XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN VIRUS GÂY HỘI CHỨNG CÒI CỌC TRÊN HEO SAU CAI SỮA Porcine circovirus type 2 BẰNG KỸ THUẬT LAMP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA ḶN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN VIRUS GÂY HỘI CHỨNG CỊI CỌC TRÊN HEO SAU CAI SỮA Porcine circovirus type BẰNG KỸ THUẬT LAMP Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: LÊ THỊ NGỌC BÍCH Niên khố: 2007 – 2011 Tháng 7/2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN VIRUS GÂY HỘI CHỨNG CỊI CỌC TRÊN HEO SAU CAI SỮA - Porcine circovirus type BẰNG KỸ THUẬT LAMP Hướng dẫn khoa học: ` Sinh viên thực hiện: LÊ THỊ NGỌC BÍCH PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI KS VÕ KHÁNH HƯNG Tháng 07/2011 LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin cám ơn người thân gia đình ln tạo điều kiện, động viên giúp đỡ thời gian học trường Xin chân thành cám ơn: Ban Giám hiệu Trường đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ sinh học quý thầy tận tình giúp đỡ, truyền đạt dạy bảo cho em suốt thời gian học tập trường Các Thầy Cô anh chị Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Môi trường - Trường Đại Học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho em suốt trình thực tập PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải tận tình dạy bảo, hướng dẫn, giúp đỡ động viên em suốt trình nghiên cứu thực khóa luận Kỹ sư Võ Khánh Hưng Nguyễn Phan Thành tận tình bảo hướng dẫn em trình thực đề tài Tập thể lớp Cơng nghệ Sinh học khóa 2007 bạn bè động viên giúp đỡ suốt q trình học tập thực khố luận Tp.HCM, ngày 07 tháng 07 năm 2011 Lê Thị Ngọc Bích i TÓM TẮT Đề tài thực với mục đích xây dựng quy trình chẩn đốn virút gây hội chứng còi cọc heo sau cai sữa (PMWS) - Porcine circovirus type kỹ thuật LAMP LAMP kỹ thuật đời vào năm 2000 có nhiều ưu điểm độ nhạy cao, nhanh tốn nên đánh giá có nhiều triển vọng chẩn đốn loại vi-rút Mẫu máu thu thập từ heo nghi ngờ mắc chứng PMWS trại heo công nghiệp ly trích để thu nhận DNA Phản ứng RealTime PCR thực để xác định mẫu dương tính với PCV2 Các mẫu với plasmid DNA sử dụng làm nguồn vật liệu cho việc thực phản ứng LAMP Plasmid DNA tách chiết từ plasmid pGEM – T Easy (3015 bp) chèn đoạn trình tự (492 bp) chứa vùng gene ORF1 PCV2 Việc xây dựng primer cho phản ứng LAMP thiết kế Internet PrimerExplorer V4 Bộ primer thiết kế dựa vùng gene ORF1 PCV2 đảm bảo yêu cầu nhiệt độ nóng chảy (Tm), %GC, khoảng cách primer, cấu trúc bậc hai tính ổn định đầu 3’, 5’ (∆G) Kết sau tiến hành phản ứng LAMP với primer để chẩn đốn PCV2 có sản phẩm đặc trưng chưa xác định độ đặc hiệu phương pháp Vì cần phải thực thêm số kỹ thuật khác để kiểm tra độ đặc hiệu xác định đọ nhạy phương pháp ii SUMMARY Thesis title: “Construct the procedure for diagnosing the virus causes PMWS Porcine circovirus type by LAMP” The purpose of this thesis is constructing a procedure for diagnosing the virus causes PMWS - Porcine circovirus type by LAMP LAMP was developed in 2000, highly sensitive, rapid, inexpensive technique This technique has great potential in diagnising the viruses Blood samples which collected from suspected of PMWS pigs in the farms were extracted to obtain DNA of PCV2 RealTime PCR reaction was performed to determine the samples positive for PCV2 They and plasmid DNA were the materials for the LAMP reactions Plasmid DNA was extracted from pGEM – T Easy (3015 bp) which was inserted ORF1 region of PCV2 Primers for the LAMP reactions were designed on the Internet PrimerExplorer V4 Primers were designed that based on the ORF1 region of PCV2 Primers must meet requirements of the melting temperature (Tm), %GC, the distance between the primers and ∆G There were products of the LAMP method but can not determine the specificity of the products Therefore, some other techniques need to to determine the specificity and the sensitive of this method iii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN iii TÓM TẮT ii SUMMARY iii MỤC LỤC iiv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH SÁCH CÁC BẢNG viii DANH SÁCH CÁC HÌNH .ix Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài .1 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 Giới thiệu hội chứng còi cọc heo sau cai sữa 2.1.1 Dịch tễ học bệnh còi cọc heo sau cai sữa 2.1.2 Triệu chứng bệnh còi cọc heo sau cai sữa 2.2 Porcine circovirus 2.2.1 Đặc điểm hình thái tính chất Porcine circovirus 2.2.2 Cấu trúc gen Porcine circovirus 2.3 Một số phương pháp chẩn đoán Porcine circovirus type 2.4 Phương pháp LAMP 2.4.1 Khái niệm phương pháp LAMP 2.4.2 Thành phần phản ứng LAMP 2.4.3 Nguyên tắc hoạt động phản ứng LAMP 10 2.4.4 Cách đọc kết phản ứng LAMP 13 2.4.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng LAMP 14 iv 2.5 Một số cơng trình nghiên cứu PCV2 LAMP nước 15 2.5.1 Các nghiên cứu nước 15 2.5.2 Các nghiên cứu nước 15 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Thời gian địa điểm .17 3.2 Nội dung nghiên cứu 17 3.3 Vật liệu, dụng cụ hóa chất 17 3.3.1 Dụng cụ thu thập mẫu 17 3.3.2 Hóa chất dùng ly trích DNA từ mẫu máu 17 3.3.3 Hóa chất dùng ly trích plasmid DNA 17 3.3.4 Hóa chất dùng phản ứng PCR với mẫu plasmid DNA 18 3.3.5 Dụng cụ hóa chất dùng phản ứng PCR 18 3.3.6 Hóa chất dùng phản ứng LAMP 18 3.3.7 Hóa chất dùng điện di 18 3.4 Phương pháp tiến hành 19 3.4.1 Thu nhận mẫu 19 3.4.2 Ly trích DNA từ mẫu máu 19 3.4.3 Kiểm tra nguồn vật liệu cho phản ứng LAMP 21 3.4.3.1 Tách chiết plasmid DNA 21 3.4.3.2 Điện di plasmid DNA 22 3.4.3.3 Thực phản ứng PCR với plasmid DNA 22 3.4.3.4 Giải trình tự để xác định plasmid có chứa vùng ORF1 23 3.4.4 Thực phản ứng LAMP với primer tự thiết kế 24 3.4.4.1 Thiết kế primer cho phản ứng LAMP vùng ORF1 PCV2 24 3.4.4.2 Khảo sát thời gian nhiệt độ phản ứng 26 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Kết thiết kế primer 27 4.2 Kết kiểm tra nguồn vật liệu cho phản ứng LAMP .30 4.3 Kết thực phản ứng LAMP phát PCV2 vùng ORF1 32 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34 5.1 Kết luận 34 v 5.2 Đề nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO .35 PHỤ LỤC vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT µl: micro liter AHL: Animal Health Laboratory dNTP: deoxynucleotide triphosphate EDTA: Ethylene diamine tetra acetic acid ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay LAMP: Loop – mediated isothermal amplification ml: mililiter ORF: Open reading frame PCR: Polymerase chain reaction PCV: Porcine circovirus PCV1: Porcine circovirus type PCV2: Porcine circovirus type PMWS: Post – Weaning Multisystemic Wasting Syndrome TBE: Tris borate EDTA vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Thành phần hóa chất cho PCR sử dụng Master Mix 2X .23 Bảng 3.2 Chu trình nhiệt cho PCR sử dụng PCV2-83F, PCV2-83R 23 Bảng 3.3 Thành phần hóa chất phản ứng LAMP .26 viii  Bước 4: Click vào chữ primer muốn hiển thị thông tin “Confirm” để hiển thị thơng tin primer Sử dụng phần mềm FastPCR để kiểm tra thông số primer Sử dụng công cụ BLAST trang chủ NCBI để kiểm tra độ tương đồng primer với genome heo, PCV, PRRS , từ chọn primer thích hợp 3.4.4.2 Khảo sát thời gian nhiệt độ phản ứng Thực phản ứng LAMP nhiệt độ 600C 50, 60 phút; 650C 50, 60 phút DNA mẫu plasmid DNA mẫu xác định dương tính với PCV2 nhờ phương pháp RealTime PCR Thành phần phản ứng dựa theo bảng 3.3 Bảng 3.3 Thành phần hóa chất phản ứng LAMP Thành phần H2O Nồng độ đầu Nồng độ cuối - Lượng hút/20 µl phản ứng - µl Thermopol buffer 10 X 1X µl MgSO 100 mM mM 1,2 µl Betaine 5M 0,8 mM 3,2 µl dNTP 10 mM mM µl F3 20 µM 0,2 µM 0,2 µl B3 20 µM 0,2 µM 0,2 µl FIP 20 µM 1,6 µM 1,6 µl BIP 20 µM 1,6 µM 1,6 µl Bst polymerase u/µl 8u µl DNA tempate - - µl 26 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết thiết kế primer Khi sử dụng PrimerExplore V4 để thiết kế primer, kết thu primer Sau xem xét thông số primer, primer primer chọn Trình tự primer chọn sau:  F3: 5’ - GGGACAACGGAGTGACCT - 3’  F2: 5’ - TGTTGGAGAGCGGGAGTC - 3’  F1c: 5’ - AGCCCGCGGAATTTCTGACAA - 3’  B1: 5’ - GTGAGCGGGAAAATGCAGAAGC - 3’  B2c: 5’ - GCTTTTACCACACCCAGGT - 3’  B3: 5’ - TCTGCAAAATTAGCAGCCCA - 3’ FIP = F1c +TTTT+ F2 BIP = B1 +TTTT+ B2c Sử dụng chương trình Bioedit kiểm tra vị trí primer genome vùng ORF1 PCV2 kết hình 4.1 4.2 Hình 4.1 Kết align primer F3 vùng ORF1 PCV2 27 Hình 4.2 Kết align F2 vùng ORF1 PCV2 Hình 4.3 Kết align F1 vùng ORF1 PCV2 28 Hình 4.4 Kết align B1 vùng ORF1 PCV2 Hình 4.5 Kết align B2 vùng ORF1 PCV2 29 Hình 4.6 Kết align B3 vùng ORF1 PCV2 4.2 Kết kiểm tra nguồn vật liệu cho phản ứng LAMP phát PCV2 vùng gene ORF1 Plasmid DNA sau tách chiết điện di với nồng độ mẫu là: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 Hình 4.7 Kết điện di plasmid DNA lad: ladder kbp Kết điện di cho thấy nồng độ mẫu 10-1 10-2 có xuất band dài khoảng 3,5 kbp Plasmid pGEM – T Easy có kích thước 3015 bp chèn thêm đoạn gene vùng ORF1 dài khoảng 492 bp tạo thành plasmid DNA có kích thước khoảng 30 3507 bp Như kích thước sản phẩm điện di phù hợp với kích thước plasmid DNA Hình 4.8 Kết align primer PCV2 – 83F PCV2 – 83R Khi thực phản ứng PCR với thành phần phần phản ứng theo bảng 3.1 quy trình nhiệt theo bảng 3.2, nồng độ mẫu plasmid là: 10-1, 10-3, 10-5, 10-7, 10-8 , điện di thấy tất mẫu xuất band khoảng gần 100bp Hình 4.9 Kết PCR với mẫu plasmid ladder: ladder 100 bp; 8:10-1;6:10-3; 4:10-5;2:10-7; 1:10-8 Từ kết điện di DNA plasmid, PCR mẫu plasmid kết giải trình tự theo cơng ty Nam Khoa chứng minh vùng gene ORF1 chèn vào 31 plasmid Vậy sử dụng plasmid làm vật liệu cho việc thực phản ứng LAMP phát PCV2 vùng gene ORF1 4.3 Kết thực phản ứng LAMP phát PCV2 vùng ORF1 Phản ứng LAMP thực với primer thiết kế dùng để phát PCV2 dựa vùng ORF1với thành phần bảng 3.3, khảo sát 600C 650C, 50 60 phút Hình 4.10 Kết LAMP lần 1: mẫu nước, ủ 650C/ 50 phút; 2: mẫu 7, ủ 650C/ 50 phút; 3: mẫu plasmid, ủ 650C/ 50 phút; 4: mẫu nước, ủ 650C/ 60 phút; 5: mẫu 7, ủ 650C/ 60 phút; 6: mẫu plasmid, ủ 650C/ 60 phút; 7: mẫu nước, ủ 600C/ 50 phút; 8: mẫu 7, ủ 600C/ 50 phút; 9: mẫu plasmid, ủ 600C/ 50 phút; 10: mẫu nước, ủ 600C/ 60 phút; 11: mẫu 7, ủ 600C/ 60 phút; 12: mẫu plasmid, ủ 600C/ 60 phút; 13: mẫu 8, ủ 600C/ 60 phút Kết điện di thực phản ứng LAMP lần với mẫu nước, plasmid, 7, (mẫu 7, xác định dương tính với vùng ORF1 PCV2 nhờ phương pháp RealTime PCR) cho thấy phản ứng LAMP có xảy mẫu nước, plasmid Hiện tượng mẫu nước có sản phẩm sau chạy phản ứng LAMP điều bất thường Có lẽ mẫu nước bị nhiễm DNA từ bên ngồi, vậy, mẫu nước thay đổi thực phản ứng LAMP lần (nước elicot từ ống gốc RNase – free water hãng Promega sản xuất bảo quản tủ mát 40C) 32 Hình 4.11 Kết LAMP lần 1: ladder 100 bp; 2: mẫu nước, ủ 600C/ 50 phút; 3: mẫu 8, ủ 600C/ 50 phút; 4: mẫu 8, ủ 600C/ 60 phút; 5: mẫu 8, ủ 650C/ 50 phút; 6: mẫu 8, ủ 650C/ 60 phút; 7: mẫu 7, ủ 600C/ 50 phút; 8: mẫu 7, ủ 600C/ 60 phút; 9: mẫu 7, ủ 650C/ 50 phút; 10: mẫu 7, ủ 650C/ 60 phút; 11: mẫu nước, ủ 600C/ 60 phút; 12: mẫu nước, ủ 650C/ 50 phút; 13: mẫu plasmid, ủ 600C/ 50 phút; 14: mẫu plasmid, ủ 600C/ 60 phút; 15, 16: mẫu plasmid, ủ 650C/ 50 phút; 17, 18: mẫu plasmid, ủ 650C/ 60 phút Kết điện di lần cho thấy phản ứng LAMP không xảy mẫu nước mẫu Mẫu nước lần cho sản phẩm LAMP nên có khả mẫu nước mẫu dương tính giả (mẫu nước để chung với hóa chất khác sử dụng cho số phản ứng trước nên nhiễm DNA từ bên từ mẫu khảo sát) Dựa theo kết lần thực phản ứng cho thấy phản ứng xảy nhiệt độ 600C 650C Như khoảng nhiệt độ mà Bst polymerase hoạt động tốt nhiệt độ khơng ảnh hưởng nhiều đến phản ứng Phản ứng LAMP xảy hai thời gian khảo sát ( 50 60 phút), khoảng thời gian phù hợp cho phản ứng Theo nên tiến hành phản ứng 600C 60 phút 650C 50 phút (vì theo kết điện di, band sáng rõ thực phản ứng hai điều kiện này) Vấn đề đặt chưa kiểm tra độ đặc hiệu độ nhạy phương pháp LAMP chẩn đoán PCV2 dựa primer thiết kế vùng ORF1 33 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Phản ứng LAMP chẩn đoán PCV2 vùng ORF1 với primer thiết kế có xảy Phản ứng LAMP nhạy phát PCV2 dễ xảy tượng mẫu dương tính giả Nhiệt độ phản ứng LAMP thực 600C 650C Thời gian thực phản ứng LAMP khoảng từ 50 – 60 phút 5.2 Đề nghị Cần thực số phản ứng khác để đánh giá độ đặc hiệu độ nhạy phương pháp LAMP thực hiện, từ sử dụng quy trình để áp dụng vào việc chẩn đốn mẫu thực địa Khi tiến hành thí nghiệm cần lưu ý đến việc bảo quản mẫu, primer hóa chất khác nhằm tránh tượng nhiễm chéo mẫu; đặc biệt cần kiểm tra primer trước sử dụng 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nước Nguyễn Tiến Dũng 2008 Quy trình sinh phẩm phát WSSV phương pháp LAMP http://agrobiotech.gov.vn Nguyễn Ngọc Hải 2007 Công nghệ sinh học thú y Nhà xuất Nơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh Phạm Thị Huyền Trang 2010 Khảo sát nhiễm PCV2 loại mẫu: huyết thanh, hạch phân từ heo còi kỹ thuật PCR Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Tài liệu nước Andre L Hamel, Lihua L Lin, And Gopi P S Nayar 1998 Nucleotide Sequence of Porcine Circovirus Associated with Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome in Pigs Journal of Virology 72: 5262-5267 Caprioli A, McNeilly F, McNair I, Lagan-Tregaskis P, Ellis J, Krakowka S, McKillen J, Ostanello F, Allan G 2006 PCR detection of porcine circovirus type (PCV2) DNA in blood, tonsillar and faecal swabs from experimentally infected pigs Ret Ves Sci 81: 287-292 Cheung AK, Lager KM, Kohutyuk OI, Vincent LA, Henry SC, Baker RB, Rowland RR and Dunham AG 2007 Detection of two porcine circovirus type genotypic groups in United States swine herds Arch Virol 152: 1035-1044 Ellis J, Krakowka S, Haines D, Bratanich A, Clark E, Allan G, Konoby C, Hassard L, Meehan B, Martin K, Harding J, Kenedy S and McNeily F 1999 Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic piglets J Vet Diagn Invest 11: 3-14 Florence Faurez, Daniel Dory, Béatrice Grasland and André Jestin 2009 Replication of porcine circoviruses Virology Journal 6:60 Gordon M Allan and John A Ellis 2004 Porcine circoviruses: a review J Vet Diagn Invest 12: 3-14 10 Hao-tai Chen, Jie Zhang, De-hui Sun, Yue-feng Chu, Xue-peng Cai, Xiang-tao Liu, Xye-nong Luo, Qing Liu and Yong-sheng Liu 2008 Rapid detection of Porcine circovirus type by Loop-mediated isothermal amplification J.Virological Method 149: 264-268 11 Jaret Bogdan, Keith West, Edward Clark, Carrie Konoby, Deborah Haines, Gordon Allan, Francis McNeilly, Brian Meehan, Steven Krakowka and John A Ellis 2001 Association of porcine circovirus with reproductive failure in pigs: a retrospective study, 1995-1998 Can Vet J 42 : 548-550 35 12 John C.S Harding and Edward G Clark Recognizing and diagnosing postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) Swine Health and Production: 201-203 13 Kathleen A McIntosh, Anju Tumber, John C.S Harding, Steven Krakowka, John A Ellis and Janet E Hill 2009 Development and validation of a SYBR green real-time PCR for the quantification of porcine circovirus type in serum, buffy coat, feces, and multiple tissues Veterinary Microbiology 133: 2333 14 Kwang Soo Lyoo, Hyeun Bum Kim and Han Soo Joo 2009 Evalution of a nested polymersae chain reaction assay to differentiate between two genotypes of Porcine circovirus-2 Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 20: 283288 15 Lam Thi Thu Huong and Duong Chi Mai 2005 Detection of Porcine circovirus from lessiions of Post Weaning-Pig with wasting disease at some farms in Ho chi Minh city and adjacent provinces Proceedings of International Workshop on Biotechnology in Agriculture 16 Larochelle R, Antaya M, Morin M and Magar R 1999 Typing of porcine circovirus in clinical specimens by multiplex PCR Journal of Viroligical Methods 80: 69-75 17 Libin Wen, Xin Guo and Hanchun Yang 2005 Genotyping of porcine circovirus type from a variety of clinical conditions in China Vet Micobiol 110: 141-146 18 Ouardani, Wilson, R Jetté, Montpetit, and Dea 1999 Multiplex PCR for Detection and Typing of Porcine Circoviruses J Clin Microbiol 37: 3917-3924 19 Tischer I, Rasch R, Tochtermann G 1974 Characterization of papovavirus- and picornavirus-like particles in permanent pig kidney cell lines Zbl Bakt Hyg I Abt Orig A 226: 153-167 20 Tsugunori Notomi, Hiroto Okayama, Harumi Masubuchi, Toshihiro Yonekawa, Keiko Watanabe, Nobuyuki Amino and Tetsu Hase 2000 Loopmediated isothermal amplification of DNA Oxford Journal 28: 63 36 PHỤ LỤC Phụ lục Kết giải trình tự theo cơng ty Nam Khoa C1SP6 (626bp) TTGGGAGCTCTCCCATATGGTCGACCTGCAGGCGGCCGCG AATTCACTAGTGATTTGGTAACCATCCCACCACTTGTTTCTAGG TGGTTTCCAGTATGTGGTTTCCGGGTCTGCAAAATTAGCAGCCC ATTTGCTTTTGCCACACCCAGGTGGCCCCACAATGACGTGTACA TTCGTCTTCCAATCACGCTTCTGCATTTTCCCGCTCACTTTCAAA AGTTCAGCCAGCCCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACAGGGT GCTGCTCTGCAACGGTCACCAGACTCCCGCTCTCCAACAAGGTA CTCACAGCAGTAGAGAGGTCACTCCGTTGTCCTTGAGATCTAGG AGCTCCACATTCTATCAGTAAGTTGCCTTCTTTACTGCAATATTC TTTATTCTGCTGATCTGTTCCTTTCGCTTTCTCGATGTGGCAGCG GGCACCAAAATACCACTTCACTTTATTAAAAGTTTGCTTCTTCA CAAAATTAGCGAACCCCTGTAGGTGGGGTGTTCGGCCCTCCTCA TTACCCTCCTCGCCAACAATAAATCGAATTCCCGCGGCCGCCAT GGCGGCCGGGAGCATGCGACGTCGGGCCCAATTCGCCCTATAG TGAGTCGTATTAA Phụ lục Kết BLAST NCBI Length=1767 Score = 907 bits (491), Expect = 0.0 Identities = 493/494 (99%), Gaps = 0/494 (0%) Strand=Plus/Minus Query56TGGTAACCATCCCACCACTTGTTTCTAGGTGGTTTCCAGTATGTGGTTTCCGGGTCTG CA 115 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 670 TGGTAACCATCCCACCACTTGTTTCTAGGTGGTTTCCAGTATGTGGTTTCCGGGTCTGCA 611 Query 116 AAATTAGCAGCCCATTTGCTTTTGCCACACCCAGGTGGCCCCACAATGACGTGTACATTC 175 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 610 AAATTAGCAGCCCATTTGCTTTTGCCACACCCAGGTGGCCCCACAATGACGTGTACATTC 551 Query 176 GTCTTCCAATCACGCTTCTGCATTTTCCCGCTCACTTTCAAAAGTTCAGCCAGCCCGCGG 235 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 550 GTCTTCCAATCACGCTTCTGCATTTTCCCGCTCACTTTCAAAAGTTCAGCCAGCCCGCGG 491 Query 236 AAATTTCTGACAAACGTTACAGGGTGCTGCTCTGCAACGGTCACCAGACTCCCGCTCTCC 295 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 490 AAATTTCTGACAAACGTTACAGGGTGCTGCTCTGCAACGGTCACCAGACTCCCGCTCTCC 431 Query 296 AACAAGGTACTCACAGCAGTAGAGAGGTCACTCCGTTGTCCTTGAGATCTAGGAGCTCCA 355 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 430 AACAAGGTACTCACAGCAGTAGAGAGGTCACTCCGTTGTCCTTGAGATCTAGGAGCTCCA 371 Query 356 CATTCTATCAGTAAGTTGCCTTCTTTACTGCAATATTCTTTATTCTGCTGATCTGTTCCT 415 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 370 CATTCTATCAGTAAGTTGCCTTCTTTACTGCAATATTCTTTATTCTGCTGATCTGTTCCT 311 Query 416 TTCGCTTTCTCGATGTGGCAGCGGGCACCAAAATACCACTTCACTTTATTAAAAGTTTGC 475 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct TTCGCTTTCTCGATGTGGCAGCGGGCACCAAAATACCACTTCACTTTATTAAAAGTTTGC 251 310 Query 476 TTCTTCACAAAATTAGCGAACCCCTGTAGGTGGGGTGTTCGGCCCTCCTCATTACCCTCC 535 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||| Sbjct 250 TTCTTCACAAAATTAGCGAACCCCTGTAGGTGGGGTGTTCGGCCCTCCTCATTACCTTCC 191 Query 536 TCGCCAACAATAAA 549 |||||||||||||| Sbjct 190 TCGCCAACAATAAA 177 Phụ lục Bảng chu kỳ ngưỡng số ban đầu Mẫu Sample 1 2 3 5 6 7 8 9 10 10 11 11 12 12 15 15 chu kỳ ngưỡng Ct Threshold Cycle ( C(t) ) 26.57 26.17 25.36 22.98 22.94 23.62 39.45 39.86 24.72 24.32 25.26 25.09 25.58 26.11 24.22 24.06 24.35 24.3 25.06 24.96 37.65 27.3 26.18 35.98 Số ban đầu Starting Quantity (SQ) 2.58E+02 3.61E+02 7.24E+02 5.49E+03 5.69E+03 3.19E+03 4.37E-03 3.06E-03 1.25E+03 1.75E+03 7.87E+02 9.12E+02 5.99E+02 3.80E+02 1.92E+03 2.19E+03 1.71E+03 1.79E+03 9.32E+02 1.02E+03 2.02E-02 1.38E+02 3.58E+02 8.41E-02 Phụ lục Bảng nhiệt độ nóng chảy Mẫu 1 5 6 7 8 9 10 10 11 11 12 12 15 Phụ lục Đường cong nhiệt độ nóng chảy Nhiệt độ nóng chảy 80.2 80.2 80.2 80.4 80 80 80.2 80.2 80.4 80.2 80.2 80.2 80.4 80.4 80.2 80.2 80.2 80.2 80 80.2 80.2 ... châu Âu cho thấy 96% trình tự nucleotide tương đồng ORF1 PCV1 có kích thước 936 nucleotide PCV2 có kích thước 942 nucleotide, tương đồng khoảng 83% trình tự nucleotide (Nguyễn Ngọc Hải, 2007)... primer tự thi t kế 24 3.4.4.1 Thi t kế primer cho phản ứng LAMP vùng ORF1 PCV2 24 3.4.4.2 Khảo sát thời gian nhiệt độ phản ứng 26 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Kết thi t... 2000, highly sensitive, rapid, inexpensive technique This technique has great potential in diagnising the viruses Blood samples which collected from suspected of PMWS pigs in the farms were extracted