PHAT HIEN MOT SO GEN DOC LUC ECOLI

coli gaây ñoäc taêng sinh maïnh, trôû thaønh nguyeân nhaân quan troïng gaây tieâu chaûy treân ngöôøi vaø gia suùc, ñaëc bieät laø gia suùc non (tieâu chaûy treân beâ ngheù, tieâu chaû[r]

Chương

ĐẶT VẤN ĐỀ

Escherichia coli (E coli) vi khuẩn sống cộng sinh chiếm ưu hệ vi sinh vật đường ruột người động vật Tuy nhiên, có điều kiện thích hợp, số nhóm E coli gây độc tăng sinh mạnh, trở thành nguyên nhân quan trọng gây tiêu chảy người gia súc, đặc biệt gia súc non (tiêu chảy bê nghé, tiêu chảy phân trắng heo theo mẹ, tiêu chảy phù thủng heo cai sữa)

E coli thải qua phân mơi trường bên ngồi Nếu qui trình vệ sinh E coli dễ vấy nhiễm vào thịt tươi, đặc biệt trình giết mổ Từ việc bảo quản chế biến thực phẩm khơng thích hợp ngộ độc thực phẩm E coli hồn tồn xảy Trong số tác nhân gây tiêu chảy người E coli ln tác nhân phổ biến nước công nghiệp phát triển lẫn nước phát triển Do E coli xem vi khuẩn danh ô nhiễm thực phẩm nước đánh giá dựa số lượng chúng

Dựa đặc điểm gây bệnh, E coli được chia thành nhiều nhóm Mỗi nhóm có yếu tố độc lực khác qui định gen độc lực Một số gen độc lực quan trọng E coli gồm: gen stx1, stx2, stx2e, hly nhóm STEC (Shiga toxin-producing E coli); gen eae nhóm STEC EPEC (Enteropathogenic E coli); gen sta, stb, lt-I nhóm ETEC (Enterotoxigenic E coli )…

độc lực E coli là bước cần thiết phục vụ cho việc đánh giá nguy gây bệnh vật nuôi người Các kỹ thuật sinh học phân tử, đặc biệt kỹ thuật PCR thường áp dụng để phát gen độc lực

Cho đến nay, Việt Nam việc xác định E coli là nguyên nhân gây bệnh thường thực kỹ thuật phân lập xác định đặc tính sinh hóa, theo Tiêu chuẩn Việt Nam, đánh giá tình trạng vệ sinh thực phẩm dừng lại mức độ xác định số lượng vi khuẩn, việc phát gen độc lực vi khuẩn chưa quan tâm Hơn việc ứng dụng kỹ thuật multiplex - PCR để phát đồng thời yếu tố độc lực E coli chưa thực Việt Nam Với mục tiêu phát số gen độc lực mã hóa protein gây độc E coli phân lập từ phân thịt bò, heo kỹ thuật multiplex – PCR, hướng dẫn Thầy Nguyễn Ngọc Tuân, tiến hành thực đề tài: “Phát số gen độc lực E coli phân lập từ phân thịt bò, heo kỹ thuật multiplex - PCR”

Bước đầu áp dụng kỹ thuật này, thực khảo sát nhóm đối tượng mẫu phân tiêu chảy, phân bình thường, thịt tươi Đề tài hy vọng trở thành sở để áp dụng kỹ thuật multiplex – PCR việc phát gen độc lực vi khuẩn E coli chẩn đoán bệnh đánh giá tình trạng vệ sinh thực phẩm

Yêu cầu:

- E coli được phân lập định lượng theo qui trình FAO (1992) phân lập định tính mơi trường chọn lọc MacConkey mẫu phân môi trường tăng sinh chọn lọc CT-SMAC (Sorbitol MacConkey với kháng sinh cefixime tellurite potassium) mẫu thịt

- Ly trích DNA từ vi khuẩn E coli phân lập được;

Chương

TỔNG QUAN

2.1 Vi khuẩn E coli

2.1.1 Định nghóa

Vi khuẩn Escherichia coli phân lập mô tả vào năm 1885 nhà nghiên cứu người Đức Theodor Escherich

Theo hệ thống phân loại Bergey, vi khuẩn E coli thuộc họ Enterobacteriaceae, giống Escherichia

E coli trực khuẩn Gram âm, di động, kích thước khoảng – x 0,5 μm, khơng hình thành bào tử có giáp mơ E coli có mặt thường xuyên chiếm ưu ruột người động vật máu nóng, phần cuối ruột non ruột già

2.1.2 Nuoâi cấy đặc điểm sinh hóa

E coli vi khuẩn hiếu khí yếm khí tùy nghi Nhiệt độ thích hợp 35 - 370C, pH thích hợp 6,4 – 7,5 (tối ưu 7,2 – 7,4)

Trong môi trường lỏng, sau – E coli làm đục nhẹ môi trường, để lâu đục, có mùi thối; sau vài ngày có váng mỏng mặt mơi trường

E coli mọc tốt môi trường thạch dinh dưỡng, sau 24 hình thành khuẩn lạc dạng S màu xám trắng, trịn, ướt, bề mặt bóng, kích thước khoảng – mm

Để phân biệt E coli vi khuẩn đường ruột khác, người ta dùng thử nghiệm IMVC E coli cho kết IMVC + + − − (biotype 1) − + − − (biotype 2)

2.1.3 Yếu tố kháng nguyên

E coli có cấu trúc kháng nguyên phức tạp Trước kia, kỹ thuật xác định kháng nguyên bề mặt phương tiện để phân biệt dòng E coli gây bệnh Năm 1947, Kauffmann đưa hệ thống phân nhóm serotype mà sử dụng đến ngày Hệ thống phân nhóm dựa vào việc xác định kháng nguyên bề mặt O, H, K

* Kháng nguyên thân O (somatic antigen): có chất lipopolysaccharide màng tế bào, bền với nhiệt cồn Khi đun nóng 1000C giữ tính kháng nguyên Kháng nguyên O

phát phản ứng ngưng kết Kháng nguyên O giữ vai trò định khả gây bệnh dịng vi khuẩn có tính chất chun biệt cho loài vật chủ Kháng nguyên O tạo tảng cho việc phân loại serogroup E coli Có 170 serogroup kháng nguyên O Trong serogroup có hay nhiều serotype phân loại dựa vào kháng nguyên lông H

* Kháng nguyên lông H (flagellar antigen): có chất protein, tạo nên khả di động E coli, chịu nhiệt Có khoảng 56 type kháng nguyên H

* Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen): Kháng nguyên K lúc đầu xác định phản ứng ngưng kết Người ta xác định có diện kháng nguyên K vi khuẩn vi khuẩn ngưng kết với kháng huyết O bị đun nóng Dựa vào khả chịu nhiệt người ta chia kháng nguyên K thành type A, L B Về sau người ta phân loại kháng nguyên K dựa vào thành phần hóa học chúng có 80 type kháng nguyên K xác định

huyết học Một vài lông bám kháng mannose (ví dụ K88 K89) coi kháng nguyên K Về sau, xác định thành phần hóa học lơng bám có chất protein nên việc xếp chúng vào kháng ngun K khơng cịn phù hợp, chúng xếp vào nhóm kháng nguyên tiêm mao F

* Kháng nguyên tiêm mao F (fimbrial antigen): Tiêm mao (fimbriae) dài khoảng 4μm, đường kính 2,1 – 7,0 nm, dạng thẳng hay xoắn Tiêm mao không tham gia vào di chuyển, ngắn nhiều flagella Tiêm mao giúp vi khuẩn kết dính vào tế bào niêm mao ruột nên quan trọng khả gây bệnh vi khuẩn

Hiện có 700 type kháng nguyên hay serotype E coli từ tổ hợp nhóm kháng nguyên O, H, K, F Tuy nhiên nói chung, E coli ngồi đường ruột khơng có capsul (Jann Jann, 1992), E coli gây tiêu chảy, thường việc xác định serotype kết hợp đặc hiệu kháng nguyên O kháng nguyên H

2.1.4 Phân loại E coli

của E coli (Levine ctv, 1984) Một cư trú thiết lập, việc gây bệnh dòng E coli gây tiêu chảy đa dạng Dựa đặc điểm gây bệnh (gồm đặc tính độc lực, tác động khác lên màng nhầy ruột, hội chứng lâm sàng bệnh khác mặt dịch tễ bệnh), E coli chia thành nhóm chính:

- STEC (Shiga toxin-producing E coli) VTEC (Verotoxigenic E coli) EHEC (Enterohaemorrhagic E coli)

- EPEC (Enteropathogenic E coli) - ETEC (Enterotoxigenic E coli)

- EAggEC hay EAEC (Enteroaggregative E coli) - EIEC (Enteroinvasive E coli)

Có ba chế chung khả gây tiêu chảy E coli: (1) Sản xuất độc tố (ETEC, EAEC, STEC)

(2) Tấn công / xâm lấn (EIEC)

(3) Bám dính, truyền tín hiệu qua màng (EPEC vaø EHEC)

Tuy nhiên, tác động qua lại thể vật chủ màng nhầy ruột đặc hiệu cho loại (Nataro Kaper, 1998)

2.1.5 Shiga toxigenic E coli (STEC)

STEC VTEC hai thuật ngữ tương đương nhau, hai nhóm E coli sản sinh hay nhiều loại độc tố gây độc tế bào Mặc dù cần có gen sản sinh độc tố gây bệnh khơng có yếu tố độc lực khác Những dòng E coli mang gen sinh độc tố diện ruột gia súc khỏe mạnh với số lượng ít, dịng thiếu vài hay tất yếu tố độc lực khác STEC (Beutin ctv, 1994) Do khơng phải tất STEC có khả gây bệnh (Nataro Kaper, 1998)

2.1.5.2 Shiga toxin yếu tố độc lực liên quan đến đặc tính gây bệnh STEC: STEC sản xuất độc tố Shiga-like toxin (Slt), gọi Shiga toxin (Stx) hay Verotoxin (VT) Họ độc tố Stx gồm hai nhóm không phản ứng chéo với Stx1 Stx2 Trong Stx1 có tính bảo tồn cao Stx2 thay đổi trình tự, tạo nhiều subtype Stx2c, Stx2hb, Stx2e (Calderwood ctv, 1996), Stx2g (Leung ctv, 2003) Một dịng STEC sản sinh Stx1, Stx2 Stx1 Stx2, chí nhiều dạng Stx2

Cả hai độc tố Stx1 Stx2 cấu tạo từ tiểu đơn vị B 7,7 kDa tiểu đơn vị A 32 kDa Tiểu đơn vị A gồm peptide A1 28 kDa peptide A2

kDa nối với cầu nối disulfur Peptide A1 có hoạt tính enzyme

peptide A2 có nhiệm vụ gắn kết tiểu đơn vị A vào tiểu đơn vị B Những

tiểu đơn vị B giúp độc tố kết hợp với receptor đặc hiệu Gb3

(globotriaosylceramide) diện bề mặt tế bào eukaryote (Stx2e có receptor Gb4) Sau chuyển vào bên tế bào, tiểu đơn vị A đến

tế bào chất tác động lên tiểu phần 60S ribosome Peptide A1 có hoạt tính

enzyme hoạt động N-glycosidase cắt gốc adenin khỏi rRNA 28S ribosome, gây trở ngại cho tổng hợp protein Do không tổng hợp protein, tế bào bị Stx tác động (tế bào nội mô thận, tế bào biểu mô ruột, tế bào Vero, tế bào Hela hay tế bào có receptor Gb3, receptor

độc lực khác STEC gây hư hại tế bào nhung mao ruột, gây tiêu chảy viêm kết tràng xuất huyết (Haemorrhagic colitis – HC) Sự hư hại tế bào thành mạch máu Stx2e gây nên tượng phù thủng heo Những tổn thương tế bào nội mô thận gây nên hội chứng huyết niệu (Haemolytic uraemic syndrome - HUS) người

Yếu tố bám dính STEC/EHEC chứng minh đóng vai trò quan trọng định vị vi khuẩn ruột Đó intimin, protein màng ngồi có trọng lượng phân tử 94 – 97 kDa Intimin mã hóa gen eae (E coli attaching and effacing). Intimin gây tổn thương dạng bám dính phá hủy (attaching-and-effacing, A/E) ruột già vi khuẩn bám chặt vào tế bào biểu mô (Donnerberg ctv, 1993) Gen eae tìm thấy nhóm EPEC Gen eae gây kiểu tổn thương A/E số gen nằm vùng gây bệnh 35,5 kb (gọi vùng gây hư hại tế bào ruột – locus of enterocyte effacement, LEE) Vùng LEE STEC/EHEC chứa gen mã hóa cho intimin, mã hóa receptor intimin Tir (translocated intimin receptor) số gen khác Vùng LEE không điều kiện cần mà cịn điều kiện đủ cho việc hình thành tổn thương A/E Tuy nhiên tất STEC có gen eae, tất EHEC có gen eae (Nataro Kaper, 1998)

Bệnh tích A/E phụ thuộc vào tương tác protein màng vi khuẩn (intimin) protein Tir Protein Tir tiết khỏi vi khuẩn, chuyển vị vào màng tế bào vật chủ (Paton ctv, 1996)

Yếu tố khác có liên quan đến độc lực STEC việc tạo enterohaemolysin (EHEC-Hly) độc tố ruột chịu nhiệt EAST1

này có diện operon gồm khung đọc mở (open reading frame - ORF) hlyCABD Trong hlyA gen cấu trúc khởi đầu cho haemolysin

Độc tố ruột chịu nhiệt EAST1 (đầu tiên mơ tả nhóm EAEC EAEC heat-stable enterotoxin 1), tìm thấy nhiều dịng STEC Tầm quan trọng EAST1 khả gây bệnh STEC chưa biết, có vài trường hợp tiêu chảy khơng có máu mà thường thấy người nhiễm STEC (Nataro Kaper, 1998)

Hầu hết ổ dịch STEC/EHEC O157:H7, nên người ta cho serotype độc dễ lây truyền serotype khác (Nataro Kaper, 1998) Tuy nhiên có nhiều serotype khác ngồi O157:H7 có liên quan đến HC HUS người Những serotype non-O157 phổ biến liên quan đến bệnh người thuộc O26, O91, O103, O111 (Paton, 1989) Hầu hết tính chất sinh hóa E coli O157:H7 tương tự E coli khác Điểm khác biệt sinh hóa dịng O157:H7 khơng lên men đường sorbitol β-glucuronidase dương tính 93% chủng E coli lên men sorbitol 24 giờ, E coli O157:H7 lại không 93% chủng E coli cho β-glucuronidase dương tính E coli O157:H7 khơng Ngồi mơi trường TSB, O157:H7 phát triển nhanh 30 – 42oC, tăng trưởng khó khăn 43 – 44oC

ngừng tăng trưởng 45oC (dẫn liệu Trần Thanh Phong, 1998)

tuyển lựa để phát nhóm E coli O157 Thường môi trường SMAC SMAC có bổ sung cefixime tellurite (CT-SMAC) (FDA, 2002)

2.1.5.3 Nguồn lây nhiễm: STEC tìm thấy phân nhiều loài động vật trâu bị, cừu, dê, heo, chó mèo (Beutin, 1993; Beutin, 1995; Chapman, 1997) ngựa (Chalmer, 1997) Loài động vật quan trọng việc gây nhiễm cho người trâu bò Đường gây nhiễm chủ yếu STEC vào thực phẩm việc vấy nhiễm chứa vật đường tiêu hóa phân vào thịt q trình giết mổ (Paton, 1998) STEC lây truyền qua người chủ yếu đường thực phẩm, nước từ người qua người Hầu hết trường hợp ăn thực phẩm bị nhiễm, đặc biệt thực phẩm có nguồn gốc động vật, mà thịt bò nguyên nhân chủ yếu (Keskimaki, 2001)

2.1.6 Enteropathogenic E coli (EPEC)

EPEC nhóm E coli gây tiêu chảy quan trọng có liên quan đến tiêu chảy trẻ sơ sinh nước phát triển

hiện diện tất chủng EPEC, EHEC, Clostridium rodentium và Hafnia alvei; không diện dòng E coli thuộc hệ vi khuẩn đường ruột thông thường

Đáp ứng viêm chỗ tăng tính thấm ruột đáp ứng với EPEC góp phần vào tiêu chảy (Nataro Kaper, 1998) Điểm đáng lưu ý mặt dịch tễ học bệnh EPEC phân bố lứa tuổi người bệnh Bệnh chủ yếu xảy trẻ em tuổi Bệnh thường biểu cấp tính với tiêu chảy nghiêm trọng Lý liên quan đến khả đề kháng người trưởng thành trẻ em lớn chưa biết rõ, có lẽ receptor đặc hiệu Tuy nhiên EPEC gây tiêu chảy người lớn số lượng vi khuẩn đủ lớn (Nataro Kaper, 1998)

2.1.7 Enterotoxigenic E coli (ETEC)

2.1.7.1 Các yếu tố độc lực: Nhóm ETEC có hai nhóm định độc lực độc tố ruột (enterotoxin) yếu tố định vị (colonization factor – CF)

Độc tố ruột enterotoxin

Nhóm ETEC gồm E coli tạo hai loại độc tố đường ruột ST LT

ETEC thường xem đại diện chế gây bệnh cách vi khuẩn bám vào bề mặt màng nhầy ruột non tiết độc tố ruột, làm gia tăng tình trạng tiết dịch Nhóm ETEC gây tiêu chảy thơng qua tiết độc tố đường ruột LT ST E coli nhóm tiết độc tố LT, tiết ST, tiết LT ST

2 serogroup LT-I LT-II LT-I LT-II khơng có phản ứng chéo mặt miễn dịch

LT-I tiết dòng E coli gây bệnh người thú Cịn LT-II tìm thấy chủ yếu E coli thú người Về mặt khái niệm, trừ kèm với chữ số la mã tên gọi LT dùng để LT-I (Nataro Kaper, 1998)

- LT-I: LT-I oligopeptide khoảng 86 kDa, cấu tạo tiểu đơn vị A 28 kDa tiểu đơn vị B 11,5 kDa Tiểu đơn vị A chịu trách nhiệm hoạt tính enzym độc tố gồm peptide A1 peptide A2 liên kết

cầu nối disulfur Những tiểu đơn vị B xếp thành vòng nhẫn, liên kết chắn với ganglioside GM1 liên kết lỏng lẻo với GD1b vài glycoprotein ruột

– chúng receptor LT Hai loại LT-I có liên hệ gần phản ứng chéo phần với LTp (LTp-I) phân lập từ heo LTh (LTh-I) phân lập từ người Gen mã hóa cho LT elt hay lt-I nằm plasmid mà plasmid chứa gen mã hóa ST và/hoặc gen mã hóa kháng nguyên yếu tố định vị (colonization factor antigen - CFA)

Sau độc tố vào nội bào, chúng di chuyển tế bào nhờ hệ thống vận chuyển Golgi (Golgi vận chuyển) Đích LT tế bào enzym adenylate cyclase nằm lớp màng ngồi tế bào biểu mơ ruột Peptide A1 có

hoạt tính ADP-ribosyltransferase chuyển phần ADP-ribosyl từ NAD đến protein liên kết GTP (GTP-binding protein) GS, gây hoạt hóa enzyme

adenylate cyclase, làm gia tăng AMP vịng (cAMP) tế bào Vì enzyme cAMP-dependent protein kinase (A kinase) họat hóa dẫn đến phosphoryl hóa kênh chloride (Cl-) màng tế bào biểu mơ vượt q mức bình thường Kết

quả dây chuyền kích thích tế bào bên tiết Cl- ngăn cản hấp thụ

kéo theo di chuyển thụ động nước từ tế bào vào lòng ruột, gây tiêu chảy (Nataro Kaper, 1998)

Mặc dù kích thích Cl- gia tăng lượng cAMP tế bào

cách giải thích cổ điển chế gây tiêu chảy LT CT, ngày có nhiều chứng cho thấy đáp ứng tăng tiết độc tố có chế phức tạp Một chế tác động khác độc tố có liên quan đến prostaglandin E (PGE1 PGE2) yếu tố hoạt hóa tiểu cầu Sự tổng hợp

phóng thích chất chuyển hóa acid arachidonic prostaglandin leukotriene kích thích vận chuyển chất điện giải kích thích nhu động ruột Cơ chế tác động khác thứ hai có liên quan đến hệ thần kinh ruột (enteric nervous system – ENS) điều hòa nhu động tiết ion ruột Cơ chế thứ ba CT LT gây đáp ứng viêm ruột dạng nhẹ

- LT-II: Nhóm LT-II giống với LT-I CT khoảng 55 - 57% tiểu đơn vị A, không giống với LT-I CT tiểu đơn vị B LT-II làm gia tăng cAMP tế bào qua chế tương tự LT-I, LT-II sử dụng GD1 làm receptor thay GM1 Như nói trên, LT-II khơng có liên quan đến bệnh

người thú

- STa: STa peptide gồm 18 -19 amino acid với trọng lượng phân tử khoảng kDa STa chia thành loại STp (ST porcine hay STIa) phân lập heo STh (ST human hay STIb) phân lập người Cả loại độc tố tìm thấy dịng ETEC người

Receptor STa enzyme xuyên màng guanylate cyclase C (GC-C) thuộc họ enzyme receptor cyclase Sự kết hợp STa vào GC-C kích thích hoạt tính GC, dẫn đến việc gia tăng lượng cGMP nội bào Hoạt động cuối dẫn đến kích thích tiết Cl- và/hoặc ngăn cản hấp thụ NaCl, gây

ra tiết chất lỏng ruột

- STb: STb chủ yếu có liên quan đến dòng ETEC phân lập từ heo có báo cáo vài chủng ETEC người sản sinh STb Không STa, STb gây tổn thương mặt mô học lớp biểu mô ruột tế bào nhung mao biểu mô ruột teo nhung mao phần Receptor STb chưa biết rõ gần người ta cho độc tố kết hợp không đặc hiệu với màng tế bào chất trước vào tế bào Không tạo tiết Cl

-như STa, STb kích thích tế bào ruột tiết bicarbonat (HCO3-) STb không làm tăng

cAMP hay cGMP nội bào kích thích tăng lượng calci nội bào từ ngoại bào STb kích thích phóng thích PGE2 serotonin, từ người ta cho

ENS có liên quan đến đáp ứng tiết gây độc tố (Hitotsubashi, 1992)

Yếu tố định vị (colonization factor – CF): Cơ chế mà ETEC kết dính cư trú lớp màng nhầy ruột nghiên cứu kỹ Để gây tiêu chảy, ETEC phải kết dính vào tế bào ruột non nhờ vào lông bề mặt vi khuẩn, gọi yếu tố định vị (CF)

cho độc tố ST và/hoặc LT Tiểu đơn vị cấu trúc lông thường tạo miễn dịch vượt trội tiểu đơn vị có tính kháng ngun mạnh

2.1.7.2 Dịch tễ

Dòng ETEC liên quan đến hội chứng lâm sàng chính: tiêu chảy trẻ em thơi bú nước phát triển tiêu chảy du khách Dịch tễ bệnh ETEC định nhiều yếu tố: (1) miễn dịch màng nhầy nhiễm ETEC khác cá thể, (2) người nhiễm khơng có biểu triệu chứng thải lượng lớn vi khuẩn qua phân, (3) việc nhiễm đạt liều gây nhiễm cao Ba đặc tính tạo nên tình trạng nhiễm ETEC mơi trường vùng có dịch hầu hết trẻ em vùng đương đầu với ETEC thời kỳ bú Trẻ em tuổi đến trường người lớn có nguy tiêu chảy ETEC thấp Dòng ETEC sản sinh ST nguyên nhân hầu hết trường hợp dịch bệnh

Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy thức ăn nước bị ô nhiễm phương tiện chủ yếu gây nhiễm ETEC (Black, 1981) Sự nhiễm ETEC vùng dịch thường tập trung chủ yếu vào tháng ấm ẩm, nhân lên ETEC thực phẩm nước lý tưởng

2.1.7.3 Khía cạnh lâm sàng

Triệu chứng bệnh thường xảy đột ngột với thời gian nung bệnh ngắn (14 – 50 giờ) Bệnh nhân tiêu chảy nước, thường khơng có máu; vài bệnh nhân có tượng sốt ói mữa Tiêu chảy ETEC nhẹ, ngắn tự bớt dần gây tiêu chảy xổ nghiêm trọng giống nhiễm Vibrio cholerae

Hầu hết trường hợp nhiễm ETEC nguy hiểm đến tính mạng xảy trẻ em thơi bú nước phát triển Mặc dù việc sử dụng kháng sinh nhạy cảm làm giảm thời gian mức độ tiêu chảy, thuốc trị có hiệu khơng sẵn có vùng nguy cao; ngồi đề kháng kháng sinh dịng ETEC vấn đề đáng quan tâm Do cần phải lưu ý sở việc chăm sóc bệnh nhân nhiễm ETEC trì đủ lượng nước thể có triệu chứng tiêu chảy

2.1.8 Enteroaggregative E coli (EAEC hay EAggEC)

EAEC hay EaggEC nhóm E coli khơng sinh enterotoxin bám dính vào tế bào Hep-2 theo kiểu bám dính kết tập (aggregative adhesion – A/A) Nhóm EAEC gồm dịng E coli gây bệnh khơng gây bệnh Tất EAEC có plasmid 60 MDa chứa gen tạo tổn thương dạng A/A gen mã hóa cho độc tố ruột chịu nhiệt EAST1 (EAEC heat-stable enterotoxin 1) Vai trò EAST1 tiêu chảy chưa rõ ràng, gen mã hóa A/A plasmid cần thiết cho q trình gây bệnh (Baudry 1990) Ngồi EAEC cịn có yếu tố độc lực khác haemolysin, độc tố yếu tố có liên quan đến q trình bám dính lơng protein màng

2.1.9 Enteroinvasive E coli (EIEC)

Những E coli dòng EIEC thường khơng điển hình đặc tính sinh hóa khó xác định EIEC giống với Shigella mặt kháng ngun, sinh hóa đặc tính gây bệnh Triệu chứng lâm sàng bệnh bao gồm sốt, đau bụng quặn, khó chịu, nhiễm trùng máu tiêu chảy nước hay bệnh lỵ điển hình với máu, dịch nhầy nhiều bạch cầu phân Cả Shigella spp EIEC có khả xâm nhập vào tế bào biểu mô kết tràng chúng tiết hay nhiều độc tố ruột liên quan đến tiêu chảy (Nataro Kaper, 1998) EIEC gây tiêu chảy khách du lịch liên quan đến vụ ngộ độc thực phẩm ăn phải thức ăn bị nhiễm

Tóm lại, số gen độc lực quan trọng nhóm E coli gồm: STT Gen độc lực Nhóm E coli

1 eae EPEC, STEC

2 hly STEC

3 stx1 STEC

4 stx2 STEC

5 stx2e STEC

6 sta ETEC

7 stb ETEC

8 lt-I ETEC

Việc phát gen độc lực E coli thường thực dựa kỹ thuật sinh học phân tử, đặc biệt kỹ thuật PCR

2.2 Kỹ thuật PCR 2.2.1 Nguyên tắc

Tất DNA polymerase hoạt động tổng hợp mạch DNA từ mạch khuôn cần diện mồi chuyên biệt Mồi đoạn DNA ngắn, có khả bắt cặp bổ sung với đầu mạch khuôn, DNA polymerase nối dài mồi để hình thành mạch Các mồi gồm có mồi “xi” (forward primer: mồi tác động lên sợi 3’→ 5’) mồi “ngược” (reverse primer: mồi tác động lên sợi 5’→ 3’)

2.2.2 Các giai đoạn phản ứng PCR

Phản ứng PCR chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp Mỗi chu kỳ gồm bước:

Bước (giai đoạn biến tính - denaturation): hai mạch phân tử DNA tách rời thành hai mạch đơn Phân tử DNA biến tính nhiệt độ cao nhiệt độ nóng chảy (Tm) phân tử, thường 94 – 950 C vòng 30

giây đến phút

Bước (giai đoạn ủ bắt cặp – anealing): Nhiệt độ hạ thấp (thấp Tm mồi) cho phép mồi bắt cặp với khuôn, thực nghiệm nhiệt độ dao động khoảng 40 – 600C tuỳ thuộc Tm mồi sử dụng

kéo dài từ 30 giây đến phút

Bước (giai đoạn kéo dài – elongation hay extension): nhiệt độ giai đoạn tăng lên 720C giúp DNA polymerase hoạt động tổng hợp DNA tốt

nhất với diện deoxyribonucleotide triphosphate Đoạn DNA nằm hai mồi tổng hợp tạo thành chuỗi DNA

Mỗi chu kỳ gồm bước lặp lặp lại nhiều lần lần lại làm tăng gấp đôi lượng DNA mẫu lần trước Tổng DNA khuếch đại tính theo công thức:

Tổng DNA khuyếch đại = m * 2n

* Số chu kỳ phản ứng PCR

Trong thực tế, không vượt 40 chu kỳ phản ứng, phản ứng PCR diễn qua hai giai đoạn:

Giai đoạn đầu, số lượng tăng theo cấp số nhân, tỷ lệ với lượng mẫu ban đầu

Giai đoạn sau đó, hiệu khuếch đại giảm hẳn do: + Phân hủy cạn kiệt thành phần phản ứng + Xuất sản phẩm phụ ức chế lại phản ứng

+ Các vừa tổng hợp không kết hợp với mồi mà lại bắt cặp với

Số chu kỳ phản ứng tùy thuộc số lượng mẫu ban đầu Số mẫu 105

thì cần khoảng 25 – 30 chu kỳ, số mẫu 102 – 103 số chu kỳ phải 35 – 40

2.2.3 Các thành phần phản ứng PCR - DNA mẫu: thành phần cần khuếch đại

- Mồi (primer): Mồi đoạn oligonucleotide mạch đơn, có trình tự bổ sung với trình tự base hai đầu mạch khn để khởi đầu q trình tổng hợp DNA Việc chọn mồi giai đoạn định phản ứng PCR Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, khơng trùng với trình tự lặp lại gen, khơng có bắt cặp bổ sung mồi xuôi mồi ngược khơng có cấu trúc kẹp tóc bắt cặp bổ sung mồi Chiều dài mồi tối thiểu cho hầu hết ứng dụng PCR 18 nucleotide (thường 18 – 24 nucleotide) Trình tự nằm hai mồi “xi” “ngược” khơng lớn, phản ứng PCR tối ưu trình tự nhỏ 1Kb

cuối trình phản ứng diện Mg2+ Taq DNA polymerase tổng

hợp DNA theo hướng 5’ → 3’ hoạt động tốt 70 - 720 C

- Các nucleotide (dNTP- deoxyribonucleotide triphosphate): Là hỗn hợp loại: dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA

- Dung dịch đệm: Thành phần dung dịch đệm thay đổi tuỳ loại enzyme sử dụng, quan trọng ion Mg2+ Nó hình thành phứp hợp

hoà tan với dNTP, cần cho trình liên kết dNTP, xúc tác cho emzyme polymerase, làm tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm) DNA mạch đôi Nồng độ Mg2+ (thường sử dụng dạng MgCl

2) yếu tố ảnh hưởng mạnh đến

hiệu tính đặc hiệu phản ứng PCR Ngồi nồng độ MgCl2 ảnh

hưởng đến trình bắt cặp mồi, nhiệt độ để biến tính DNA thành dây đơn, hoạt động enzyme trung thực kết Nồng độ Mg2+ phải xác

định cho phản ứng qua nhiều thử nghiệm Nồng độ MgCl2 hổn hợp

5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’

3’ 5’

A

B

C

AND KHUÔN MẪU

Lặp lại n vòng

Hình 2.1 Nguyên lý phản ứng PCR A : Biến tính – tách rời mạch phân tử DNA

B : Ủ bắt cặp – cặp mồi chuyên biệt bắt cặp với khuôn

C : Kéo dài – DNA polymerase tổng hợp mạch kể từ mồi bắt cặp diện loại dNTP chất đệm thích hợp

Thời gian (phút) Nhiệt độ (0C)

40 50 60 70 90 100 80

1

Lặp lại n lần 1 chu kyø

A

B

C

94 – 95 0C

40 – 60 0C

72 0C

2.2.4 Phân tích kết quaû PCR

Sản phẩm phản ứng PCR (đoạn DNA khuếch đại) phát phương pháp điện di

Nguyên tắc phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc DNA DNA đại phân tử tích điện âm đồng khắp bề mặt nên chịu tác động điện trường, chúng di chuyển cực dương điện trường Sự di chuyển phân tử gel tác động điện trường phụ thuộc vào khối lượng phân tử (tức số nucleotide) nồng độ chất cấu thành gel, điện

Điện di thực theo phương nằm ngang đứng Các DNA gel agarose hình tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide, chất có khả gắn xen base acid nucleic phát huỳnh quang tác dụng tia UV (bước sóng λ = 300 nm) thành vạch màu đỏ da cam

Để ước lượng kích thước DNA gel agarose, người ta sử dụng “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử” (molecular weight marker – MWM) tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước biết (DNA ladder)

2.3 Multiplex – PCR

Chương

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian địa điểm thực

Thời gian

Đề tài thực từ ngày 01/03/2004 đến ngày 30/11/2004 Địa điểm

- Mẫu khảo sát lấy từ chợ lẻ, lị mổ, hộ - trại chăn ni TP Hồ Chí Minh Long An

- Việc ni cấy, phân lập vi khuẩn thực Phòng thực hành Kiểm nghiệm thú sản môi trường, Khoa Chăn nuôi - Thú y, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

- Việc xác định gen độc lực E coli thực Trung tâm Phân tích thí nghiệm Hóa sinh, Trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Noäi dung

- Phân lập vi khuẩn E coli phân thịt bò, heo phương pháp định lượng Từ đánh giá mức độ vệ sinh thực phẩm cách so sánh với tiêu chuẩn Việt Nam số lượng E coli thịt tươi (TCVN 7046 - 2002) Sử dụng kỹ thuật multiplex - PCR để phát gen độc lực vi khuẩn E coli phân lập qui trình định lượng

3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phân lập vi khuẩn E coli

Đối tượng lấy mẫu

- Thịt bò, heo lấy từ chợ lẻ (dùng cho qui trình định lượng)

- Bề mặt quày thịt bò, thịt heo lấy lị mổ (dùng cho qui trình phân lập định tính)

- Phân bê phân heo tiêu chảy lấy từ số trại hộ chăn ni

- Phân bị phân heo bình thường lấy từ số trại hộ chăn ni

Cách lấy bảo quản mẫu

- Mẫu thịt: Chọn ngẫu nhiên miếng thịt để lấy mẫu Khối lượng mẫu 50 g thịt

- Mẫu bề mặt quày thịt: Chọn ngẫu nhiên quày thịt ca giết mổ Dùng gạc vô trùng lau bề mặt quày thịt với tổng diện tích khoảng 200 cm2

- Mẫu phân bình thường: Dùng muỗng múc khoảng 25 g phần cục phân gia súc thải

- Mẫu phân tiêu chảy: Phân lấy từ trực tràng tăm (± 0,1 g)

rồi cho vào môi trường vận chuyển Carry Blair Tất loại mẫu sau lấy đựng dụng cụ vô trùng

giữ lạnh – 80C tiến hành xét nghiệm (mẫu giữ tối đa 24 giờ)

Số lượng mẫu

Số lượng mẫu khảo sát STT Đối tượng mẫu Phân lập

định tính

Phân lập qua định lượng

1 Thịt heo 49 23

2 Thịt bò 34

Bình thường 25 10

3 Phân heo

Tiêu chảy 22 -

Bình thường 21 10

4 Phân bò

Tiêu chảy 10 -

Tổng cộng 161 51

Qui trình phân lập vi khuẩn E coli

- Từ mẫu thịt mẫu phân bình thường, vi khuẩn E coli phân lập, định lượng theo qui trình FAO (1992)

- Mẫu phân bê heo tiêu chảy cấy ria trực tiếp môi trường EMB MAC, ủ 37oC 24 Khuẩn lạc E coli điển hình mơi

trường EMB dẹp, có màu tím ánh kim với tâm sậm màu, mơi trường MAC có màu hồng, tròn, lồi

- Mẫu bề mặt quày thịt (200 cm2) làm đồng 180 ml pepton

đệm phosphate dập mẫu 60 giây Bổ sung kháng sinh cefixime với nồng độ 0,0125 mg/l (FDA, 2002) Ủ 37oC 24 Pha loãng canh tăng sinh 10

lần với nước sinh lý vô trùng Hút 100 μl canh tăng sinh nồng độ 10-1 dàn

lên bề mặt đĩa thạch CT-SMAC Ủ 37oC 24 Vi khuẩn E coli

Mẫu (thịt, phân bình thường) Làm đồng mẫu

Pha loãng LTB (350C / 24h)

EC

(44,50C / 24 - 48h) EMB (350C / 24h)

Thử IMVC (350C / 24h)

Kết tổng số E coli

MAC (370C / 24h)

Chọn khuẩn lạc

Cấy NA (350C / 24h) LY TRÍCH DNA QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG QUI TRÌNH ĐỊNH TÍNH

Mẫu phân Mẫu thòt

Peptone + Cefixime (370C / 24h) CT - SMAC

(370C / 24h) Chọn khuẩn lạc

điển hình Chọn khuẩn lạc

điển hình

Làm đồng mẫu

MULTIPLEX - PCR

Ghi nhận kết tổng số vi khuẩn E coli có g phân g thịt tươi Đối với mẫu thịt, so sánh kết tổng số vi khuẩn E coli với tiêu tiêu chuẩn thịt tươi (TCVN 7046 - 2002) Bộ Khoa học Công nghệ ban hành theo định số 22/2002/QĐ-BKHCN TCVN qui định sản phẩm thịt tươi đạt TCVN có số lượng E coli không 100 vi khuẩn / gam

3.3.2 Ly trích DNA từ vi khuẩn E coli phân lập

Theo Cebula ctv (1995), kết hợp với phương pháp ly trích DNA từ E coli Cerna (2003) Botteldoorn (2003), tiến hành ly trích DNA từ vi khuẩn E coli phân lập phương pháp nhiệt sau:

- Chọn khoảng 20 khuẩn lạc E coli môi trường thạch cho vào eppendorf đựng sẵn ml nước cất lần vơ trùng

- Đun sôi 10 phút

- Chuyển vào tủ –70 oC, giữ 10 phút

- Rã đơng hồn tồn

- Ly tâm với tốc độ 10.000 rpm phút - Thu phần làm DNA khuôn mẫu

3.3.3 Xác định gen độc lực eae, hly, stx1, stx2, stx2e, sta, stb, lt-I E coli phân lập từ thịt phân

Việc phát gen độc lực E coli thực phản ứng multiplex – PCR với máy luân nhiệt (thermal cycler):

- Multiplex – PCR1: phát gen eaeA, hlyA, stx1, stx2 - Multiplex – PCR2: phaùt gen stx2e, sta, stb, lt-I

Trong trình thực phản ứng multiplex – PCR, mẫu đối chứng dương (EDL933 H44) thực đồng thời với mẫu khảo sát

Hai mẫu đối chứng dương cung cấp từ Phịng thí nghiệm Trường Đại học Thú y Toulouse (Pháp)

Số mẫu xét nghiệm gen độc lực E coli

Mẫu E coli phân lập Số mẫu thực PCR

Phương pháp

phân lập Đối tượng mẫu

Multiplex – PCR1

Multiplex – PCR2

Phân bò 10 10

Phân

bình thường Phân heo 10 10

Thòt bò 8

ĐỊNH LƯỢNG

Thịt

Thịt heo 23 23

Phân bê 10 10

Phân

tiêu chảy Phân heo 22 22

Phân bò 21 21

Phân

bình thường Phân heo 25 25

Thòt bò 34 34

ĐỊNH TÍNH

Thịt

Thịt heo 49 49

TỔNG CỘNG 212 212

Multiplex – PCR1

* Trình tự primer sử dụng multiplex – PCR1: Gen

độc lực

Primer Trình tự primer (5’ → 3’)

Kích cỡ đoạn DNA khuếch đại

* Các thành phần phản ứng multiplex – PCR:

STT Thành phần Nồng độ

1 PCR Buffer X

2 MgCl2 mM

3 dNTPs 200 μM

4 Moài

Stx1-F 250 nM

Stx1-R 250 nM

Stx2-F 250 nM

Stx2-R 250 nM

EaeA-F 250 nM

EaeA-R 250 nM

HlyA-F 250 nM

HlyA-R 250 nM

5 Taq - polymerase 0,5 UI

6 DNA khuôn mẫu μl

7 Nước cất lần Vừa đủ 50 μl

* Chu trình nhiệt phản ứng multiplex – PCR1 (Paton Paton, 1998):

Bước Bước

95 oC / phuùt 95 oC / phuùt

65 oC / phuùt 63 oC / phuùt

72 oC / 1,5 phuùt 72 oC / 1,5 phuùt

Bước Bước

95 oC / phuùt 95 oC / phuùt

64 oC / phuùt 62 oC / phuùt

72 oC / 1,5 phuùt 72 oC / 1,5 phuùt

10 chu kyø

1 chu kyø

1 chu kyø

Bước Bước

95 oC / phuùt 95 oC / phuùt

61 oC / phuùt 60 oC / phuùt

72 oC / 1,5 phuùt 72 oC / 2,5 phuùt

Bước

95 oC / phuùt

60 oC / phuùt

72 oC / 1,5 phuùt

Multiplex – PCR2

* Trình tự primer sử dụng multiplex – PCR2: Gen

độc lực

Primer Trình tự primer (5’ → 3’)

Kích cỡ đoạn DNA khuếch đại

(bp) lt-I LT-R LT-F GGCGACAGATTATACCGTGC CCGAATTCTGTTATATATGTC 696 sta STa-R STa-F TTAATAGCACCCGGTACAAGCAGG CTTGACTCTTCAAAAGAGAAAATTAC 147 stb STb-R STb-F ATCGCATTTCTTCTTGCATC GGGCGCCAAAGCATGCTCC 172 stx2e Stx2e-R Stx2e-F CCTTAACTAAAAGGAATATA CTGGTGGTGTATGATTAATA 230

(Dẫn liệu Blanco ctv, 1997) chu kỳ

10 chu kyø

* Các thành phần phản ứng multiplex – PCR2:

STT Thành phần Nồng độ

1 PCR Buffer X

2 MgCl2 1,5 mM

3 dNTPs 200 μM

4 Moài

Stx2e-F 225 ng

Stx2e-R 225 ng

STa-F 150 ng

STa-R 150 ng

STb-F 45 ng

STb-R 45 ng

LT-I-F 150 ng

LT-I-R 150 ng

5 Taq - polymerase 0,5 UI

6 DNA khuôn mẫu μl

7 Nước cất lần Vừa đủ 50 μl

* Chu trình nhiệt phản ứng multiplex – PCR2 (Nguyen Ngoc Hai, 2002):

94 oC / phuùt

94 oC / 45 giaây

52 oC / 45 giaây

72 oC / phuùt

72 oC / 10 phuùt

3.3.4 Điện di gel agarose đọc kết điện di

Sau phản ứng multiplex - PCR, 10 μl sản phẩm PCR + μl loading dye điện di gel agarose 1,5% TBE Thang ladder điện di đồng thời Thời gian điện di 35 – 40 phút 100 V 250 mA

Gel điện di ngâm 30 phút với dung dịch ethidium bromide mg/ml TBE Sau rửa nước chụp hình gel với tia UV

máy chụp gel (phần mềm Quality One 2000, Bio-Rad) Các băng DNA xác định cách so với băng đối chứng dương thang ladder 100 bp (AB gene, UK)

Hình 3.1 Kết điện di sản phẩm PCR1

EDL933: đối chứng dương (stx1, stx2, eae, hly); 1, 2, 4, 5, mẫu xét nghiệm

Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR2 H44: đối chứng dương (lt-I, stb, stx2e); Lad:thang chuẩn;

1, 4, 5, mẫu xét nghiệm 1 EDL 6 993

534 bp (hly)

255 bp (stx2) 384 bp (180 bp (eaestx1) )

1 H44 Lad 6

500 bp 230 bp (stx2e) 696 bp (lt-I)

Chương

KẾT QUẢ – THẢO LUẬN

4.1 Tổng số vi khuẩn E coli kết phát gen độc lực của E coli phân lập từ phân thịt bò, heo qui trình định lượng

Xác định tổng số vi khuẩn E coli 10 mẫu phân bò bình thường, 10 mẫu phân heo bình thường, mẫu thịt bị 23 mẫu thịt heo theo qui trình định lượng, kết trình bày bảng 4.1

Bảng 4.1 Tổng số vi khuẩn E coli phân thịt bò, heo Đối tượng mẫu mẫuSố Tổng số E coli (X (MPN/g) ± SE) hiện gen độc lực Kết phát

Phân bò 10 9,5*106

± 7,4*106 Không phát PHÂN

Phân heo 10 102*106

± 46,3*106 Không phát

Thịt bò 14,8*104± 4,2*104 Không phát THỊT

Thịt heo 23 0,4*104± 1,1*104 Không phát hiện

trong phân heo Paton Paton (1998) khẳng định E coli phân nguồn vấy nhiễm quan trọng xâm nhập vào sản phẩm thịt trình giết mổ, chế biến thịt; theo Keel Parmelee (1968), E coli xem tiêu chắn để đánh giá mức độ vấy nhiễâm phân vào thịt (dẫn liệu Doyle Padhye, 1989)

Thật vậy, trình giết mổ, E coli từ phân dễ dàng vấy nhiễm sàn, dụng cụ giết mổ, nước sử dụng, phương tiện vận chuyển… Do qui trình giết mổ gia súc, vận chuyển phân phối thịt không tuân thủ nghiêm ngặt điều kiện vệ sinh nguy vấy nhiễm E coli từ phân vào thịt tăng

Chúng tiến hành định lượng tổng số vi khuẩn E coli theo qui trình định lượng FAO (1992) cho mẫu thịt bò 23 mẫu thịt heo thu thập từ chợ lẻ (bảng 4.1) Kết định lượng cho thấy tổng số vi khuẩn E coli trung bình thịt bị 14,8*104

± 4,2*104 MPN/g biến thiên từ

1,1*104 đến 35*104 MPN/g So sánh với tiêu chuẩn TCVN 7046 – 2002 qui

định số vi khuẩn E coli gam thịt tươi không 100 vi khuẩn tổng số mẫu khảo sát, khơng có mẫu thịt bò đạt TCVN Tổng số E coli trung bình thịt heo 0,4*104

± 1,1*104 MPN/g, biến thiên từ

0,4*102 đến 4,5*104 MPN/g Trong tổng số 23 mẫu thịt heo khảo sát có

thân thịt vận chuyển đến chợ lẻ pha lọc, người bán thịt thường cạo bề mặt thịt trước pha lọc, thịt heo hạn chế vấy nhiễm lò mổ, dẫn đến số lượng E coli thịt heo thịt bò

Mặc dù số lượng E coli mẫu phân bò, heo cao, kể E coli thịt bò, heo Tuy nhiên với 51 mẫu E coli phân lập từ phân thịt theo qui trình định lượng chúng tơi khơng phát gen độc lực kỹ thuật multiplex - PCR

Lưu ý qui trình định lượng, E coli tăng sinh chọn lọc môi trường EC 44,5oC 24 Nhiều nghiên cứu cho thấy

ở nhiệt độ cao (≥ 44oC) chủng E coli gây bệnh phát triển yếu dần,

còn chủng E coli cộng sinh (flora) phát triển nhanh Ngoài Hill Carlisle cịn ghi nhận tăng sinh mơi trường 44,5oC có

thể làm plasmide mã hóa yếu tố độc lực làm giảm số lượng dịng E coli gây bệnh có thực phẩm (theo dẫn liệu Doyle Padhye, 1989)

Cũng theo dẫn liệu Doyle Padhye (1989), nhằm đánh giá khả phát E coli gây bệnh có thực phẩm theo qui trình FDA, nghiên cứu khác Hill cộng tác viên nhận thấy loại thực phẩm bán lẻ có khoảng 4,7 dịng E coli khác nhau, sau trình tăng sinh EC 44,50Cthì 30% chủng E coli phát

hiện (không sinh gas sau 48 giờ), E coli tồn q trình tăng sinh có khoảng 20 – 95% E coli tạo độc tố LT bị plasmide Như trình tăng sinh theo qui trình FDA khơng thích hợp cho việc phát có hiệu đáng tin cậy dòng E coli gây bệnh có thực phẩm Thí nghiệm giảm nhiệt độ tăng sinh (< 44oC)

chọn lọc mơi trường có nhiều vi khuẩn khác canh tăng sinh phát triển lấn át vi khuẩn E coli gây bệnh

Từ lý trên, cho ưu điểm phương pháp phân lập E coli theo qui trình định lượng xác định tổng số vi khuẩn E coli mẫu khảo sát, E coli phân lập hồn tồn khơng bao gồm chủng E coli gây bệnh (do vượt qua giai đoạn tăng sinh nhiệt độ 44,5oC), đặc biệt nhóm EHEC với thành viên

đặc trưng O157:H7 – tác nhân gây ngộ độc thực phẩm quan tâm hàng đầu Đây có lẽ lý ảnh hưởng đến kết không phát gen độc lực E coli thu thập từ qui trình định lượng Do tổng số vi khuẩn E coli xác định qui trình định lượng phản ánh mức độ vấy nhiễm E coli vào thực phẩm khơng thích hợp cho việc phát gen độc lực

4.2 Kết phát gen độc lực E coli phân lập từ phân bê tiêu chảy phân heo tiêu chảy

Nhằm bước đầu thử nghiệm qui trình phân lập định tính qui trình phát gen độc lực E coli, chọn đối tượng có khả phát dịng E coli gây bệnh cao phân bê tiêu chảy phân heo tiêu chảy để khảo sát

Ở phân bê tiêu chảy

Bảng 4.2 Kết phát gen độc lực E coli phân bê tiêu chảy

Gen độc lực Mẫu

eae hly stx1 stx2 stx2e sta stb lt-1

1 - - + - - -

2 + - + - - -

3 - - - - - -

5 + + + + - - - -

6 - + + - - -

7 - - - - - -

8 + + - + - - - -

9 - - - + -

10 - - - + -

Coäng 3 0 Tỷ lệ (%) 30,0 30,0 40,0 20,0 0 0 20,0 0

Trong tổng số 10 mẫu E coli phân lập từ phân bê tiêu chảy, có 7/10 mẫu (70%) phát có gen độc lực, bao gồm:

- 5/10 mẫu (50%)phát gen stx (stx1 hoặc/và stx2) - 3/10 mẫu (30%) phát gen eae

- 3/10 mẫu (30%) phát gen hly - 2/10 mẫu (20%) phát gen stb

lực Gen stx phát với tỉ lệ cao (5/10 mẫu – 50%) Smith (1988) Gyles (1992) cho nhiều lồi gia súc mang STEC khơng có biểu triệu chứng, vài dịng STEC có khả gây tiêu chảy cho bò, đặc biệt bê Trong mẫu E coli của phân bê tiêu chảy mang gen stx, có mẫu đồng thời mang gen eae mẫu đồng thời mang gen hly Theo Barrett (1992), độc tố Stx điều kiện cần chưa phải điều kiện đủ để gây bệnh tiêu chảy Do xuất đồng thời gen eae, hly với gen stx góp phần giải thích lý tiêu chảy bê

Ở phân heo tiêu chảy

Kết phát gen độc lực E coli từ 16 mẫu phân heo cai sữa tiêu chảy mẫu phân heo theo mẹ tiêu chảy trình bày bảng 4.3

Kết bảng 4.3 cho ta thấy nhóm heo cai sữa tiêu chảy có 14/16 mẫu (87,5%) mang gen độc lực, nhóm heo theo mẹ tiêu chảy có 3/6 mẫu (33,3%) mang gen độc lực

- Đối với E coli từ phân heo cai sữa tiêu chảy, có 1/16 mẫu (6,3%) mang gen hly, 2/16 mẫu (12,5%) mang gen eae, 5/16 mẫu (31,3%) mang gen stx2e 8/16 mẫu (50%) mang gen stx2.

- Đối với E coli từ phân heo theo mẹ tiêu chảy, có 2/16 mẫu (33,3%) vừa diện gen stx2 và stx2e

Bảng 4.3 Kết phát gen độc lực E coli phân heo tiêu chảy

Gen độc lực Mẫu

eae hly stx1 stx2 stx2e sta stb lt-1

1 − − − + + − + −

2 − − − + + − + −

3 − − − − − − − −

4 + + − + + − + −

5 − − − − − − − −

6 − − − + − − + −

7 + − − + − − + −

8 − − − + − + − −

9 − − − − + − + −

10 − − − − − − + −

11 − − − − + − + −

12 − − − − − − + −

13 − − − − − − + −

14 − − − + − + + −

15 − − − + − + + −

16 − − − − − + + −

Phân heo cai sữa tiêu chảy

Coäng (%) 2 (12,5) 1 (6,3) 0 (0) 8 (50,0) 5 (31,3) 4 (25,0) 13 (81,25) 0 (0)

1 − − − − − − − −

2 − − − + + − + −

3 − − − + + − + −

4 − − − − − − − −

5 − − − − − − − −

6 − − − − − − + −

Phân heo

theo mẹ ti êu chảy Cộng (%) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 2 (33,3) 2 (33,3) 0 (0) 3 (50,0) 0 (0)

Coäng chung 10 16

- Gen stb diện E coli với tỷ lệ cao nhóm phân heo cai sữa tiêu chảy (81,25%) phân heo theo mẹ tiêu chảy (50%)

Blanco (1997) nhận thấy gen stb xuất với tần số cao 78,4% (58/74 mẫu) so với gen độc lực khác E coli phân lập từ phân heo tiêu chảy phù thủng Ơng kết luận độc tố STb góp phần đáng kể vào triệu chứng tiêu chảy heo Điều phù hợp với kết nghiên cứu Handl (1992), Harel (1991) Moon (1986)

Tóm lại, 22 mẫu E coli phân lập từ 22 mẫu phân heo tiêu chảy có 17/22 mẫu (77,2%) phát gen độc lực, đó:

- 16 mẫu (72,7%) phát gen stb, chiếm tỉ lệ phát cao

- 10 mẫu (45,5%) phát gen stx2 - mẫu (31,8%) phát gen stx2e - mẫu (18,2%) phát gen sta - mẫu (9,1%) phát gen eae - 1/22 mẫu (4,5%) phát gen hly.

Như vậy, độc tố Stb Stx2/Stx2e nguyên nhân gây tiêu chảy heo con, đặc biệt nhóm heo cai sữa (81,3% mẫu phát gen stb, 50% phát có gen stx2 31,3% phát có gen stx2e)

Tổng kết việc phát gen độc lực E coli từ nhóm phân bê heo tiêu chảy, nhận thấy rằng:

- Khả phát gen độc lực E coli từ mẫu phân tiêu chảy cao (70% phân bê tiêu chảy 72,7% phân heo tiêu chảy) Điều chứng tỏ nhóm đối tượng này, E coli mang gen độc lực nguyên nhân quan trọng gây tiêu chảy

- Độc tố gây tiêu chảy bê Stx (Stx1 và/hoặc Stx2 – 50%), heo độc tố chịu nhiệt Stb (59,1%), độc tố Stx2 (45,5%) nguy hiểm độc tố Stx2e gây phù thủng (31,8%)

4.3 Kết phát gen độc lực E coli phân bị và phân heo bình thường

Nguồn vấy nhiễm E coli vào thịt chủ yếu phân (đa số phân bình thường) bị, heo trưởng thành Nhằm xác định gen độc lực E coli gây bệnh cho người qua thịt tươi, phân lập E coli từ 21 mẫu phân bị bình thường 25 mẫu phân heo bình thường theo phương pháp định tính thu thập khuẩn lạc điển hình để ly trích DNA

Ở phân bị bình thường

Kết phát gen độc lực 21 mẫu E coli phân lập từ phân bị bình thường ghi nhận bảng 4.4

Bảng 4.4 Kết phát gen độc lực E coli phân bị bình thường

Gen độc lực Mẫu

eae hly stx1 stx2 stx2e sta stb lt-1

1 − − − + − − − −

2 − − + − − − − −

3 − − − − − − − −

4 − − − − − − − −

5 − − − − − − − −

6 − − − − − − − −

7 − − − − − − − −

8 − − + + − − + −

9 − − − − − − − −

10 − − + − − − − −

11 − − + + − − + −

12 − + + + − − + −

13 − − + + − − − −

14 − − − − − + − −

15 − − − + − − − −

16 − − + + − − − −

17 − + − + − − − −

18 − + + + − − − −

19 + + − − − − − −

20 − − − − − − − −

21 − − − − − − − −

Gen stx1 stx2 được phát với tỉ lệ cao (42,9% 38,1%) Như rõ ràng phân bò nguồn lưu cửu STEC tự nhiên, Beutin (1995) nhận định dòng E coli sản sinh độc tố Stx thường diện phân thú nuôi khỏe mạnh, đặc biệt phân loài nhai lại (Beutin, 1993) Theo Levin (1987), STEC tác nhân gây bệnh cho người Và theo Renwick (1993), người trở nên cảm nhiễm ăn phải thức ăn bị nhiễm tiếp xúc trực tiếp với STEC từ phân động vật Người nhiễm STEC tiêu chảy trầm trọng viêm kết tràng xuất huyết (HC) hội chứng huyết niệu (HUS) (Karmali, 1989)

Với 21 mẫu E coli trong phân bị bình thường, gen hly và gen stb có tỉ lệ phát 19% 14,3%, gen eae gen stb phát với tỉ lệ thấp (4,8%) Không phát gen stx2e gen lt-I

Như vậy, gen stx2e không phát nhóm phân bê tiêu chảy phân bị bình thường Điều phù hợp với kết luận Beutin (1995), Stx2e diện nhóm STEC heo Theo Blanco (1997), Stx2e biến chủng Stx2, biến chủng phát E coli có nguồn gốc từ heo

Ở phân heo bình thường

Bảng 4.5 Kết phát gen độc lực E coli phân heo bình thường

Gen độc lực Mẫu

eae hly stx1 stx2 stx2e sta stb lt-1

1 − − − − − − + −

2 − − − − − − − −

3 − − − − − − + −

4 − − − − − − − −

5 − − − − − − − −

6 − − − − − − + −

7 − − − − − − + −

8 − − − − − − − −

9 − − − − − − + −

10 − − − − − − − −

11 − − − − − − − −

12 − − − − − − − −

13 − − − − − − − −

14 − − − − − − − −

15 − − − − − − − −

16 − − − − − − − −

17 − − − − + − + −

18 − − − − − − − −

19 − − − − − − − −

20 − − − − + − + −

21 − − − − + − − −

22 + + − + + − − −

23 − − − − − − − −

24 + + − − − − − −

25 − − − − − − − −

Trong 25 mẫu E coli phân lập từ phân heo bình thường, 10/25 mẫu (40%) phát có gen độc lực; nhóm phân heo tiêu chảy, gen stb phát với tỉ lệ cao (28%), tỉ lệ phát gen stx2 tương đối không cao (16%)

Tóm lại, E coli phân bị heo bình thường mang gen độc lực Đặc biệt E coli phân bị bình thường mang gen sản sinh độc tố Stx1, Stx2 gây tiêu chảy cho người, trường hợp bệnh nặng gây HC HUS Ngồi ra, E coli phân heo bình thường mang gen stx2e sản sinh độc tố vero gây phù thủng cho heo Do vệ sinh tốt trại chăn nuôi heo biện pháp phòng ngừa tiêu chảy phù thủng cho heo Vệ sinh cho thú mổ thịt, vệ sinh hạ thịt phân phối biện pháp hàng đầu ngăn ngừa vấy nhiễm E coli từ phân đến thịt nhằm đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng

4.4 Kết phát gen độc lực E coli bề mặt quày thịt bò, heo

CT-SMAC Việc ly trích thực phản ứng multiplex - PCR tiến hành tương tự nhóm mẫu khác

Trên thịt bò

Kết phát gen độc lực 34 mẫu E coli phân lập từ thịt bò ghi nhận bảng 4.6

Trong tổng số 34 mẫu E coli phân lập từ thịt bị, có 21/34 mẫu (61,8%) phát có mang gen độc lực, bao gồm:

- 17/34 mẫu (50,0%) phát gen stx2 - 11/34 mẫu (32,4%) phát gen stx1 - 8/34 mẫu (23,5%) phát gen eae - 9/34 mẫu (26,5%) phát gen hly - 1/34 mẫu (2,9%) phát gen stb.

Tỉ lệ phát E coli mang gen độc lực thịt bò cao (21/34 mẫu chiếm tỉ lệ 61,8%) có mẫu (5,9%) mang đồng thời gen độc lực nhóm EHEC (stx1, stx2, eae, hly) mẫu khác (14,7%) mang gen độc lực stx2, eae, hly Sự xuất đồng thời nhiều gen độc lực EHEC mẫu nguy tiềm ẩn gây ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng gây HC HUS cho người q trình chế biến khơng có cơng đoạn tiêu diệt vi khuẩn

Bảng 4.6 Kết phát gen độc lực E coli thịt bò Gen độc lực

Maãu

eae hly stx1 stx2 stx2e sta stb lt-1

1 − − − − + − − −

2 − − − − − − + −

3 − − − − + − − −

4 − + + + − − − −

5 + + + + − − − −

6 + + + + + − − −

7 + + − + − − − −

8 + + − + − − − −

9 + + − + − − − −

10 + + − + − − − −

11 + + − − − − − −

12 + + − + − − − −

13 − − + + − − − −

14 − − + + − − − −

15 − − + + − − − −

16 − − + + − − − −

17 − − + + − − − −

18 − − + + − − − −

19 − − + + − − − −

20 − − + + − − − −

21 − − − + − − − −

13 mẫu

còn lại − − − − − − − −

Riêng gen stx2e phát mẫu thịt bò khẳng định vấy nhiễm phân heo trình giết mổ Cả mẫu thịt bò lấy từ sở giết mổ chung heo bò Việc vấy nhiễm qua lại hai khu vực lị mổ hồn tồn xảy công nhân giết mổ, dụng cụ, nước rửa tay…

Trên thịt heo

Kết phát gen độc lực 49 mẫu E coli phân lập từ thịt heo ghi nhận bảng 4.7

Bảng 4.7 Kết phát gen độc lực E coli thịt heo Gen độc lực

Maãu

eae hly stx1 stx2 stx2e sta stb lt-1

1 − + − − − −

2 + + + − − − −

3 − − − + − − − −

4 − − − + − − − −

5 − − − + − − − −

6 − − − + − − − −

7 − − − + − − − −

8 − − − + − − − −

9 − − − + − − − −

10 − − − + − − − −

11 − − − + − − − −

12 + + − − − − − −

37 mẫu

còn lại − − − − − − − −

Trong tổng số 49 mẫu E coli phân lập từ thịt heo, có 12/49 mẫu (24,5%) phát có mang gen độc lực, bao gồm:

- 11/49 mẫu (22,5%) phát gen stx2 - 2/49 mẫu (4,1%) phát gen eae, hly

- Không phát gen stx1, stx2e, sta, stb, lt-I mẫu khảo sát

- Chỉ có 1/49 mẫu (2,0%) phát đồng thời mang gen stx2, eae, hly Như vậy, E coli mang gen độc lực phân lập thịt heo chiếm tỉ lệ thấp thịt bị (24,5% so với 61,8%)ø Ngồi ra, thịt heo tỉ lệ E coli mang đồng thời gen độc lực stx2, eae, hly (2,0%) thấp tỉ lệ thịt bị (20,6%) Từ ta nhận định tiêu chảy HC HUS người nguyên nhân thịt bò dễ xảy so với thịt heo Điều phù hợp với nghiên cứu dịch tễ giới ổ dịch STEC/EHEC phần lớn gây tiêu thụ sản phẩm thịt bò (dẫn liệu Paton Paton, 1998)

4.5 Tổng kết kết phát gen độc lực E coli mẫu khảo sát có nguồn gốc từ bị

Tóm lại, nghiên cứu chúng tôi, đối tượng gia súc chọn khảo sát bò heo Trong đối tượng gia súc này, thực khảo sát nhóm mẫu gồm: phân bê/heo tiêu chảy, phân bị bình thường thịt tươi Trên đối tượng gia súc, tổng kết kết phát gen độc lực E coli nhóm mẫu khảo sát nhằm có nhìn tổng quát

Bảng 4.8 Tổng kết kết phát gen độc lực E coli trên mẫu khảo sát có nguồn gốc từ bị

Gen độc lực Nhóm mẫu N n

eae hly stx1 stx2 stx2e sta stb lt-1 3 0 Phân bê

tiêu chảy

10

70,0 30,0 30,0 40,0 20,0 0 20,0

13 Phân bò

bình thường 21

61,9 4,8 19,0 38,1 42,9 4,8 14,3 21 11 17 Thịt bò 34

61,8 23,5 26,5 32,4 50,0 8,8 2,9 41 12 16 23 28 (3) COÄNG 65

63,1 18,5 24,6 35,4 43,1 (4,6) 1,5 9,2 N: Số lượng mẫu khảo sát

n: Số lượng mẫu phát có mang gen độc lực

0 10 20 30 40 50 60

eae hly stx1 stx2 stx2e sta stb lt-1 Gen độc lực Tỉ lệ (%)

Như vậy, số 65 mẫu E coli phân lập từ phân thịt có nguồn gốc từ bị, đối tượng mẫu có tỉ lệ mẫu mang gen độc lực cao (70% từ mẫu phân bê tiêu chảy, 61,9% từ mẫu phân bị bình thường, 61,8% từ mẫu thịt bị) Tính chung cho nhóm mẫu có nguồn gốc từ bị có 41/65 mẫu E coli mang gen độc lực, chiếm tỉ lệ 63,1%

Trong đó:

- E coli mang gen stx2 xuất với tỉ lệ cao (43,1%)

- Các gen stx1, hly, eae xuất với tỉ lệ cao (lần lượt 35,4%, 24,6%, 18,5%) Như rõ ràng bị nguồn lưu cửu STEC tự nhiên

- Gen sta, stb xuất với tần số thấp (1,5% 9,2%)

- Riêng gen stx2e E coli khơng phát 31 mẫu phân bò (10 mẫu phân bê tiêu chảy 21 mẫu phân bị bình thường) Kết phù hợp với Beutin (1995) Blanco (1997) Tuy nhiên E coli từ 34 mẫu thịt bị khảo sát có mẫu mang gen stx2e nhiễm phân heo trình giết mổ

4.6 Tổng kết kết phát gen độc lực E coli mẫu khảo sát có nguồn gốc từ heo

Bảng 4.9 Tổng kết kết phát gen độc lực E coli trên mẫu khảo sát có nguồn gốc từ heo

Gen độc lực Nhóm mẫu N n

eae hly stx1 stx2 stx2e sta stb lt-1 17 10 16 Phaân heo

tiêu chảy

22

77,2 9,1 4,5 45,5 31,8 18,2 72,7 10 2 Phân heo

bình thường 25

40,0 8,0 8,0 4,0 16,0 28,0 12 2 11 0 0 Thòt heo 49

24,5 4,1 4,1 22,5 0 0 39 22 11 23 COÄNG 96

40,6 6,3 5,2 22,9 11,5 4,2 24,0 N: Số lượng mẫu khảo sát

n: Số lượng mẫu phát có mang gen độc lực

0 10 20 30 40 50 60 70 80

eae hly stx1 stx2 stx2e sta stb lt-1 Gen độc lực Tỉ lệ (%)

Như vậy, 96 mẫu E coli có nguồn gốc từ heo, 39 mẫu phát mang gen độc lực, chiếm tỉ lệ 40,6%

Chương

KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ

5.1 Kết luận

Qua kết thu trình phát gen độc lực E coli phân lập từ phân thịt bò, heo kỹ thuật multiplex - PCR, rút số kết luận sau:

(1) Qui trình định lượng E coli có giai đoạn ni cấy 44,5oC khơng

thích hợp cho nhóm E coli gây bệnh phát triển nên không phát gen độc lực 20 mẫu phân 31 mẫu thịt bò, heo

(2) Phân lập trực tiếp E coli từ phân môi trường chọn lọc MAC 370C, chọn 20 khuẩn lạc điển hình cho E coli để phát gen độc lực

bằng kỹ thuật multiplex – PCR cho thaáy:

* Tỉ lệ phát gen độc lực E coli trong phân tiêu chảy cao: 70% phân bê tiêu chảy 77,2% phân heo tiêu chảy

* E coli trong phân bị, heo bình thường mang gen độc lực với tỉ lệ phát thấp phân tiêu chảy

* Phân bò nguồn lưu cửu STEC/EHEC tự nhiên Gen stx1 phát từ E coli phân lập từ phân bị, khơng phát từ phân heo Gen stx2e sản sinh độc tố vero gây tiêu chảy phù thủng diện E coli trong phân heo, không phát phân bò

(4) Chưa phát gen lt-I E coli trong 65 mẫu phân thịt bò, 96 mẫu phân thịt heo

5.2 Đề nghị

- Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán bệnh kiểm tra vệ sinh an toàn thực phẩm

- Vệ sinh quản lý tốt sở chăn nuôi nhằm ngăn ngừa bệnh tiêu chảy, phù thủng heo

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHẦN TIẾNG VIỆT

1 Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998 Sinh học phân tử (Khái niệm – Phương pháp – Ứng dụng) Nhà xuất Giáo dục Thành phố Hồ Chí Minh Trần Thanh Phong, 1998 Escherichia coli O157:H7 ngộ độc thức ăn

Tập san Khoa học Kỹ thuật Nông lâm nghiệp Số tháng 6/1998 Trường Đại học Nơng Lâm, TP Hồ Chí Minh Nhà xuất Nông nghiệp Trang – 14

PHẦN TIẾNG NƯỚC NGOAØI

3 Barrett T J., Kaper L B., Jerse A E., and Wachsmuth I K., 1992 Virulence factors in Shiga-like toxin producing Escherichia coli isolated from humans and cattle J Infect Dis 165:970-980

4 Bertschinger H U and Fairbrother J M., 1999 Escherichia coli infections In Diseases of swine (Eds B E Straw, S D’Allaire, W L Mengeling, and D J Taylor) Iowa State University Press, Iowa, USA Beutin L., Aleksic S., Zimmermann S., and Gleier K., 1994 Virulence

factors and phenotypic traits of verotoxigenic strains of Escherichia coli isolated from human patients in Germany Med Microbiol Immunol (Berlin) 183:13-21

6 Beutin L., Geier D., Steinrck H., Zimmermann S., and Scheutz F., 1993 Prevalence and some properties of verotoxin (Shiga-like toxin)-producing Escherichia coli in seven different species of healthy domestic animals J Clin Microbiol 31:2483-2488

A T., Zerbini L F., Yano T., de Castro A F P., and Blanco J., 1997 Note: Genes coding for enterotoxins and Verotoxins in Porcin Escherichia coli strains belonging to different O:K:H serotypes: relationship with phenotype J Clin Microbiol 35:2958-2963

9 Botteldoorn N., Heydrick M., Rijpens N., Herman L., 2003 Detection and characterization of verotoxigenic Escherichia coli by a VTEC/EHEC multiplex – PCR in porcine faeces in pig carcass swabs Res Microbiol 154:97-104

10 Calderwood S B., Acheson D W K., Keusch G T., Barrett T J., Griffin P M., Strockbine N A et al, 1996 Proposed new nomenclature for SLT (VT) family ASM News 62:118-119

11 Cebula T A., Payne W L., and Fegn P., 1995 Simultaneous identification of strains of Escherichia coli serotype O157:H7 and their Shiga-like toxin type by Mismatch amplification mutation assay multiplex – PCR J Clin Microbiol 33:248-250

12 Cerna J F., Nataro J P., and Garcia T E., 2003 Multiplex – PCR for detection of three plasmid borne genes of enteroaggregative Escherichia coli strains J Clin Microbiol. 41:2138-2140

13 Chalmer R M., Salmon R L., Willshaw G A., Cheasty T., Looker N., Davies I., and Wray C., 1997 Verocytotoxin-producing Escherichia coli O157 in a farmer handing horses Lancet 349:1816

14 Chapman P A., Siddons C A., Cerdan Malo A T., and Harkin M A., 1997 A 1-year study of Escherichia coli in cattle, pig and poultry Epidemiol Infect. 119:245-250

15 Donnenberg M S., Tzipori S., McKee M L., O'Brien A D., Alroy J., and Kaper J B., 1993 The role of the eae gene of enterohemorrhagic Escherichia coli in intimate attachment in vitro and in a porcine model J Clin Invest 92:1418-1424

17 FAO, 1992 Microbiological analysis in the food control laboratory. 18 FDA, 2002 “Diarrheagenic Escherichia coli”, Bacteriological Analytical

manual Online, CFSAN September 2002

<URL:http://vm.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-4a.html

19 Handl C E., Olsson E., and Flock J I., 1992 Evaluation of three different STb assays and comparision of enterotoxin pattern over a five-year period in Swedish porcine Escherichia coli Diagn Microbiol Infect Dis 15:505-510

20 Harel J., Lapointe H., Fallara A., Lorrtie A., Bigras-Poulin M., Lariviere S., and Fairbrother J M., 1991 detection of genes for fimbrial antigens and enterotoxins associated with Escherichia coli serogroups isolated from pig with diarrhea J Clin Microbiol 29:745-752

21 Hitotsubashi S., Fujii Y., Yamanaka H., and Okamoto K., 1992 Some properties of purified Escherichia coli heat-stable enterotoxin II Infect Immun. 60:4468-4474

22 Jann K and Jann B., 1992 Capsules of Escherichia coli, expression and biological significance. Can J Microbiol 38:705-710

23 Kaffmann F., 1947 The serology of coli group J Immunol 57:71-100 24 Karmali M A., 1989 Infection by verocytotoxin-producing Escherichia

coli Clin Microbiol Rev 2:15-38

25 Keskimaki M., 2001, Shiga toxin-producing and other diarrhoeagenic Escherichia coli in Finland: pheno- and genotypic epidemiology Academic dissertation The Faculty of Agriculture and Forestry of the University of Helsinky, Finland

verotoxin variant, VT2g, produced by bovine verocytotoxigenic Escherichia coli. Appl Environ Microbiol 69:4549-4553

28 Levine M M., Ristaino P., Marley G., Smyth C., Knutton S., Boedeker E., Black R., Young C., Clements M L., Cheney C., and Patnaik R., 1984 Coli surface antigens and of colonization factor antigen II-positive enterotoxigenic Escherichia coli: morphology, purification, and immune responses in humans Infect Immun 44:409-420

29 Levine M M., Ristaino P., Marley G., Smyth C., Knutton S., Boedeker E., Black R., Young C., Clements M L., Cheney C., and Patnaik R., 1984 Coli surface antigens and of colonization factor antigen II-positive enterotoxigenic Escherichia coli: morphology, purification, and immune responses in humans Infect Immun. 44:409-420

30 Levine M M., Xu J., Kapper J B., Lior H., Prado V., Tall B., Nataro J P., Karch H., and Wachsmuth K., 1987 A DNA probe to identify enterohemorrhagic Escherichia coli of O157:H7 and other serotypes that cause hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome J Infect Dis. 156:175-182

31 Moon H W., Schneider R A., and Moseley S L., 1986 Comparative prevalence of four enterotoxin genes among Escherichia coli isolated from swine. Am J Vet Res 47:210-212

32 Moon H W., Whipp S C., Argenzio R A., Levine M M., and Giannella R A., 1983 Attaching and effacing activities of rabbit and human enteropathogenic Escherichia coli in pig and rabbit intestines Infect Immun. 41:1340-1351

33 Nataro J P and Kaper J B., 1998.Diarrheagenic Escherichia coli Clin Microbiol Rev 11(1):142-201

34 Nguyen Ngoc Hai, 2002 Maladie de l’edemedu porc au Vietnam: carateùrisation des sou ches Escherichia coli responsables, facteurs de pathogeùniciteù et vaccination PhD Theùsis

36 Paton A W and Paton J C., 1998 Detection and characterization of Shiga toxigenic Escherichia coli by using multiplex PCR assay for stx1, stx2, eaeA, enterohemorrhagic E coli hlyA, rfbO111, and rfbO157 J Clinical Microbiol. 36(2):598-602

37 Paton J C and Paton A W., 1998 Pathogenesis and diagnosis of Shiga toxin-producing Escherichia coli infections Clin Microbiol Rev. 11:450-479

38 Paton J C., and Paton A W., 1996 Survival rate of mice after transient colonization with Escherichia coli clones carrying variant Shiga-like toxin type II operons Microb Pathog 20:377-383

39 Protocol online

<URL:http://www.protocol-online.org/prot/Molecular_Biology/PCR/ Multiplex_PCR/

40 Renwick S A., wilson J B., Clarke R C., Lior H., Borcyk A A., Spika J., Rahn K., McFadden K., Brouwer A., Coopps A., Anderson N G., Alves D., and Karmali M A., 1993 evidence of direct transmission of Escherichia coli O157:H7 infection between calves and human J Infect Dis. 168:792-793

PHUÏ LUÏC

HÓA CHẤT CHO ĐIỆN DI TBE (0,5 X)

Tris HCl 3,94 mg

Acid Boric 1,39 g

Na2EDTA 93,06 mg

Nước cất vừa đủ 500 ml pH = 8,3 với NaOH 0,1N

Agarose (2%) Loading dye

Bromophenol blue 0,25% Sucrose 40% TE 1X vừa đủ 100%

HÓA CHẤT CHO NHUỘM GEL

TBE 1X

Ethidium bromide 10 mg/ml MÔI TRƯỜNG VÀ THUỐC THỬ Mơi Trường

LTB

Trypticase/ Tryptone 20g NaCl 5g Lactose 5g K2HPO4 2,75g

KH2PO4 2,75g

Sodium lauryl sulphate 0,1g Nước cất vừa đủ 1.000 ml pH = 6,8 ± 0,1

EC

Tryptone 20 g

Lactose 5g

Dipotassium phosphate g

Monopotassium phosphate 1,5g Sodium chloride 5g

Nước cất vừa đủ 1.000 ml

PH = 6,9 ± 0,2 (25oC)

EMB

Peptone 10 g

Lactose g

Sucrose 5g Dipotassium phosphate g Agar 13,5g Eosin Y 0,4 g Methyl blue 0,065g

Nước cất vừa đủ 1.000 ml

pH = 7,2± 0,2 (25oC)

NA

Peptone 5g Sodium chloride 5g Beef Extract 1,5g Yeast Extract 1,5g Agar 15g

Nước cất vừa đủ 1.000 ml

pH = 7,4 ± 0,2 (25oC)

Nước peptone đệm

Peptone 10 g Sodium chloride 5g Disodium hydrogen phosphate g

Potassium dihydrogen phosphate 1,5g

Nước cất vừa đủ 1.000 ml

SIMMON CITRAT

Na citrate g NaCl g K2HPO4 g

NH4H2PO4 g

MgSO4 0,2 g

Bromothymol blue 0,08 g Agar 15 g Nước cất vừa đủ 1.000 ml

MR – VP

Peptone g Glucose g K2HPO4 g

Nước cất vừa đủ 800 ml

Ph = 6,9 ± 0,2 Thuốc Thử

VP (Voges Proskauer) Dung dòch A:

Alpha naphthol 5g

Ethanol tuyệt đối 100 ml Dung dịch B:

Potassium hydroxyde 40 g Nước cất 100 ml MR (Methyl red)

Methyl red 0,1 g

PHUÏ LUÏC

CÁC VẤN ĐỀ THƯỜNG GẶP TRONG MULTIPLEX – PCR VAØ HƯỚNG GIẢI QUYẾT

Vấn đề Hướng giải

Sản phẩm không chuyên biệt

* Nếu dài

- Tăng nồng độ KCl (buffer) đến 1,2 - 2X giữ nguyên nồng độ

MgCl2 1,5 – mM

* Neáu ngắn

- Giảm nồng độ buffer cịn 0,7 - 0,9X giữ nồng độ MgCl2 1,5 -

2 mM

- Tăng dần nhiệt độ ủ bắt cặp - Giảm lượng ADN xét nghiệm - Giảm lượng primer

- Giảm lựơng Taq - polymerase

- Tăng nồng độ MgCl2 - 4,5 mM giữ nguyên nồng độ dNTP

- Thêm chất phụ gia, tốt dùng BSA (0,1 - 0,8 μg/μl: nồng độ

cuối cùng) Có thể dùng thử 5% glycerol (v/v nồng độ cuối) * Nếu khơng có sản phẩm

- Chạy PCR cho cặp mồi sử dụng multiplex với nhiệt độ ủ bắt cặp thấp bình thường

- So sánh sản phẩm không chuyên biệt cho cặp mồi kiểm tra với sản phẩm khơng chun biệt nhìn thấy chạy multiplex - PCR Điều cặp mồi mang lại sản phẩm không chuyên biệt phản ứng multiplex

- Kết hợp vài tất phương pháp

Sản phẩm yếu (mờ)

- Giảm thời gian ủ bắt cặp

- Giảm nhiệt độ kéo dài đến 62 - 680C

- Tăng thời gian kéo dài

- Tăng nồng độ ADN xét nghiệm - Tăng tất lượng primer sử dụng

- Điều chỉnh nồng độ Taq - polymerase

- Thay đổi nồng độ buffer giữ nồng độ MgCl2 1,5 – mM

- Tăng nồng độ MgCl2 đến - 4,5 mM giữ nguyên nồng độ

dNTPs

Vấn đề Hướng giải

Sản phẩm dài yếu

(mờ)

- Giảm nồng độ buffer 0,7 - 0,8X giữ nồng độ MgCl2 1,5 –

2 mM

- Tăng nồng độ MgCl2 lên - 4,5 mM giữ nguyên nồng độ

dNTPs

- Tăng thời gian biến tính - Tăng thời gian ủ bắt cặp - Giảm nhiệt độ ủ bắt cặp

- Tăng thời gian nhiệt độ kéo dài

- Tăng lượng primer sản phẩm PCR có băng mờ đồng thời giảm lượng primer cho băng đậm

- Thêm chất phụ gia, tốt dùng BSA ( 0,1 - 0,8μg/μl) Nên thử

5% glycerol (v/v nồng độ cuối cùng)

- Kết hợp vài tất phương pháp

Sản phẩm ngắn yếu (mờ)ø

- Tăng nồng độ buffer đến 1,2 - 2X giữ nồng độ MgCl2 1,5 –

mM

- Giảm thời gian biến tính - Giảm thời gian ủ bắt cặp - Giảm nhiệt độ ủ bắt cặp

- Giảm thời gian nhiệt độ kéo dài

- Tăng lượng primer sản phẩm PCR có băng mờ giảm lượng primer cho băng đậm

- Thêm chất phụ gia BSA (0,1 - 0,8 μg/μl), thử 5% glycerol (v/v

nồng độ cuối cùng)

Download» Agriviet.com

GIỚI THIỆU VỀ TAØI LIỆU

A Tài liệu bạn xem download từ website

WWW.AGRIVIET.COM WWW.MAUTHOIGIAN.ORG

»Agriviet.com website chuyên đề nông nghiệp nơi liên kết thành viên hoạt động lĩnh vực nông nghiệp, thường xuyên tổng hợp tài liệu tất

các lĩnh vực có liên quan đến nơng nghiệp để chia tất người Nếu tài liệu bạn cần khơng tìm thấy website xin vui lịng gửi yêu cầu ban biên tập website để

chúng cố gắng bổ sung thời gian sớm

»Chúng xin chân thành cám ơn bạn thành viên gửi tài liệu cho

Thay lời cám ơn đến tác giả cách chia lại tài liệu mà bạn có

mọi người Bạn trực tiếp gửi tài liệu bạn lên website gửi cho

theo địa email Webmaster@Agriviet.Com

Lưu ý: Mọi tài liệu, hình ảnh bạn download từ website thuộc quyền tác giả,

do chúng tơi khơng chịu trách nhiệm khía cạnh có liên quan đến nội

dung tập tài liệu Xin vui lòng ghi rỏ nguồn gốc “Agriviet.Com” bạn phát

hành lại thông tin từ website để tránh rắc rối sau

Một số tài liệu thành viên gửi cho không ghi rỏ nguồn gốc tác giả,

một số tài liệu có nội dung khơng xác so với tài liệu gốc, bạn

là tác giả tập tài liệu liên hệ với có yêu cầu

sau :

• Xóa bỏ tất tài liệu bạn website Agriviet.com

• Thêm thơng tin tác giả vào tài liệu

• Cập nhật nội dung tài liệu