the country Research Objective: the technical set up real-time PCR study with the self building standard curve to quantify HBV-DNA in the pre-S region 89bp in the patient's blood sample tested for hepatitis B * Bộ mơn Sinh Hóa - Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch Tác giả liên lạc: BS Nguyễn Trần Minh Thắng 182 ĐT 0934.014.937 Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học Research Methodology: The descriptive study was conducted on 46 patients infected with hepatitis B All patients were quantified HBV-DNA by real-time PCR technique with the self building standard curve of Biochemistry - Molecular Biology department of Phạm Ngọc Thạch University of Medicine Results were compared with real-time PCR results using standard curve commercial The similarities between the two techniques will be demonstrated by Wilcoxon test, Spearman test and Bland and Altman graph Research results: Through the survey, we have optimized the conditions for real-time PCR technique with primer pairs temperature at 60C, 400 nM primer concentration, concentration of 100 nM Taqman sample probe and the sensitivity of reaction was 100 copies / ml Testing the baseline was set up with R2 ≥ 0.99 and E% is 100% and the angular coefficient is -3.58 with a standard primer pairs were selected specific for hepatitis B Since then, we have detected and quantified HBV-DNA in 34 out of 46 cases Compared with real-time PCR results using standard curve commercial, real-time PCR results using self building standard curve shows the similarities Conclusion: In this study, we have established real-time PCR technique using to quantify HBV-DNA with self building standard curve of Biochemistry - Molecular Biology department of Phạm Ngọc Thạch University of Medicine Key words: hepatitis, HBV-DNA, real-time PCR ĐẶT VẤN ĐỀ Nhiễm virus viêm gan B vấn đề quan tâm nhiều quốc gia giới Nhiễm virus viêm gan B nguyên nhân làm tăng tỉ lệ mắc bệnh tăng tỉ lệ tử vong toàn cầu(1,15) HBV loại Hepadnavirus gây bệnh viêm gan cấp mãn Mặc dù việc sử dụng vắc xin hữu hai thập kỷ qua có khoảng 360 triệu người giới bị nhiễm virus viêm gan B mãn tính(15) Người nhiễm virus viêm gan B mãn thường kết hợp với bệnh cảnh lâm sàng khác nhau, từ người lành mang mầm bệnh không triệu chứng đến xơ gan ung thư tế bào gan Trong đó, xơ gan ung thư tế bào gan nguyên nhân gây chết 500,000 – 700,000 người năm(15) Việc chẩn đoán theo dõi lâm sàng nhiễm virus viêm gan B chủ yếu dựa phát kháng nguyên (HBsAg, HBeAg), kháng thể (anti HBs, anti HBc anti HBe) kỹ thuật ELISA chất liệu di truyền virus (HBV – DNA) dựa kỹ thuật sinh học phân tử Trong đó, xét nghiệm ELISA phương pháp để phát người nhiễm virus viêm gan B Tuy nhiên, kết ELISA không phản ánh xác lượng virus huyết hay hoạt động virus viêm gan B hiệu điều trị thuốc kháng virus(16) Bên cạnh đó, khoảng mười năm gần đây, xét nghiệm PCR(14), phương pháp lai bắt RNA:DNA(11), phương pháp khuếch đại tín hiệu bDNA(7,11) xét nghiệm có độ nhạy độ đặc hiệu cao việc phát HBV – DNA sử dụng rộng rãi Mặc dù thực tế, phương pháp bị giới hạn khả dễ lây nhiễm chéo mẫu thử trình thao tác kỹ thuật tốn nhiều thời gian giai đoạn điện di sau thí nghiệm nên khơng thích hợp để thực thường qui thực chẩn đốn cận lâm sàng(8,13,14) Một phương pháp xác hơn, nhanh cho hiệu suất cao để định lượng HBV – DNA định genotype virus viêm gan B, Real-time PCR(12) Hiện nay, phương pháp hữu dụng việc theo dõi hiệu điều trị, phát đột biến đề kháng thuốc tái phát sau ngưng điều trị Mục đích nghiên cứu bước đầu thiết lập phương pháp định lượng HBV – DNA tảng ứng dụng kỹ thuật Real-time PCR phát vùng pre-S 89bp(6,8) với đường chuẩn tự Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 183 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 dựng sử dụng đoạn dò huỳnh quang Taqman mơn Hóa Sinh – Sinh Học Phân Tử trường ĐHYKPNT xây dựng Chúng hi vọng từ nghiên cứu đưa thêm phương pháp xét nghiệm HBV-DNA đáp ứng chất lượng giá thành hợp lý, giúp phát theo dõi kết điều trị bệnh nhân bị viêm gan B Bên cạnh đó, sử dụng hóa chất hãng khác Tối ưu hóa điều kiện phản ứng Real-time PCR ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU – PHƯƠNG PHÁP Thiết kế nghiên cứu Mô tả trường hợp bệnh Đối tượng nghiên cứu Tất bệnh nhân đến xét nghiệm viêm gan B BVĐHYD sở có HBsAg dương tính HBeAg dương tính khoảng thời gian từ 30/08/2009 đến 30/12/2009 Loại trừ bệnh nhân bị viêm gan B mà HBsAg âm tính hay HBeAg âm tính hay hai âm tính bệnh nhân khơng đồng ý tham gia nghiên cứu Các bước tiến hành Lấy máu Lấy ml máu cho vào tube chống đông EDTA, tube ml máu tube lưu giữ BVĐHYD sở để làm xét nghiệm, tube gửi mơn Hóa Sinh – Sinh học Phân Tử trường ĐHYKPNT Tại phòng thí nghiệm môn, mẫu máu ly tâm tách huyết lưu trữ -20oC Ly trích DNA Được thực theo quy trình High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche) Xây dựng quy trình kỹ thuật Real-time PCR Trình tự cặp mồi Mồi HBV dùng để khuếch đại đoạn pre-S virus viêm gan B Sản phẩm khuếch đại có kích thước 89bp, từ vị trí nucleotide 730 – 819 Đoạn mồi cung cấp nhà sản xuất IDT (Intergrated DNA Technologies, USA) 184 Phản ứng Real-time PCR phản ứng nhạy cho kết định lượng xác Tuy nhiên, phản ứng PCR thơng thường, Real-time PCR bị ức chế số thành phần tồn phản ứng hàm lượng mẫu, nhiệt độ bắt cặp mồi, nồng độ mẫu dò… Chính vậy, chúng tơi tiến hành khảo sát số điều kiện cần thiết cho phản ứng Real-time PCR nhằm tạo phản ứng Real-time PCR với hiệu tối ưu nhất, bao gồm: Nhiệt độ bắt cặp mồi, Khảo sát nồng độ mồi, Khảo sát nồng độ mẫu dò Taqman Độ lập lại phản ứng Real-time PCR Đây yếu tố quan trọng Trên mẫu, kết thu nhận khác lần thí nghiệm phòng thí nghiệm Khả gây khác biệt thao tác người thực hiện, biến động thành phần hóa chất phản ứng Real-time PCR(4),… Để đánh giá độ lập lại phản ứng Real-time PCR, tiến hành khảo sát độ lập lại phản ứng lần thí nghiệm lần thí nghiệm(10) Đường chuẩn Đường chuẩn khái niệm quan trọng chuyên biệt cho phản ứng Real-time PCR Thơng qua đường chuẩn giúp xác định cách xác hàm lượng acid nucleic mẫu ta cần quan tâm Ngoài ra, đường chuẩn giúp đánh giá liệu điều kiện phản ứng Real-time PCR mà chọn tối ưu hóa hay chưa Một phản ứng Real-time PCR tối ưu phải phản ứng cho E% từ 90-105% R2 phải đạt ≥ 0,99 Ngoài tiêu chuẩn tiên đường chuẩn đạt yêu cầu, hệ số góc đường chuẩn phải đạt từ -3,32 đến -3,8(5) Trong q trình làm nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành kiểm tra so sánh với Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học đường chuẩn công ty Khoa Thương – Việt Nam Chúng dùng nồng độ x 102 chuẩn thương mại công ty Khoa Thương Việt Nam để kiểm tra chất lượng đường chuẩn Tiến hành định lượng đường chuẩn, phản ứng lập lại lần Độ nhạy phản ứng Độ nhạy xác định mẫu huyết người nhiễm virus viêm gan B với nồng độ 4,5 × 107 copies/ml Tiến hành quy trình Real-time PCR Phản ứng Real-time PCR mẫu bệnh phẩm chạy tiến hành lúc với đường chuẩn (mẫu chứng dương) mẫu nước (mẫu chứng âm) Phân tích số liệu Hình 1: Nhiệt độ bắt cặp mồi Khảo sát nồng độ mồi Tại nồng độ mồi 400 nM E% 100,0% R2 ≥ 0,99 Vậy 400 nM nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng chúng tơi Số liệu đem phân tích với test lấy từ 33 mẫu phát định lượng với hai kỹ thuật mơn bệnh viện Dữ liệu phân tích mô tả test Wilcoxon(9), test phi tham số Spearman(9) biểu đồ Bland Altman(2,3) Tất liệu thống kê thực phần mềm SPSS 17,0 Medcalc 11,3,0,0 KẾT QUẢ Từ 30/08/2009 đến 30/12/2009, có 46 bệnh nhân đến xét nghiệm viêm gan B thỏa tiêu chuẩn chọn mẫu đưa vào nghiên cứu Chúng phát định lượng 34 trường hợp có mang virus viêm gan B thể, 12 trường hợp lại có kết âm tính Nhiệt độ bắt cặp mồi Sau khảo sát phổ nhiệt độ từ 59 – o 61 C, nhận thấy 60oC nhiệt độ bắt cặp thích hợp Hình 2: Khảo sát nồng độ mồi Khảo sát nồng độ mẫu dò Taqman 200 nM nồng độ mẫu dò tối ưu với E% 100,0% R2 ≥ 0,99 Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 185 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Hình 5: Đường cong khuếch đại thể độ lập lại lần thí nghiệm Đường chuẩn Hình 3: Khảo sát nồng độ mẫu dò Độ lặp lại phản ứng Real-time PCR: Độ lập lại phản ứng (intraassay) Trị số trung bình hai nồng độ pha loãng 10 10-3 18,14 27,08 -1 Kết giá trị virus trung bình sau lần thử nghiệm 2,73 × 102 copies/ml, khác biệt không đáng kể so với giá trị lý thuyết 0,27 × 102 copies/ml đường chuẩn mà chúng tơi xây dựng có R2 0,999 E% 100% hệ số góc -3,58 Hình 6: Đường chuẩn Độ nhạy phản ứng Độ nhạy phản ứng Real-time PCR 100 copies/ml Hình 4: Đường cong khuếch đại thể độ lập lại phản ứng Độ lập lại lần thí nghiệm (interassay) Kết trị số trung bình hai nồng độ pha loãng 10-1 10-3 18,38 26,61 Hình 7: Kết khảo sát độ nhạy phản ứng 186 Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 BÀN LUẬN Phân tích kỹ thuật Nhiệt độ bắt cặp mồi Với phổ nhiệt độ từ 59 – 61oC, nhận thấy chu kỳ ngưỡng sản phẩm khuếch đại tất nhiệt độ khảo sát khơng có khác biệt đáng kể Tuy nhiên, nhiệt độ 60oC sản phẩm khuếch đại có tín hiệu huỳnh quang cao so với tín hiệu huỳnh quang sản phẩm khuếch đại nhiệt độ khác Vì vậy, chúng tơi chọn nhiệt độ 60oC nhiệt độ bắt cặp thích hợp Kết phù hợp với nghiên cứu trước đó(10,13) Khảo sát nồng độ mồi Kết cho thấy nồng độ mồi 400 nM E% R2 nằm giới hạn tối ưu phản ứng Kết hồn tồn phù hợp với nghiên cứu trước đó(10) Như 400 nM nồng độ mồi tối ưu Nghiên cứu Y học Ở nghiên cứu này, đường chuẩn mà chúng tơi xây dựng có R2 0,999 E% 100% hệ số gốc -3,58 Độ nhạy phản ứng Độ nhạy phản ứng Real-time PCR 100 copies/ml, phản ứng cho tín hiệu tốt nồng độ 50 copies/ml tín hiệu thấp 10 copies/ml, phản ứng khơng có tín hiệu ghi nhận Chất lượng xét nghiệm Test Wilcoxon cho thấy khơng có khác biệt thống kê kết hai kỹ thuật Bên cạnh đó, test phi tham số Spearman cho thấy có mối tương quan kỹ thuật Real-time PCR mơn Hóa Sinh – Sinh Học Phân Tử trường ĐHYKPNT BVĐHYD TpHCM Khảo sát nồng độ mẫu dò Taqman Chúng tơi nhận thấy với nồng độ mẫu dò khác cho sản phẩm khuếch đại với chu kỳ ngưỡng tương tự nhau, với nồng độ mẫu dò 200 nM với E% 100,0% R2 ≥ 0,99 Như vậy, 200 nM nồng độ mẫu dò tối ưu cho phản ứng Real-time PCR Độ lặp lại phản ứng Real-time PCR Khoảng biến thiên giá trị trung bình khơng q Ct, chứng tỏ phản ứng Real-time PCR chúng tơi có tính lập lại cao Đường chuẩn Việc sử dụng biological standard để tạo đường chuẩn có lợi điểm so với dùng gam đường chuẩn thương mai thị trường: - Rẻ tiền, sản xuất số lượng lớn - Dễ lưu trữ, dễ chuẩn bị - Chủ động khoảng cách nồng độ, không bị giới hạn - Có thể sử dụng hóa chất hãng khác Hình 8: Biểu đồ Bland Altman Hơn nữa, biểu đồ Bland Altman cho biết kết định lượng BVĐHYD theo log10 copies/ml thấp 0,074 cao 0,052 so với kết môn Áp dụng vào lâm sàng, thấy chênh hai kết không 10 copies/ml Kế đến, chúng tơi thấy trung bình khác biệt gần giá trị 0, phương trình y = b + ax có hệ số a b gần với giá trị 0, nên khác biệt kết hai kỹ thuật gần không đáng kể Vậy hai kỹ thuật thay cho Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 187 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Tóm lại, kết kể chứng tỏ có tương đồng mặt kỹ thuật xét nghiệm Realtime PCR mơn Hóa Sinh – Sinh Học Phân Tử trường ĐHYKPNT BVĐHYD TpHCM KẾT LUẬN Định lượng nồng độ HBV – DNA máu thông số sinh học quan trọng cần thiết để đánh giá tình trạng nhiễm HBV, tiên liệu chiều hướng phát triển bệnh sở để bác sĩ lâm sàng định đánh giá hiệu điều trị Nghiên cứu đạt kết sau: Điều kiện tối ưu cho kỹ thuật Real-time PCR: Tuy nhiên nghiên cứu tránh khỏi hạn chế thời gian tiến hành tương đối ngắn tài khơng đủ nên số lượng mẫu chưa đủ lớn Chúng hy vọng thời gian tới có đề tài tiếp tục đánh giá số lượng mẫu lớn so sánh với phương pháp định lượng khác, ứng dụng Real-time PCR việc theo dõi hiệu điều trị bệnh nhân bị viêm gan B, ứng dụng đường chuẩn tự dựng với Kit khác giúp giảm giá thành xét nghiệm TÀI LIỆU THAM KHẢO - Nhiệt độ bắt cặp mồi 600C - Nồng độ mồi 400 nM - Nồng độ mẫu dò Taqman 100 nM - Độ nhạy phản ứng 100 copies/ml - Kiểm tra đường chuẩn thiết lập có R ≥ 0,99 E% 100% hệ số góc -3,58 đạt chuẩn với cặp mồi lựa chọn đặc hiệu cho virus viêm gan B - Bên cạnh đó, có 34 trường hợp tổng số 46 người đến xét nghiệm, phát có virus viêm gan B định lượng số lượng DNA đích ban đầu có thể - Chất lượng kỹ thuật tương đồng với bệnh viện ĐHYD TpHCM Real-time PCR kỹ thuật sinh học phân tử ngày áp dụng rộng rãi lĩnh vực nghiên cứu điều trị Qua nghiên cứu này, thiết lập kỹ thuật Real-time PCR dùng để định lượng HBV – DNA với đường chuẩn tự dựng mơn Hóa Sinh – Sinh Học Phân Tử trường ĐHYKPNT Qua đó, mơn tiến hành làm thường quy xét nghiệm phát hiện, điều trị theo dõi bệnh nhân viêm gan B Chúng hy vọng kỹ thuật công cụ hỗ trợ cho nghiên cứu 188 10 11 12 13 AASLD "American Association for the Study of Liver Diseases" Available from: http://www.aasld.org/about/Pages/who.aspx Bland J M, Altman D G (1995): "Comparing methods of measurement: why plotting difference against standard method is misleading Lancet" 346(8982):1085-7 Bland J M, Altman D G (1986): "Statistical methods for assessing agreement between two methods of clinical measurement Lancet".1(8476):307-10 Bustin S A (2002): "Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems J Mol Endocrinol".29(1):23-39 Đỗ Đình Hồ, Đỗ Như Hiền (2006): "Giáo trình Sinh Học Phân Tử (trường Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch)" Gurtsevitch V E (2008): "Human oncogenic viruses: hepatitis B and hepatitis C viruses and their role in hepatocarcinogenesis Biochemistry (Mosc)" 73(5):504-13 Hendricks D A, Stowe B J, Hoo B S, Kolberg J, Irvine B D, Neuwald P D, et al (1995): "Quantitation of HBV DNA in human serum using a branched DNA (bDNA) signal amplification assay Am J Clin Pathol" 104(5):537-46 Huy T T, Ushijima H, Win K M, Luengrojanakul P, Shrestha P K, Zhong Z H, et al (2003): "High prevalence of hepatitis B virus pre-s mutant in countries where it is endemic and its relationship with genotype and chronicity J Clin Microbiol".41(12):5449-55 Konnick E Q, Erali M, Ashwood E R, Hillyard D R (2005): "Evaluation of the COBAS amplicor HBV monitor assay and comparison with the ultrasensitive HBV hybrid capture assay for quantification of hepatitis B virus DNA J Clin Microbiol" 43(2):596-603 Ngơ Như Hòa, Lê Trường Giang (1997): "Thống Kê Y Học" Pas S D, Fries E, De Man R A, Osterhaus A D, Niesters H G (2000): "Development of a quantitative real-time detection assay for hepatitis B virus DNA and comparison with two commercial assays J Clin Microbiol".38(8):2897-901 Pawlotsky J M (2003): "Hepatitis B virus (HBV) DNA assays (methods and practical use) and viral kinetics J Hepatol" 39 Suppl 1:S31-5 Payungporn S, Tangkijvanich P, Jantaradsamee P, Theamboonlers A, Poovorawan Y (2004): "Simultaneous quantitation and genotyping of hepatitis B virus by real-time PCR and melting curve analysis J Virol Methods".120(2):131-40 Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 14 15 Phạm Hùng Vân (2009): "PCR Real-time PCR Các vấn đề áp dụng thường gặp" Sitnik R, Paes A, Mangueira C P, Pinho J R (2010): "A real-time quantitative assay for hepatitis B DNA virus (HBV) developed to detect all HBV genotypes Rev Inst Med Trop Sao Paulo".52(3):119-24 16 17 Nghiên cứu Y học WHO World Health Organization Available from: http://www.who.int/immunization_delivery/new_vaccines/hepb /en/index.html Zhao J R, Bai Y J, Zhang Q H, Wan Y, Li D, Yan X J.(2005): "Detection of hepatitis B virus DNA by real-time PCR using TaqMan-MGB probe technology World J Gastroenterol" 11(4):508-10 Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 189 ... lâm sàng nhiễm virus viêm gan B chủ yếu dựa phát kháng nguyên (HBsAg, HBeAg), kháng thể (anti HBs, anti HBc anti HBe) kỹ thuật ELISA chất liệu di truyền virus (HBV – DNA) dựa kỹ thuật sinh học... người đến xét nghiệm, phát có virus viêm gan B định lượng số lượng DNA đích ban đầu có thể - Chất lượng kỹ thuật tương đồng với b nh viện ĐHYD TpHCM Real-time PCR kỹ thuật sinh học phân tử ngày... ngưng điều trị Mục đích nghiên cứu b ớc đầu thiết lập phương pháp định lượng HBV – DNA tảng ứng dụng kỹ thuật Real-time PCR phát vùng pre-S 89bp(6,8) với đường chuẩn tự Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm