Ứng dụng Kỹ Thuật Multiplex-PCR Trong Phát Hiện Gen Độc Lực Của E. coli Sản Sinh Độc Tố Shiga (STEC) Phân Lập Từ Phân Bò, Heo Tiêu Chảy Và Thịt Bò

Dịch tễ học

Trong nhiều năm qua, người ta thừa nhận rằng những dòng STEC gây bệnh trên người thuộc các tuýp huyết thanh O:H phổ rộng. Việc phân lập các serotype này thường dựa vào khả năng không lên men sorbitol nên đã góp phần đánh giá quá cao tỉ lệ mắc phải nhóm này so với các serotype khác. Khi một tuýp được phân lập là O157, có lẽ có khuynh hướng bỏ qua tầm quan trọng tiềm năng gây bệnh của các tuýp khác.

Trong khi đó, các serotype STEC không thuộc O157:H7 cũng là nguyên nhân nổi bật gây bệnh cho người. Nguồn lây nhiễm: Nhiều cuộc điều tra dịch tễ đã chứng minh rằng các dòng STEC hiện diện trong đường ruột của nhiều loài vật nuôi như bò, cừu, heo, dê, chó, mèo (Beutin và ctv, 1995) và cả ngựa (Chalmer và ctv, 1997). Do đó, STEC tồn lưu trong gia súc chính là nguồn quan trọng gây bệnh cho người, và nguồn quan trọng nhất là từ trâu bò.

Cụ thể, STEC có thể xâm nhập vào chuỗi sản xuất thực phẩm cho con người từ nguồn gốc vật nuôi, vấy nhiễm thông thường nhất cho thịt là phân hoặc các thành phần trong ruột sau khi hạ thịt (Paton và Paton, 1998). Thời gian bài thải O157 qua phân là 2 – 4 tuần, nhưng khoảng 13% bệnh nhân thải O157 hơn một tháng và triệu chứng bệnh không biểu hiện trong giai đoạn sau.

Chẩn đoán

Truyền lây STEC giữa người và người xảy ra trong các đợt bộc phát bệnh.

Phòng ngừa

Nguyên nhân do ăn phải thịt bò chưa nấu chín hay đã bị vấy nhiễm, do uống sữa tươi hay do truyền lây giữa người và người sau khi đi bơi trong các hồ đã bị nhiễm (USA Department of Agriculture’s Food safety and Inspection Service, 2004). Do đó, người ta thay thế môi trường MacConkey có lactose bằng SMAC chọn lọc chứa 1% sorbitol để phân lập (Smith và Scotland, 1993). Mặc dù không biểu hiện GUD nhưng các serotype O157:H7 vẫn mang đoạn gen uid hoàn chỉnh (gồm cả vùng điều hòa) trên nhiễm sắc thể.

Tóm lại, những đột biến này có thể ảnh hưởng đến khả năng hoạt động của GUD, O157:H7 vẫn sản sinh GUD nhưng GUD bị bất hoạt, không thực hiện chức năng thủy phân của nó được. - Kháng kháng sinh: cefixime, sulfivoxazol, tetracycline, streptomycine và các tác nhân ức chế khác như potassium tellurite (ức chế các VSV thông thường) (Kim và ctv, 1994). - Tính kháng acid (acid resistance - AR) đóng vai trò quan trọng cho khả năng sống sót của vi khuẩn trong môi trường acid.

(1) Hệ thống AR1: chỉ hoạt động khi tế bào tăng trưởng trong môi trường yếm khí với sự vắng mặt của glucose. Ba hệ thống này hoạt động suốt quá trình tăng trưởng ở pha cân bằng (stationery phase) của vi khuẩn.

Kỹ thuật PCR 1. Khái niệm

Số chu kì thường theo kinh nghiệm và có thể trong khoảng 25 – 30 chu kì, tùy theo lượng của mẫu DNA lúc bắt đầu và độ nhạy mong muốn. - Dung dịch đệm: thành phần của dung dịch đệm có thể thay đổi tùy loại enzyme sử dụng, quan trọng nhất là ion Mg2+. Nó hình thành một phức hợp hòa tan với dNTP, rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme polymerase, làm tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm) của DNA mạch đôi.

- Các dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate): là hỗn hợp 4 loại dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA. - Mồi (primer): là những oligonucleotide mạch đơn, có trình tự bổ sung với trình tự base của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA. Các chuỗi primer nên được thiết kế để nhân một đoạn DNA sao cho đạt chiều dài tối hảo là 100 – 1000 bp mặc dù trong vài trường hợp sản phẩm chỉ 10 bp.

Taq không bị phá hủy ở nhiệt độ cao và xúc tác tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng dưới sự hiện diện của Mg2+. Sau khi thực hiện phản ứng PCR, tùy vào mục đích mà người ta sử dụng nhiều kỹ thuật sinh học phân tử khác nhau để phân tích sản phẩm của phản ứng PCR như đọc. Sau khi điện di, các DNA trong gel sẽ hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide, chất này có khả năng gắn xen vào các base của các nucleotide và phát huỳnh quang dưới tác dụng của tia UV.

Và để ước lượng kích thước DNA trên gel, người ta sử dụng một “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử “ (molecular weight marker - MWN) hay còn gọi DNA ladder (thang chuẩn). Cho đến nay, vẫn chưa có nguyên tắc chung hay thành phần chuẩn nào cho việc tối ưu hóa phản ứng multiplex – PCR. Hiện nay, thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phân tử, với nhiều ứng dụng trong sinh học, y khoa, nông nghiệp, khảo cổ, pháp y và hình sự.

Trong nghiên cứu genome, PCR được ứng dụng trong nhân bản vô tính, multiplex PCR, cloning cDNA bằng PCR đảo (inverse PCR), recombinant PCR,. Trong y khoa và thú y, PCR được sử dụng để chẩn đoán các mầm bệnh virus, vi khuẩn, protozoa lẫn ký sinh trùng đa bào. Trong nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm, sử dụng PCR để phát hiện gen halothan, gen thụ thể estrogen, gen thụ thể prolactin … trong công tác chọn giống vật nuôi, phát hiện các vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm : E.

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

Phương pháp thực hiện 1. Vật liệu thí nghiệm cơ bản

Phân tiêu chảy có thể được lấy bằng cách dùng tăm bông, cho vào môi trường chuyên chở Carry Blair, chuyển về phòng thí nghiệm. - Quét bề mặt thịt bò bằng gạc hoặc tăm bông vô trùng, cho vào ống nghiệm chứa sẵn nước pepton đệm. Li trích DNA rồi thực hiện multiplex – PCR để phát hiện các gen độc lực.

Vì vậy, để cải thiện khả năng phát hiện STEC có mang gen độc lực từ thịt, sử dụng môi trường pepton đệm có bổ sung vancomycin và cefixime (PVC) nhằm hạn chế sự cạnh tranh phát triển của những vi khuẩn khác để STEC có cơ hội tăng sinh tốt hơn. Sau khi ủ 370C trong 24h, canh khuẩn này được cấy ria trở lại trên môi trường thạch CT - SMAC để chọn lọc chuyên biệt nhóm STEC. Dùng que cấy chạm nhẹ trên từng khuẩn lạc rời rạc rồi chuyển vào từng ống NA riêng biệt để giữ gốc riêng lẻ.

Thu phần khuẩn lạc còn lại của mỗi nhóm, gom chung vào 1 eppendorf chứa sẵn 0,4 – 0,5 ml nước cất khử ion vô trùng. Sử dụng nghiệm pháp IMViC (FAO, 1992) cho từng khuẩn lạc riêng lẻ thuộc nhóm đó để xác định E. Để yên và hút phần dung dịch ở phía trên làm DNA khuôn mẫu (DNA xét nghiệm).

Thu tất cả phần còn lại của những khuẩn lạc đã chọn theo từng nhóm riêng và mỗi nhóm cho vào mỗi eppendorf chứa sẵn 0,4 - 0,5 ml H2O. Các sản phẩm PCR được xác định bằng cách so với các băng của đối chứng dương và thang ladder 100 bp.