ỨNG DỤNG kĩ THUẬT GIẢI TRÌNH tự GEN THẾ hệ mới TRONG xác ĐỊNH KIỂU GEN một số CHỦNG VIRUS VIÊM GAN c tại BỆNH VIỆN BỆNH NHIỆT đới TRUNG ƯƠNG năm 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI LÊ THỊ DUYÊN ỨNG DỤNG KĨ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI TRONG XÁC ĐỊNH KIỂU GEN MỘT SỐ CHỦNG VIRUS VIÊM GAN C TẠI BỆNH VIỆN BỆNH NHIỆT ĐỚI TRUNG ƯƠNG NĂM 2015 ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC HÀ NỘI – 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI LÊ THỊ DUYÊN ỨNG DỤNG KĨ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI TRONG XÁC ĐỊNH KIỂU GEN MỘT SỐ CHỦNG VIRUS VIÊM GAN C TẠI BỆNH VIỆN BỆNH NHIỆT ĐỚI TRUNG ƯƠNG NĂM 2015 Chuyên ngành: Vi sinh y học Mã số: 60720115 ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS LÊ THỊ HỘI HÀ NỘI – 2017 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT HCV (Hepatitis C virus) : virus viêm gan C HCC (Hepatocellular Carcinoma) : ung thư tế bào gan NAT (Nucleic acid amplification) : thử nghiệm khuếch đại acid nucleic WHO (World Health Organrination) : Tổ chức Y tế giới DAAs (Direct acting Antivirals) : thuốc kháng virus trực tiếp LVP (Lipo – viro – particles) : hạt lipoprotein – virus ORF (Open reading frame) : khung đọc mở UTRs (Untranslated regions) : vùng không dịch mã NS (Non structural) : gen không cấu trúc RDRP (RNA – dependent RNA : polymerarase RNA phụ thuộc polymerase) DNA RNA NGS (Next Generation Sequencing) RT PCR (Reverse Transcription Primer Chain Reaction) RNA : Deoxyribonucleic acid : Ribonucleic acid : giải trình tự gen hệ : PCR phiên mã ngược MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tình hình bệnh viêm gan virus C 1.2 Virus viêm gan C .6 1.2.1 Cấu trúc hạt virus viêm gan C 1.2.2 Cấu trúc gen virus viêm gan C .7 1.2.3 Các kiểu gen virus viêm gan C 1.3 Vai trò xác định kiểu gen HCV điều trị .10 1.4 Các phương pháp xác định kiểu gen HCV 11 1.4.1 Phương pháp lai đầu dò (Line Probe Assay – LiPA) .11 1.4.2 Realtime PCR (Realtime Primer Chain Reaction) 12 1.4.3 Giải trình tự gen phương pháp Sanger 12 1.4.4 Giải trình tự gen hệ NGS (Next Generation Sequencing) .14 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .17 2.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 17 2.3 Quy trình nghiên cứu 17 2.4 Thiết kế nghiên cứu 18 CHƯƠNG 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ 20 3.1 Đặc điểm chung bệnh nhân nghiên cứu 20 3.2 Tỷ lệ kiểu gen kiểu gen phụ HCV dựa phương pháp giải trình tự gen hệ NGS 21 3.2.1 Kết phân tích kiểu gen HCV phương pháp NGS 22 3.2.2 Tỷ lệ kiểu gen HCV .21 3.2.3 Tỷ lệ kiểu gen phụ HCV 22 3.3 Tỷ lệ kiểu gen kiểu gen phụ HCV dựa phương pháp Sanger .22 3.3.1 Tỷ lệ kiểu gen HCV .22 3.3.2 Tỷ lệ kiểu gen phụ HCV 23 3.4 So sánh giải trình tự gen HCV phương pháp NGS Sanger 23 CHƯƠNG 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN 24 DỰ KIẾN KẾT LUẬN 24 DỰ KIẾN KHUYẾN NGHỊ 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Nội kiểm quy trình xét nghiệm……………………….………… 18 Bảng 3.1 Kết phân tích kiểu gen HCV phương pháp NGS 21 Bảng 3.2 Tỷ lệ kiểu gen HCV 21 Bảng 3.3 Tỷ lệ kiểu gen phụ HCV .22 Bảng 3.4 Tỷ lệ kiểu gen HCV 21 Bảng 3.5 Tỷ lệ kiểu gen phụ HCV 22 Bảng 3.6 Kết kiểu gen HCV dựa phương pháp NGS Sanger 21 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Phân bố bệnh theo nhóm tuổi .20 Biểu đồ 3.2 Phân bố bệnh theo giới .20 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Diễn biến tự nhiên nhiễm HCV Hình 1.2 Cấu trúc HCV Hình 1.3 Cấu trúc gen HCV Hình 1.4 Cây phát sinh chủng loại HCV Hình 1.5 Sự phân bố genotype HCV toàn giới Hình 1.6 Đích tác dụng thuốc DAAs .11 Hình 1.7 Quy trình giải trình tự gen NGS 15 Hình 2.1 Quy trình nghiên cứu .17 Hình 2.2 Thiết kế nghiên cứu .18 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh viêm gan virus C bệnh truyền nhiễm virus viêm gan C (HCV) gây Mặc dù biểu lâm sàng nhiễm HCV cấp thường nhẹ triệu chứng HCV gây viêm gan cấp, viêm gan mạn, tiến triển thành xơ gan, chí ung thư tế bào gan (HCC) dẫn đến tử vong [1],[2] Theo ước tính nghiên cứu Gánh nặng bệnh tật toàn cầu Tổ chức Y tế giới (Global Burden of Disease), số ca tử vong viêm gan C 333.000 vào năm 1990, 499.000 vào năm 2010 704.000 vào năm 2013 [3],[4] Năm 2015, tổng kết số người nhiễm HCV mạn tính lên tới 71 triệu người, tương đương với số bệnh nhân viêm gan virus C cần điều trị, gánh nặng bệnh tật cho toàn xã hội [5] Sự đời thuốc điều trị viêm gan virus C, đặc biệt thuốc tác động trực tiếp tới virus DAAs (Direct Acting Antivirals) giúp cải thiện đáng kể tình trạng bệnh, giảm tỷ lệ biến chứng tử vong giảm chi phí điều trị Tuy nhiên, việc lựa chọn phác đồ điều trị HCV liên quan mật thiết tới kiểu gen HCV, đặc biệt số phác đồ đòi hỏi phải xác định tới kiểu gen phụ virus [2] Do tầm quan trọng việc xác định kiểu gen HCV trước lựa chọn phác đồ điều trị, nhiều phương pháp xác định kiểu gen HCV đời sau phát virus viêm gan C vài năm Một số phương pháp thường sử dụng lai đầu dò, Realtime PCR, giải trình tự gen phương pháp Sanger, phương pháp Sanger xem tiêu chuẩn vàng chẩn đoán xác định kiểu gen HCV Tuy nhiên, nhược điểm phương pháp cần nhiều mẫu cho lần chạy, chi phí cao, thời gian để có kết dài so với phương pháp khác [6] Bên cạnh đó, dịch tễ bệnh nhân bị nhiễm HCV tập trung chủ yếu vào nhóm nguy cao, bao gồm bệnh nhân chạy thận nhân tạo, tiêm chích ma túy, truyền máu [7] Những đối tượng dễ bị nhiễm nhiều kiểu gen HCV Đây vấn đề mà phương pháp Sanger giải Trong năm gần đây, số phương pháp giải trình tự gen đời, gọi phương pháp giải trình tự gen hệ (Next Generation Sequencing – NGS), giúp khắc phục số nhược điểm phương pháp Sanger NGS có khả tạo khối lượng liệu khổng lồ, khả cung cấp thơng tin gen xác, nhanh chóng, đặc biệt cho phép xác định đa nhiễm nhiều kiểu gen hay kiểu gen phụ HCV bệnh nhân [7] Để tìm hiểu khả ứng dụng NGS giải trình tự gen HCV, tiến hành nghiên “Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen hệ xác định kiểu gen số chủng virus viêm gan C Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương năm 2015” với mục tiêu: Xác định tỷ lệ genotype subtype HCV dựa phương pháp giải trình tự gen hệ NGS So sánh giải trình tự gen HCV phương pháp NGS Sanger CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tình hình bệnh viêm gan virus C Bệnh viêm gan virus C bệnh truyền nhiễm virus viêm gan C (HCV) gây HCV gây viêm gan cấp, viêm gan mạn, tiến triển thành xơ gan, ung thư tế bào gan (HCC) HCV nguyên hàng đầu gây bệnh gan mạn tính Bệnh lây nhiễm qua đường máu, tình dục, mẹ truyền sang [1],[2] Phần lớn bệnh khơng có triệu chứng lâm sàng có biểu xơ gan, đơi có mệt mỏi, chán ăn, đầy bụng, đau nhẹ hạ sườn phải, rối loạn tiêu hóa, đau [1],[2] 15 – 45% số người mắc HCV cấp tính tự khỏi vòng tháng 55 – 85% mắc HCV suốt phần đời lại hay gọi nhiễm HCV mãn tính khơng điều trị Các kháng thể chống lại HCV xuất từ giai đoạn cấp tính tồn suốt đời Ở người có kháng thể HCV, cần phải kiểm tra nồng độ acid nucleic (NAT) HCV RNA, phát diện virus để phục vụ cho chẩn đoán điều trị [8],[9] Trong số người bị nhiễm HCV mãn tính, nguy xơ gan 15 – 30% vòng 20 năm [10],[11],[12] Nguy ung thư tế bào gan người bị xơ gan xấp xỉ – 4% năm [13] 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y tế (2016) Hướng dẫn chẩn đoán điều trị viêm gan vi rút C ban hành kèm theo Quyết định số 5012/QĐ – BYT ngày 20/ 9/ 2016 Bộ trưởng Bộ Y tế WHO (2016) Guidelines for the screening, care and treatment of persons with chronic hepatitis C infection Lozano R, Naghavi M, Foreman K, et al (2012) Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010 Lancet, 380 (9859), 2095–128 GBD Mortality and Causes of Death Collaborators (2015) Global, regional, and national age – sex specific all-cause and cause-specific mortality for 240 causes of death, 1990–2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013 Lancet, 385(9963), 117–71 WHO (2017)  Global Hepatitis Report, 2017 http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs164/en/ Michael S forman, Alexandra V (2015) Hepatitis C virus Manual of Clinical Microbiology 7th, ASM Press, Washington Phạm Song (2009) Viêm gan virus B, D, C, A, E, GB bản, đại cập nhật NXB Y học, Hà Nội Thomson EC, Fleming VM, Main Jet al (2011) Predicting spontaneous clearance of acute hepatitis C virus in a large cohort of HIV – Infected men, 60(6), 837–45 Gerlach JT, Diepolder HM, Zachoval R et al (2003) Acute hepatitis C: high rate of both spontaneous and treatmentinduced viral clearance Gastroenterology, 125(1), – 80 10 Tong MJ, Elfarra NS, Reikes AR, Co RL Clinical outcomes after transfusionassociated hepatitis – C(1995) N Engl J Med, 332(22), – 1463 11 Tremolada F, Casarin C, Alberti A, et al (1992) Long-term follow-up of non-A, non-B (type C) post-transfusion hepatitis J Hepatol, 16(3), 81 – 273 12 Thein HH, Yi Q, Dore GJ, Krahn MD (2008) Estimation of stagespecific fibrosis progression rates in chronic hepatitis C virus infection: a meta-analysis and meta-regression Hepatology, 48(2), 31 – 418 13 El-Serag HB, Rudolph KL (2007) Hepatocellular carcinoma: epidemiology and molecular carcinogenesis Gastroenterology,132(7), 76 – 2557 14 Razavi H, Waked I, Sarrazin C et al (2014) The present and future disease burden of hepatitis C virus (HCV) infection with today’s treatment paradigm J Viral Hepatitis, 21, 34–59 15 Mohd Hanafiah K, Groeger J, Flaxman AD, Wiersma ST (2013) Global epidemiology of hepatitis C virus infection: new estimates of agespecific antibody to HCV seroprevalence Hepatology, 57(4), 42 – 1333 16 Gower E, Estes C, Blach S, Razavi-Shearer K, Razavi H (2014) Global epidemiology and genotype distribution of the hepatitis C virus infection J Hepatol, 61, 45–57 17 Tang H, Grisé H (2009) “Cellular and molecular biology of HCV infection and hepatitis” Clinical Science, 14(2), 49–65 18 Nguyen VT, McLaws ML, Dore GJ (2007), “Prevalence and risk factors for hepatitis C infection in rural north Vietnam”, Hepatology international, 1, 387–393 19 Clatts MC, Colon – Lopez V, Giang le M, Goldsamt LA (2010) “Prevalence and incidence of HCV infection among Vietnam heroin users with recent onset of injection”, Journal of urban health : bulletin of the New York Academy of Medicine, 87, 278–291 20 Parekh PJ, Shiffman ML (2014) The role of interferon in the new era of hepatitis C treatments Expert Rev Gastroenterol Hepatol, 8(6), 56 – 649 21 Schinazi R, Halfon P, Marcellin P, Asselah T (2014) HCV direct – acting antiviral agents: the best interferon-free combinations Liver InT, 34, 69– 78 22 Bradley DW, McCaustland KA, Cook EH, Schable CA, Ebert JW, Maynard JE (1985) Posttransfusion non – A, non – B hepatitis in chimpanzees Physicochemical evidence that the tubule – forming agent is a small, enveloped virus Gastroenterology, 88, 773–779 23 Gastaminza P, Dryden KA, Boyd B et al (2010) Ultrastructural and biophysical characterization of hepatitis C virus particles produced in cell culture J Virol, 84, 10999–11009 24 Nicolas Goosens (2016) The HCV particle and its life cycle Handbook of Hepatitis C 25 Bradley D, McCaustland K, Krawczynski K (1991) Hepatitis C virus: buoyant density of the factor VIII – derived isolate in sucrose J Med Virol, 34, 206 –208 26 Thomssen R, Bonk S, Thiele A (1993) Density heterogeneities of hepatitis C virus in human sera due to the binding of beta – lipoproteins and immunoglobulins Med Microbiol Immunol (Berl), 182, 329 –334 27 Andre P, Komurian-Pradel F, Deforges S et al (2002) Characterization of low – and very – low – density hepatitis C virus RNA – containing particles J Virol, 76, 6919–6928 28 Simmonds P, Bukh J, Combet C and et al (2005) Consensus proposals for a unified system of nomenclature of hepatitis C virus genotypes Hepatology, 42,962–973 29 Smith DB, Bukh J, Kuiken C, et al 2014 Expanded classification of hepatitis C virus into genotypes and 67 subtypes: updated criteria and genotype assignment web resource Hepatology, 59, 318–327 30 Ohno, T et al (1997) New hepatitis C virus (HCV) genotyping system that allows for identification of HCV genotypes 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 3b, 4, 5a, and 6a J Clin Microbiol, 35, 201–207 31 Simmonds, P et al (1994) Geographical distribution of hepatitis C virus genotypes in blood donors: An international collaborative survey J Clin Microbiol, 32, 884– 892 32 Alter, M J et al (1999) The prevalence of hepatitis C virus infection in the United States, 1988 through 1994 N Engl J Med, 341, 556–562 33 Cornberg, M et al (2011) A systematic review of hepatitis C virus epidemiology in Europe Canada and Israel Liver Int, 31, 30–60 34 Esteban, J I., Sauleda, S & Quer, J (2008) The changing epidemiology of hepatitis C virus infection in Europe J Hepatol, 48, 148–162 35 Kaba, S et al (1998) Molecular epidemiology of hepatitis C in Australia J Gastroenterol Hepatol, 13, 914–920 36 Chlabicz, S et al (2008) Changing HCV genotypes distribution in Poland—Relation to source and time of infection J Clin Virol, 42, 156– 159 37 Tallo, T et al (2007) Genetic characterization of hepatitis C virus strains in Estonia: Fluctuations in the predominating subtype with time J Med Virol, 79, 374–382 38 Katsoulidou, A et al (2006) Molecular epidemiology of hepatitis C virus (HCV) in Greece: Temporal trends in HCV genotype-specific incidence and molecular characterization of genotype isolates J Viral Hepat, 13, 19–27 39 Kamal, S M & Nasser, I A (2008) Hepatitis C genotype 4: What we know and what we don’t yet know Hepatology, 47, 1371–138 40 Shobokshi, O A., Serebour et al (1999) Hepatitis C genotypes and subtypes in Saudi Arabia J Med Virol, 58, 44–48 41 Antaki, N et al (2009) The unexpected discovery of a focus of hepatitis C virus genotype in a Syrian province Epidemiol Infect, 137, 79–84 42 Murphy, D G et al (1996) Biological and clinicopathological features associated with hepatitis C virus type infections J Hepatol, 24, 109– 113 43 Duc, A P et al (2009) High prevalence of hepatitis C virus genotype in Vietnam Asian Pac J Allergy Immunol, 27, 153–160 44 Li, C S Y., Chan, P K S & Tang, J W (2009) Molecular epidemiology of hepatitis C genotype 6a from patients with chronic hepatitis C from Hong Kong J Med Virol, 81, 628–633 45 Yan, Z et al (2012) Changing pattern of clinical epidemiology on hepatitis C virus infection in Southwest China Hepatitis Monthly 12, 196–204 46 Hồ Tấn Đạt, Phạm Thị Thu Thủy cs (2005) Kiểu gen virus viêm gan C Việt Nam TT Y Khoa Medic 47 Behzad Hajarizadeh, Jason Grebely and Gregory J Dore (2013) “Epidemiology and natural history of HCV infection” Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology” 48 LawitzE, MangiaA, WylesD, Rodriguez-TorresM et al (2013) Sofosbuvir for previously untreated chronic hepatitis C infection N Engl J Med, 368, 1878 –1887 49 Jacobson IM, Mc Hutchison JG, et al (2011).Telaprevir for previously untreated chronic hepatitis C virus infection N Engl J Med, 364, 2405 – 2416 50 Zeuzem S, Soriano V, Asselah T, Bronowicki JP et al (2013) Faldaprevir and deleobuvir for HCV genotype infection N Engl J Med, 369, 630 – 639 51 Asma Ahmed, and Daniel J Felmlee (2015) Viruses, UK, 7(12), 6716 – 6729 52 Josep Quer, Josep Gregori, Francisco Rodríguez – Frias et al (2015) “High-Resolution Hepatitis C Virus Subtyping Using NS5B Deep Sequencing and Phylogeny, an Alternative to Current Methods” Journal of Clinical Microbiology, 53(1), 219–226 53 Mallory MA, Lucic DX, Sears MT,et al (2014) Evaluation of the Abbott RealTime HCV genotype II RUO (GT II) assay with reference to 5′UTR, core and NS5B sequencing J Clin Virol, 60, 22–26 54 Gonzalez V, Gomes – Fernandes M, Bascunana E, et al (2013) Accuracy of a commercially available assay for HCV genotyping and subtyping in the clinical practice J Clin Virol, 58, 249–253 55 F Sanger, S Nicklen, and A R Coulson (1977) DNA sequencing with chain – terminating inhibitors Proc Natl Acad Sci U S A, 74 (12), 5463– 5467 56 Marina Barba , Henryk Czosnek , Ahmed Hadidi (2014) Historical Perspective, Development and Applications of Next – Generation 57 Sequencing in Plant Virology Viruses, 6(1), 106–136 Cameron Wales, George Corpus, and ChungChe Chang (2017) Hepatitis C Virus Genotyping Using Next-Generation Sequencing: An Efficient Alternative to Sanger Sequencing Archives of Pathology & Laboratory Medicine: March 2017, 141 (3), 323 – 324 58 Qingxian Cai, Zhixin Zhao, Ying Liu et al (2013) Comparison of three different HCV genotyping methods: Core, NS5B sequence analysis and line probe assay International journal of molecular medicine, 31, 347 – 352 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Quy trình xét nghiệm áp dụng nghiên cứu Quy trình giải trình tự gen phương pháp Sanger 1.1 Điện di kiểm tra sản phẩm - Các mẫu sau hoàn tất Nested PCR điện di gel agarose - 1,2% để kiểm tra sản phẩm (sử dụng thuốc nhuộm Gelred) Thành phần giếng điện di sau: 5µl sản phẩm PCR (hoặc Maker), - 1.5 µl Loading Dye Trộn tra mẫu vào giếng Điện di với cường độ dòng điện 100V 30 phút - Đọc phân tích kết điện di máy soi gel 1.2 Tinh sản phẩm PCR Sản phẩm PCR sau kiểm tra gel agarose 1,2 % tinh kit PureLink® PCR Purification Kit (Invitrogen/ ThermoFisher Scientific) Quy trình thực sau: 1) Cho lần thể tích PureLink® Binding Buffer (B2) cho thể tích sản phẩm PCR (50–100 μl) Trộn 2) Chuyển mẫu lên cột lọc có ống hứng Ly tâm 10.000g phút Thay ống hứng 3) Cho 650 μl Wash Buffer Ly tâm 10.000g phút Thay ống hứng 4) Ly tâm tốc độ tối đa 20.000g – phút để loại hết Wash Buffer Chuyển cột lọc sang ống 1.5 ml 5) Cho 50 μl of Elution Buffer Ủ nhiệt độ phòng phút 6) Ly tâm tốc độ tối đa phút Loại bỏ cột lọc, đóng nắp ống Bảo quản sản phẩm sau tinh -20oC sử dụng cho ứng dụng mong muốn 1.3 Xác định trình tự gen  Phản ứng PCR sequencing - Sử dụng sinh phẩm BigDye Terminator v3.1 Sequencing Kit để thực - phản ứng PCR Hỗn hợp phản ứng: ST Thành phần Thể tích (20 µl) T BigDye™ Terminator 3.1 Ready Reaction Mix µl BigDye™ Terminator v1.1 & v3.1 5X µl Sequencing Buffer - Primer µl (3.2 pmol) Template µl H2O 10 µl Chu trình nhiệt: 96 oC phút 96 oC 10 giây 50 oC giây 60 oC phút chu kỳ 25 chu kỳ  Tinh sản phẩm PCR sequencing Sử dụng kit tinh sản phẩm PCR (Sequencing clean up kit) hãng Zymo Reseach theo quy trình: 1) Thêm 240 μl Sequecing Binding Buffer vào ống chứa sản phẩm PCR sequecing 2) Chuyển toàn dịch lên cột lọc 3) Ly tâm 10.000rpm phút 4) Thêm 300 μl Sequecing Wash Buffer , ly tâm 10.000rpm phút 5) Thêm 20 μl Water Dnase, ARNse Free, ly tâm 10.000 phút  Giải trình tự gen máy AB Applied Biosystem - Chuẩn bị hóa chất: Đệm 1x, Distilled H 2O DNAse, ARNse free, - Polyacrylamide gel Kiểm tra bổ sung đệm 1x, H2O polyacrylamide gel vào ống thích hợp máy sequencing - Đặt plate (hoặc tube) vào vị trí đọc máy sequencing - Thực chạy sequencing  Thu nhận kết Kết chạy sequencing tự động lưu lại thư mục chọn, file liệu copy đĩa CD mở phần mềm AB Applied Biosystem Bioedit 1.4 Xác định kiểu gen HCV Kết giải trình tự vùng NS5B HCV xử lý xác định kiểu gen phần mềm ABL ( HCV Deepcheck) Quy trình giải trình tự gen HCV phương pháp NGS Các bước chuẩn bị bệnh phẩm, Master Mix, tách chiết RNA tương tự phương pháp Sanger 2.1 PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu - Thành phần PCR: 12,5 µL MasterAmp 2X RT – PCR PreMix; 0,5 µL MMLV – RT Plus; 0,5 µL MasterAmp TAQurate DNA Polymerase Mix; 6,5 µL Sterile Nuclease – Free Water; µL HCV – FP1; µL HCV – RP1; µL Template ARN Mồi HCV – FP1: GGGAGGTCTCGTAGACCGTGCACCATG Mồi HCV – RP1: GAGMGGKATRTACCCCATGAGRTCGGC - Chu trình nhiệt: 37 oC 30 phút 95 oC phút 95 oC 30 giây 60 oC 30 giây 72ºC 45 giây 72ºC phút 30 chu kỳ 8ºC 2.2 PCR đoạn gen có gắn transposomer - Chuẩn bị thành phần phản ứng PCR: µL DNA, µL HCV – FP2, µL HCV – RP2, 12,5 µL KAPA 2G Multiplex HotStart, 8,5 µL PCR grade Water - Chu trình nhiệt: 95 oC phút 95 oC 30 giây 59 oC 25 giây 72ºC 30 giây 95ºC 30 giây 66ºC 30 giây 72ºC 30 giây 72ºC phút 10 chu kỳ 25 chu kỳ 4ºC - Sản phẩm sau PCR điện di kiểm tra kích thước sản phẩm Tinh sản phẩm kit Zymo clean up kit kit Gel recovery kit 2.3 Đo chuẩn hóa nồng độ DNA - Pha hóa chất Qubit Working Solution theo tỷ lệ ul QuBit reagent: 199 ul QuBit Buffer - Pha hỗn hợp dung dịch đo nồng độ DNA ống đo chuyên dụng theo bước sau:  Standard : 10 ul standard 190 ul Qubit working solution  Mẫu cần đo nồng độ DNA: ul mẫu 198 ul Qubit working solution - Đưa standard mẫu vào máy Qubit đo nồng độ DNA - Hòa trộn sản phẩm PCR theo nồng độ đồng - Pha loãng hỗn hợp đến nồng độ 0.2 ng/ µl 2.4 PCR gắn Index 1) Sử dụng μl mẫu PCR sau tinh 2) Do index gắn vào đầu sợi đơn DNA, theo kit 96 index, xếp ống index đĩa TruSeq Index Plate Fixture sau:  Sắp xếp index ( mồi I7 có nắp màu cam) để theo chiều ngang  Sắp xếp index (mồi I5 có nắp trắng) theo thứ tự theo chiều dọc 3) Thêm 25 µl mastermix KAPA Hifi Hot Start Ready Mix vào ống mẫu, thay đầu côn sau lần thao tác 4) Thêm µl index (nắp trắng) vào ống theo cột, thay đầu côn sau lần thao tác.Thêm ul index (nắp màu cam) vào ống theo hàng, hút nhả pipet lần, thay đầu côn sau lần thao tác 5) Để tránh ô nhiễm chéo, loại bỏ tất nắp dùng thay nắp cung cấp theo kit 6) Đậy nắp ống ly tâm 1000 xg 20 ° C phút, để đảm bảo hóa chất tập trung đáy ống - Thành phần phản ứng: DNA (0.2 ng/ul) μl, Nextera XT Index Primer (N7xx) μl, Nextera XT Index Primer (S5xx) μl, KAPA Hifi HotStart ReadyMix 25 μl PCR, Grade water 10 μl - Tiến hành phản ứng PCR để gắn index theo chu trình nhiệt sau: 72 oC phút 95 oC 30 giây 95 oC 10 giây 55 oC 30 giây 72ºC 30 giây 72ºC phút 12 chu kỳ 10ºC Nếu chưa sử dụng sản phẩm PCR, bảo quản nhiệt độ – 8ºC ngày 2.5 Tinh sản phẩm PCR - Quy trình: 1) Ly tâm PCR amplicon Plate 1000 xg phút (20 ˚ C) 2) Điều chỉnh pipet múc 50 µl, chuyển sản phẩm PCR sang ống Thay đầu côn sau lần thao tác 3) Vortex AMPure XP 30 giây, sử dụng pipet, thêm 90 ul AMPure XP vào mẫu, hút nhả pipet 10 lần đảm bảo hat bead hoàn toàn trộn 4) Ủ nhiệt độ phòng phút để DNA bám vào hạt bead 5) Đặt ống giá từ phút, để đảm bảo lực từ giữ chặt hạt bead với DNA bám 6) Sử dụng pipet hút tồn dich ống, thay đầu sau lần thao tác 7) Giữ nguyên plate giá từ, tiến hành bước rửa với ethanol 80% sau: Thêm 200 µl ethanol 80% vào ống, để 30 giây Cẩn thận loại bỏ dịch 8) Giữ nguyên plate giá từ, lặp lại bước rửa lần sau: Thêm 200 µl ethanol 80% vào ống, để 30 giây Cẩn thận loại bỏ dịch 9) Giữ nguyên plate giá từ, để khô tự nhiên 15 phút 10) Nhấc plate khỏi giá từ 11) Dùng pipet thêm 52,5 µl RSB (Resuspension Buffer) vào ống mẫu, hút nhả pipet 10 lần, thay đầu côn sau lần thao tác, bước nhằm mục đích thơi DNA khỏi hat bead 12) Để nhiệt độ phòng phút, để đảm bảo DNA hết khỏi hạt bead 13) Đặt ống lên giá từ phút, để lực từ hút hết hạt bead xuống dưới, lúc phần dịch phần có chứa DNA 14) Ký hiệu plate 15) Dùng pipet, cẩn thận chuyển 50 µl dịch từ plate cũ sang plate mới, thay đầu côn sau lần thao tác Có thể bảo quản mẫu tinh nhiệt độ từ -15 đến -25°C vòng tuần 2.6 Chuẩn hóa mẫu, định lượng thư viện - Đo đưa nồng độ chuẩn: kiểm tra nồng độ mẫu Qubit, quy đổi nồng độ theo đơn vị nM thơng tin theo file đính kèm, theo công thức sau: nồng độ nM = (nồng độ ng/ul* 1000 000)/ (kích thước* 650) 2.7 Biến tính DNA đưa mẫu vào máy Miseq - Quy trình: 1) Chuẩn bị 0.2N NaOH (chuẩn bị từ NaOH 5N) 2) Pha loãng mẫu DNA( quy đổi nồng độ sang nM) 4nM 3) Kết hợp NaOH DNA sau: nM DNA (5 μl), 0.2 N NaOH (5 μl) 4) Vortex để mix hỗn hợp biến tính, ly tâm 280× g at 20°C phút 5) Ủ hỗn hợp phút nhiệt độ phòng để biến tính DNA thành sợi đơn 6) Bổ sung HT1: vào DNA biến tính đưa hỗn hợp DNA biến tính nồng độ 20 pM DNA: 10ul, HT 990ul 7) Pha lỗng DNA biến tính với HT1 nồng độ chuẩn trước đưa vào máy Miseq (nồng độ chuẩn đưa vào Miseq kit V2 12pM) 8) Trộn hỗn hợp mẫu 9) Bảo quản đá trước cho mẫu vào máy 2.8 Đưa mẫu vào máy MiSeq Đưa vào thao tác MiSeq hướng dẫn sử dụng bảo quản máy MiSeq 2.9 Xác định kiểu gen HCV Kết giải trình tự vùng NS5B HCV xử lý xác định kiểu gen phần mềm ABL ( HCV Deepcheck) ... khả ứng dụng NGS giải trình tự gen HCV, chúng tơi tiến hành nghiên Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen hệ x c định kiểu gen số chủng virus viêm gan C Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương năm 2015 ... D C VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI H C Y HÀ NỘI LÊ THỊ DUYÊN ỨNG DỤNG KĨ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI TRONG X C ĐỊNH KIỂU GEN MỘT SỐ CHỦNG VIRUS VIÊM GAN C TẠI BỆNH VIỆN BỆNH NHIỆT ĐỚI TRUNG. .. dụng NGS giải trình tự gen HCV C c đoạn gen đích hay ứng dụng để x c định kiểu gen HCV 5’UTR, Core NS5B Tuy nhiên, 5’UTR cho phép x c định đến kiểu gen mà không cho kết kiểu gen phụ x c Core NS5B