Nghiên cứu được tiến hành với mục tiêu nhằm đánh giá bước đầu áp dụng kỹ thuật multiplex PCR tìm đột biến mất đoạn trên vùng AZF của nhiễm sắc thể y ở một số bệnh nhân nam vô sinh vô căn. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học BƯỚC ĐẦU ÁP DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR TÌM ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN TRÊN VÙNG AZF CỦA NHIỄM SẮC THỂ Y Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN NAM VÔ SINH VƠ CĂN Nguyễn Minh Hà* TĨM TẮT Mở đầu: Đột biến đoạn vùng AZF nhiễm sắc thể Y nguyên nhân gây vô sinh chiếm tỷ lệ khơng nhỏ mà phát Phòng xét nghiệm Bộ mơn Hóa Sinh – Sinh học phân tử Trường Đại Học Y khoa Phạm Ngọc Thạch hoàn thiện số điều kiện kỹ thuật xét nghiệm Mục tiêu: Bước đầu áp dụng kỹ thuật Multiplex PCR để tìm đột biến đoạn vùng AZF cho số bệnh nhân nam vô sinh Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Bệnh nhân nam vô sinh vô căn, người Việt Nam (hoặc gốc Việt Nam) DNA gen ly trích từ bạch cầu chạy phản ứng Multiplex PCR lúc, phản ứng khuếch đại đoạn DNA đích Các cặp mồi sử dụng phát 95% trường hợp đoạn vùng AZF Chứng nam, chứng nữ chứng nước chạy song song với mẫu DNA bệnh nhân Kết quả: Áp dụng kỹ thuật xét nghiệm 70 bệnh nhân nam vô sinh thỏa tiêu chuẩn chọn mẫu tìm bệnh nhân nam đột biến (tỷ lệ 12,8%) trường hợp mang đột biến vùng AZFc, có trường hợp đột biến AZFb Kết luận: Đây xét nghiệm có độ tin cậy tốt, tính ứng dụng cao, tiến hành làm thường quy phòng xét nghiệm nước ta để chẩn đốn, tiên lượng phòng ngừa cho bệnh nhân nam vơ sinh Từ khóa : Multiplex PCR, AZF (azoospermia factor) ABSTRACT INITIAL APPLYING OF MULTIPLEX PCR TECHNIQUE TO DETECT AZF MICRODELETION OF Y CHROMOSOME IN IDIOPATHIC INFERTILE MEN Nguyen Minh Ha * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 217 - 219 Background: The AZF microdeletion of Y chromosome is a frequently infertile cause that can be detected now The laboratory of Biochemistry and Molecular biology Department-Pham Ngoc Thach Medical University has optimized some technical conditions of this test Objectives: Initial applying Multiplex PCR technique to detect AZF microdeletion of Y chromosome in some idiopathic infertile men Method: Vietnamese idiopathic infertile male patients Genomic DNA is extracted and purified from leucocytes and is run two multiplex PCR Each PCR amplifies five target sequences The primers detect 95% of AZF microdeletion cases Male, female and blank control are run at same time with each DNA sample Results: Detection of microdeletion cases in 70 idiopathic infertile males (12.8%) patientss have the AZFc microdeletion and only patient has AZFb microdeletion Conclusion: The test is reliable and high applicable As the results that we can run it routinely at our laboratories for diagnosis, prognosis and prevention for infertile male patients Keywords: Multiplex PCR, AZF (azoospermia factor) ∗ Đại học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS Nguyễn Minh Hà ĐT: 0989001581 Chuyên Đề Ngoại Khoa Email: drnguyenminhha@yahoo.com 217 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 ĐẶT VẤN ĐỀ Đột biến đoạn vùng AZF nhiễm sắc thể Y xác định có liên quan đến tình trạng rối loạn sinh tinh gián đoạn trưởng thành tinh trùng Trước chưa có kỹ thuật phát thường quy loại đột biến cho bệnh nhân nam đến khám khoa Hiếm muộn Nam khoa Bên cạnh đó, theo số nghiên cứu Châu Á, tần suất đột biến khoảng 8-10% (trong quần thể bệnh nhân nam vơ sinh vơ căn)(1,2,3,6,7) Vì vậy, nguyên nhân gây vô sinh chiếm tỷ lệ không nhỏ mà phát Phòng xét nghiệm Bộ mơn Hóa Sinh – Sinh học phân tử Trường Đại Học Y khoa Phạm Ngọc Thạch hoàn thiện số điều kiện kỹ thuật xét nghiệm Do đó, trước áp dụng thường quy phòng xét nghiệm nước ta, chúng tơi tiến hành kỹ thuật Multiplex PCR để tìm đột biến đoạn vùng AZF cho số bệnh nhân nam vô sinh ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Bệnh nhân nam người Việt Nam (hoặc gốc Việt Nam), bị vơ sinh vơ căn, chẩn đốn khoa Hiếm Muộn BV Từ Dũ Tiêu chuẩn chẩn đoán: bệnh nhân bình thường lâm sàng nhiễm sắc thể đồ (46,XX), chẩn đốn vơ sinh dựa tiền (vợ chồng độ tuổi sinh sản sau năm (vợ < 35 tuổi) tháng (vợ ≥ 35 tuổi) chung sống thực sự, không áp dụng biện pháp tránh thai mà khơng thể có thai sinh con) tinh dịch đồ (không thỏa tiêu chuẩn bình thường tinh dịch đồ Tinh dịch đồ thực hai lần cách tuần với thời gian kiêng xuất tinh trước thử từ đến ngày Mẫu tinh dịch hướng dẫn lấy quy cách tiến hành đánh giá Phòng Xét Nghiệm Tinh Trùng (Khoa Hiếm Muộn BV Từ Dũ) theo tiêu chuẩn WHO năm 1999 Bệnh nhân gửi đến Phòng xét nghiệm Bộ mơn Hóa Sinh – Sinh học phân tử Trường Đại Học Y khoa Phạm Ngọc Thạch để làm xét nghiệm 3mL máu ngoại biên chống đơng 218 EDTA Ly trích DNA gen từ tế bào bạch cầu với tỷ số tinh khiết từ 1,8 – 2,0 Mỗi mẫu DNA chạy phản ứng Multiplex PCR lúc, phản ứng khuếch đại đoạn DNA đích (gồm đoạn gen ZFY, SRY chứng nội đoạn gen thuộc vùng AZFa, b, c) Các cặp mồi sử dụng phát 95% trường hợp đoạn vùng AZF Chứng nam, chứng nữ (DNA người nam người nữ bình thường) chứng nước chạy song song với mẫu DNA bệnh nhân Nồng độ phản ứng Mg2+ 6,5mM, mồi 2µmol loại dNTPs 0,3mM Lượng DNA sử dụng 200ng/phản ứng Chu kỳ nhiệt phản ứng 950C 6’ , 940C 30’’ , 550C 30’’, 720C 60’’ , 35 chu kỳ, 720C 10’ Chạy điện di 100V , 40 phút , gel agarose 2,5% , chất phát quang ethidium bromide, thước đo 100 đôi base Đọc kết đèn UV chụp hình lưu lại Bảng 1: Các đoạn gen khuếch đại phần phản ứng Đoạn khuếch đại Phản ứng Phản ứng ZFY ( chứng) SRY (chứng) sY86 ( AZFa) sY127 ( AZFb) sY254 (AZFc) ZFY ( chứng) SRY (chứng) sY84 ( AZFa) sY134 ( AZFb) sY255 (AZFc) Kích thước (đơi base) 495 472 320 274 380 495 472 326 301 126 KẾT QUẢ Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật xét nghiệm 70 bệnh nhân nam vô sinh thỏa tiêu chuẩn chọn mẫu tìm bệnh nhân nam đột biến (tỷ lệ 12,8%) trường hợp mang đột biến vùng AZFc, có trường hợp đột biến AZFb Bảng 2: ZFY SRY 495 bp 472 bp ZFY SRY 495 bp 472 bp Chuyên Đề Ngoại Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 sY86 (AZFa) sY127 (AZFb) sY254 (AZFc) 320 bp 274 bp 380 bp sY84 ( AZFa) sY134 (AZFb) sY255 (AZFc) 326 bp 301 bp 126 bp Hình 1: Kết xét nghiệm DNA bệnh nhân M: thước đo 100 đôi base – Giếng 1: DNA bệnh nhân không đoạn - Giếng 2: DNA bệnh nhân đoạn AZFc - Giếng 3: DNA bệnh nhân đoạn AZFb Giếng 4: chứng nam – Giếng 5: chứng nữ - Giếng: nước cất Ở hình 1, giếng số 1, DNA bệnh nhân có đủ vạch tương ứng đoạn khuếch đại phản ứng, bệnh nhân không bị đột biến Ở giếng số 2, DNA bệnh nhân vạch vị trí khoảng 380 đơi base (tương ứng sY254 AZFc) phản ứng vạch vị trí khoảng 126 đơi base (tương ứng sY255 AZFc) phản ứng Do bệnh nhân bị đoạn AZFc Ở giếng số 3, DNA bệnh nhân vạch vị trí khoảng 274 đôi base (tương ứng sY127 AZFb) phản ứng vạch vị trí khoảng 301 đơi base (tương ứng sY134 AZFb) phản ứng Do bệnh nhân bị đột biến AZFb Chuyên Đề Ngoại Khoa Nghiên cứu Y học KẾT LUẬN Nghiên cứu áp dụng thành công kỹ thuật Multiplex PCR để tìm đột biến đoạn cho 70 bệnh nhân nam vơ sinh vơ tìm trường hợp đột biến (8 trường hợp đoạn vùng AZFc, trường hợp đoạn vùng AZFb) Với kết trên, chúng tơi nhận thấy xét nghiệm có độ tin cậy tốt, tính ứng dụng cao, tiến hành làm thường quy phòng xét nghiệm nước ta để chẩn đốn, tiên lượng phòng ngừa cho bệnh nhân nam vô sinh Chúng hy vọng kỹ thuật đón nhận bác sỹ khoa Hiếm Muộn Nam khoa, hỗ trợ cho nghiên cứu xác định nguyên nhân di truyền vô sinh nam TÀI LIỆU THAM KHẢO Carvalho C.M., Zuccherato L.W et al (2006) Study of AZFc partial deletion gr/gr in fertile and infertile Japanese males J Hum Genet 51 : 794-799 Chiang H.S., Yeh S.D., Wu C.C et al (2004) Clinical and pathological correlation of the microdeletion of Y chromosome for 334 patients with azoospermia and severe oligoasthenospermia Asian J Androl : 369 – 375 Dada R., Gupta N P and Kucheria K (2007) Molecular screening for Yq microdeletion in men with idiopathic oligozoospermia and azoospermia ; J Biosci 28: 163 – 168 Simoni M., Bakker E., Krausz C (2004) EAA/EMQN best practice giudelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions State of the art 2004 Int J Andro 27:240-249 WHO (1999) WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction ( 14th edition) Yang Y., Zhang S.Z et al (2003) Studies on molecular epidemiology of Y chromosome azoospermia factor microdeletions in Chinese patients with idiopathic azoospermia or severe oligozoospermia Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi.5 : 385 – 389 Yung-Ming L., Ying-Hung L., Yen-Ni T et al (2008) Genebased creening for Y chromosome deletions in Taiwanese men presenting with spermatogenic failure Fertil Steril 77 : 897 – 903 219 ... cơng kỹ thuật Multiplex PCR để tìm đột biến đoạn cho 70 bệnh nhân nam vô sinh vơ tìm trường hợp đột biến (8 trường hợp đoạn vùng AZFc, trường hợp đoạn vùng AZFb) Với kết trên, chúng tơi nhận th y. .. Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật xét nghiệm 70 bệnh nhân nam vô sinh thỏa tiêu chuẩn chọn mẫu tìm bệnh nhân nam đột biến (tỷ lệ 12,8%) trường hợp mang đột biến vùng AZFc, có trường hợp đột biến AZFb Bảng... điều kiện kỹ thuật xét nghiệm Do đó, trước áp dụng thường quy phòng xét nghiệm nước ta, chúng tơi tiến hành kỹ thuật Multiplex PCR để tìm đột biến đoạn vùng AZF cho số bệnh nhân nam vô sinh ĐỐI