23 118 — KŸ -THU/\T TẠP CHÍ KHOA H ỌC TRƯỜNGKHOA ĐẠI HỌCHOC MỞ TP.HCM SỐ (1) 2011 Ú7$G DȘNG Kİ THUĄT RF.ALTIME PCR TRONG XAC DțNH KIÈU GF.N CÚT A VIRUS GÂY VIÊM GAN, SIÊL VI B T@I 13ĂK LAK TC)MTÄT j\ąo p@¿ Vić-m gait B mot benh gàj but virus viêm gan B có the la cap tính lio}ac man tính Nhich sieii vi viêm gan B l nguvờn nhn hng dõu cựa bỗuli v iêm gan mari tính trén tồn the giói nhíìng npgirćii nhiem viêiv gan B mąn tính rat có nguy c‹ phát trien ung thin gan (ung thir bièu mo te bào gan) N oài ra, ' lrus vićm Can O cung a n O u y’ćn nhân hành dău pây bcnh xrr gan Dt,ra x’ào mùc tèng done vc trình ty nuclcotidc, ngi tn xcp HBV ’żu S kieu gen (genotype) khác (kí hieu tù den H) › ói sq khác trćn 8° ctia tồn bơ bÿ t en H l3V [ 1, 2] sy hân ho cóa cac kieu t'JO nirńc tây bac chan Áu, plc ía nani Sahara Án Mÿ, ti ong klii k icu ten ł5 v C 24 119 TẠP CHÍ KHOA HTAP ỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞSO TP.HCM - SỐ-62011 (1) 2011 CHI KHOA HOC (19) thućmg giap ị niróc tćing nain châu Á, M*ot nghiün c Btu úkhác Nhài ban thțrc Nhat bàn nwóc ó F hái bình diro ng, hien trćn 585 benh nhàn vićm gan mșn cûng kieu gen D thirćrngú gäp noóc x ùng Dia Chí ranu nhù'ng ngaci nhicni kieu gcn t3 c‹› trung hài, kieu gen E thiròng päp ò môt so SJ ticFl trien sand xø Can chàm h(m kicu ten C n i r ó c t ą i c h ä u P h i v k i ê u g e n Ł “ thirćmg diroc glii nhcan tai mot so niróc ị trung nam chàu Mÿ k i e u [4] Trên the giói, nhiìm nđir gan dàv dã có nhíeu cơng bo ve kieu gen iroi ttrond quan giíia kieu gen vói mù’c tran cùa bcnh K ieu gen nhiem dircc cho gan mát thiet vúi tình trang âm țv cùa ł›enh (thông qua v icc dúnh giá hai chi tiêu i-łDcAg, HBe kg); quú trình benh sinh cùa gan st tron cùa v’irus HBV khị i thong micn ddich, sp dip ćmg thuoc dieu tri ›'à kháng thuoc dieu tri virus [4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13] Marc näng cua hcnh cûng nhtr st lien trićn sang vićm gan ß mșn tính nghićn cćtu cho thay cú sir giony ô kieu gon B ’à C "Theo tịc gia Akutn N cơng •v’ 4] st tien triên sang x‹r Can ung thin Can trćn bcnh nhân nhicm HBV chiem tí 1e 6?›"'‹› doi 'úi y e n C s n ngan høn dü tái bán ‹? \røùc cao, ’ I º « ó k i e u g u n D v c ú n y t h e u t c g i n ày thỡ ti Tokyo trony S7 tri/ũng hỗrp vim gan ò cap kieu gon A chiem 22,ß%, R chiem 14% C 43.9" » , D xà I' chí chiem l,8'Z« dú có 15,8'% khơng xäc dinh diroc kieu gen; 1077 triròng hop v iêm gan B mąn tính kiêu gen C chiem mot ti le rat cao b7,7' » tiêp theo B vói 9.4% cịn A lä 1,9' «, kiću gen D ›'à F chí chiêm tì.2*/», có tì,60đ khơng x/ac dinh dapc kieu gen t?iìng theo tác già bicn chiïns nans ' rćn benh nhân vićm gan mąn th iròng hay gãp trćn cśc bcnh nhún many HBC kieu gon B va C, dăc biet xo gan ung the gan gap írên benh nhûn many HBV kiêu ycn Ü hrm kièu gon B M jot n*hićn cùu khác cúa Xin Ding tąi Trung quoc kiću gen C chìem tí lc cao nhat lên den 50% kieu gen cõn ląi lân ltrpt là: kieu gen A (3%), kieu uen B (5,5%), kieu gen D (0,5' «) kieu gcn B C lù 4,4'% 3,3 %› k h ô n g x f i c ! n h d i r o c k i c u g o n [ l ] TẠP CHÍ KHOA H ỌC TRƯỜNG HỌC - SỐ (1) 2011 KHOAĐẠI HOC —MỞ KŸ TP.HCM THUAT benh nhân ò My dã thong kê kieu gen A liên quan vói str ton tąi cùa HBeAg hcrn kieu gen B D, kieu gen A, C D liên quan den tình trąng phân hùy te bào gan hon kieu gen B [I ß] Moi lièn quan giđa nong HBV DNA kieu gen ò nghiên cúu khác cûng cho thay có ket quà trái ngupc Mot nghiên cúu chi ning nong HBV DNA máu cao ị ngũi nhiem kiêu gen C hon B [8] Mot nghiên cùu khác 694 benh nhàn giai doin III dieu tri big adefovir dipivoxil cho thay nong HBV DNA cao hon ó nhđng ngũi nhiem kieu gen C (lúc chí so HBeAg dirong tính) Ngtrpc lai, ị nhEng benh nhân HBeAg âm tính, nơng HBV DNA ó nhúng ngi nhiem kiêu gen D cao hon [4] Ngupc ląi, moot so hoi cùu [15, 21] thi ląi that bąi viec chúng minh sq ttrcmg quan giĞa nong HBV DNA cäc kieu gen niiiÈm Nghiên cùu fì94 benh nhân ị My cüng khơng cho thây có st khác biet giíia nong HBV DNA kieu gen A, B, C D [18] Ó châu Á, sir liru hành cùa HBeAg ị nhíinß ngirịi Flhiem kieu gen C cao hort kieu gen B [l 5, 18, 21, 22] Các nghièn ciïu năy chi str liru hành HHeAg huyet xày sóm ị miïc cao doi vói benh nhân nhiem kieu gen B Trong nc, chí có mot vài cơng bo rài rńc ve tính hình nhiêm HBV str phân bo kieu gen: tác già Dơng T H A cong str (2003) phân tích kiêu gen HBV bang ki thu*at lviultiplex PCR Nghiên cùu diroc thirc hien trèn nhíing bê.nh nhân nhiem siêu vi vièm gan B man [23] Ngoài ra, tác già Ho T D v cong sỗr (2005) (trớch tự nguon http://u ww drthuthuy.com/reseach/HBVGenotype.htm1) công bo xác d|nh kieu gen 122 trirịng hip nhiem HBV mąn tính Kí thuat xác diinh kiêu gen mà tác già sù dung PCR ket hip giái trình tir Trong nghiên cúu này, chúng tơi sù dung bio kít xác dınh kieu gen HBV băng kỵ thueat 25 120 Realtime-PCR cùa cơng ty Co phân & Dich vu Viet  Tên thtrong mąi cùa bo kít HBV Genotype PCR plus Kit (VA.A.02-tl01E) Diem diac’trimg cùa bo kít VA.A.02-001 E łà: trình tu' gen muc tiêu cho phàn ú'ng realtime PCR vùng gen S b*o gen HBV C'ap moi sù dung cho phép nhân bàn moi k ieu gon dã xác 6!• h cùa virus (moi bào ton — consensus primer) måu dù (TaqMan probe) Probe A, B, C bat diac hieu cho lan 1irỗl tiùnò kieu gen A, B C 6vpc thiet ke bên doąn trình ter nam giỵia hai moi Chat dánh den hnh quang FAM chat dmap tat tín hieu h uynh quang (quencher) B HQ Moi kieu gen A, B, C dir‹yc phát hien riêng biet tüng iuicrotube khác (phàn iìng singleplex realtime PCR) NGUYÊN LIEU VÀ PHU‘€ÏNG PHÁP Thu thap birth phóm só her.• 100 mau benh pham huyet dirpc thu tąi phòng khám: 46A Phan Chti Frinh, 10 Ybih aleo (phịng khám Hồn háo) dã dirpc xác dinh nhiêm HBV bank kì thu*at Realtime-PCR Thịi gian thu mau tü tháng 03/2009 den tháng 09/2010 Cńc s‹a licu ve giói tính, tuoi benh nhân, nong IJBV DNA nhiem máu (ghi nhàn tąi thdi dićin thu man), c1i i so kháng nguyên II BeAg kháng thê anti HBeAg diroc thu nhân Tóch chief acid iiucleic DNA tiï mau huyet benh nhûn diroc ly trich bang phirøng pháp sù’ dung phenol/chloroform, phóng theo phti«ng plấp cùa Chomczynski & Sacchi (1957): 2/âtl ml huyet daoc thêm vào 900 mI I rizol, pHb Acid nucleic sau dó diroc iüa b‹ăng lsopropanol vói chat try tùa Glycol3lue Acid nucleic thu diroc sau tùa diroc HaiỴi trend dung dıch TE lX (Tris-F.DTA) bå• 'iuăn ị -20*C Pliàn úng dirqc thirc hićn trén măy Mxpro-Mx3005P (Stratagene) vc i chti‘ong trình nhiet bao gom 95"C- 5’ t I chu kj ' › 40 26 121 TẠP CHÍ KHOA HTĄP ỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞSÖ TP.HCM - SỐ 6- (1) 2011 CHI KHOA HOC (19) 201l chu kÿ leap ląi vói 950C- 15”, 60’C- ’ The tích Do thi bieu th¡ ị hình bieu dien ket q hon h9p phàn ring PCR realtime 50 p1 bao xác dinh kieu gen man so 3, man nhiem gom: 1• dung dich dem PCR, 100 nmo1/L moi kieu gen B, vói tín hieu huynh quang wit mau dõ, 400 Mmol/L moi loąi dATP, dGTP, tín hieu nen truòng h9p tube chùa mau dCTP dTTP, 1.5 units hot-start Taq DNA dị ProbeB Doi vói hai trng h9p man dò polymerase, mmol/L MgCl2 kieu gen cüa ProbeA ProbeC, tín hieu huÿnh quang thap HBV duac xác dinh ba phán úng hon tin hieu nen: mau âm tính vói kiêu gen chúa day dù moi mau dò diac hieu cho A C mơi kiêu gen A, B C Hình Ket quă xác djnh kieu gen bang Xu łÿ thing ia realtime PCR man benh pham so 11 Phan SPSS for Win, Ver 7.5 duac * sù dung ‘”" ” KÉT QUÁ TI le kiln gen HBV nhiem Qua khào sát trèn 100 benh nhân nhiem HBV khám dieu tri tąi cp sò y te tinh Oak Lak, thu dirqc tÿ le kieu gen cùa virus gây viêm gan siêu vi B (HBV) dupc trinh bày ò bàng Do th| bieu thi ị hình bieu dien ket q xác djnh kiêu gen mau so 11, mau nhiêm Bäng Try le kieu gen cùa HBV kièu gen C, vói tín hiêu huynh quang vlrqt benh nhân tinh Dak Lak tín hieu nên trng hip tube chúa So lupng màu dị ProbeC Dơi vói hai trng hỗp mõu Ty 1e % p Kieu gen (n 100) dị ProbeA ProbeB, tín hieu huynh quang 1.B 63 63 (l-2) o.0‹ Các sô lieu báng cho thay ti le kieu gen B, C B+C ị doi tuong có duo tuoi 25 den cao hon so vói doi tuong có d tuoi duói bang 25 (p