Nghiên cứu áp dụng phương pháp giải trình tự toàn bộ exome (WES) trong xác định đột biến gen gây bệnh động kinh nghiêm trọng ở trẻ nhỏ

Nghiên cứu áp dụng phương pháp giải trình tự toàn bộ exome WES trong xác định đột biến gen gây bệnh động kinh nghiêm trọng ở trẻ nhỏ Thành viên: LÊ PHAN HOÀNG TRÚC, BÙI CHÍ BẢO, ĐỖ TH

Nghiên cứu áp dụng phương pháp giải trình tự toàn

bộ exome (WES) trong xác định đột biến gen gây

bệnh động kinh nghiêm trọng ở trẻ nhỏ

Thành viên: LÊ PHAN HOÀNG TRÚC,

BÙI CHÍ BẢO, ĐỖ THỊ THU HẰNG

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA Y

−−

1 Mở đầu

2 Đối tượng – Phương pháp

3 Kết quả

4 Kết luận

1 MỞ ĐẦU

ở vỏ não

Nhân tố kích thích Nhân tố

3 loại di truyền

Rối loạn đơn gen

Các kênh ion hay các thụ thể

Động kinh vô căn Động kinh triệu chứng

40%

1.1 Động kinh và nguyên nhân

60%

Chẩn đoán

Kỹ thuật MRI, CT

Đặc điểm lâm sàng

Điện não đồ

Sinh hóa, xét nghiệm máu

Xét nghiệm gen

1.1 Động kinh và nguyên nhân

Giai đoạn sơ

• Hội chứng West (infantile spasms_IS)

• Động kinh với cơn co giật cục bộ dịch

chuyển

• Hội chứng Dravet (DS)

Giai đoạn thơ

ấu

• Hội chứng Gastaut (LGS)

Lennox-• Hội chứng Doose

• Phổ các hội chứng mất ngôn ngữ mắc phái dạng động kinh

• Hội chứng Kleffner (LKS)

Landau-1.2 Hội chứng động kinh nghiêm trọng ở trẻ em

Nhóm động kinh nghiêm trọng không phân loại được

1.3 Công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) và WES

Công nghệ giải trình tự gen thế

hệ mới Giải trình tự

nhanh Chi phí thấp

Mô tả biểu hiện gen

Giải trình

tự microRNA

1.3 Công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) và WES

o Illumina (HiSeq, MiSeq…)

o LifeTechnologies (PGM, Proton)

o Roche (454)

Giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa (WES)

Hơn 95% thông tin

vùng mã hóa

2% bộ

gen người

85% đột biến gây bệnh đơn gen

Bệnh do

đa yếu tố gen

1.3 Công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) và WES

Đối chiếu lên trình

tự chuẩn

Xuất variant

Chú giải variant

Các phần mềm phân tích (BWA, Platypus…) và phần mềm thương mại

1.3 Công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) và WES

Tỷ lệ chẩn đoán 30%

32.5% động kinh nghiêm trọng 38% động kinh

Thành tựu của WES

2 ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP

Nhóm Ca bệnh Giới tính/tuổi Ký hiệu mẫu Quan hệ với bệnh nhân

1: Control WES 7 Nam/5 tuổi 7C Bệnh nhi

2: Hội chứng Dravet

2.1 Đối

tượng

nghiên

cứu

Thu mẫu máu bệnh nhân

Phân tích kết quả WES

Gửi giải trình tự thế hệ mới toàn bộ vùng mã hóa

(WES)

Kiểm tra kết quả bằng Sanger Phân loại đột biến theo tiêu chuẩn ACMG

Quy trình tổng quát của nghiên cứu 2.2 Phương

pháp

Quy trình giải trình tự NGS tại Macrogen theo công nghệ Illumina trên hệ thống Hiseq 4000

DNA bộ gen

Thư viện

Gắn Adapters

Phân mảnh DNA

A: Chuẩn bị thư viện

2.2 Phương pháp

Flow Cell

Tạo cụm

Các chu kỳ khuếch đại

Các chu kỳ giải trình tự

File Text

Dữ liệu xuất ra file output

Hình kỹ thuật số

Chuyển định dạng file

Đối chiếu lên trình tự chuẩn

Xuất variant

Geneticist Assitant

Lọc và chú giải variant

Phân tích Trio

Ngoại kiểm kết quả phân tích

WES

Quy trình phân tích kết quả giải trình tự toàn bộ exon - WES

2.2 Phương pháp

Ký hiệu Ý nghĩa Gen Tên gen xảy ra biến thể

Chr:ChrPos Nhiễm sắc thể vào vị trí trên nhiễm sắc thể

Ref Nucleotide tham khảo tại vị trí xảy ra biến thể

Alt Nucleotide thay thế tại vị trí xảy ra biến thể

Type Loại đột biến

Coverage Số lần đọc được tại vị trí xảy ra biến thể trong quá trình giải trình tự

Var.Fre Tần số biến thể

Zygosity Tình trạng kết hợp giao tử

Exon.Nu Exon xảy ra biến thể

Codon.Pos Vị trí codon trong exon xảy ra biến thể

HGVS.c Sự thay đổi nucleotide

HGVS.p Sự thay đổi acid amin

CLNDBN Tên bệnh của biến thể

CLNDSDB Cơ sở dữ liệu bệnh của biến thể

CLNDSDBID ID trong cơ sở dữ liệu bệnh của biến thể

Các thông tin chú giải variant thể hiện trong các

bảng kết quả nghiên cứu

2.2 Phương pháp

Ký hiệu Ý nghĩa CLNSIG Ý nghĩa lâm sàng của biến thể: 0- ý nghĩa không chắc chắn; 1- không

được cung cấp; 2- lành tính; 3- có khả năng lành tính; 4- có khả năng gây bệnh; 5- gây bệnh; 6- phản ứng với thuốc; 7-tương thích mô; 255- khác

MAF Tỷ lệ của tần số Allele nhỏ ở người Mỹ gốc Âu (EA), người Mỹ gốc Phi

(AA) và toàn bộ (All)

DBSNP Bản dbSNP thành lập rs_id

COMMON SNP phổ biến có ít nhất 1 quần thể có kết quả nghiên cứu trên ngân hàng

dữ liệu 1000Genomes với tần số Allele nhỏ >= 1%

PROVEAN:

pred_score Công cụ dự đoán chức năng PROVEAN: dự đoán_điểm tương ứng

SIFT: pred_score Công cụ dự đoán chức năng SIFT: dự đoán_điểm tương ứng

pred_score Công cụ dự đoán chức năng MutationTaster: dự đoán_điểm tương ứng

ESP-AF-GLOBAL Tần số allele chung theo ESP

ESP-AF-POPMAX Tần số allele cao nhấn trong cộng đồng theo ESP

ESP-AC Tổng số allele đếm được theo ESP

2.2

Phương

pháp

Thông tin dùng

để lọc Điều kiện lọc Type # Synonymous

PROVEAN_score <= -2.5 SIFT _score < 0.05 Polyphen2_HDIV

_score >= 0.5 Polyphen2_HVAR

_score >= 0.5

Điều kiện lọc tìm biến thể nghi ngờ

2.2 Phương pháp

Điều kiện lọc biến thể khi đối

chiếu lên trình tự chuẩn

Thông tin dùng

để lọc Điều kiện lọc

Tần số của biến thể ≥ 20%

3 KẾT QUẢ

Ca bệnh Cá thể

Số biến thể

NextGENe

Geneticist Assistant Lọc qua panel gen

liên quan đến động kinh nghiêm trọng ở trẻ em

Lọc bằng điều kiện

Số lượng biến thể thu được qua từng bước phân tích

3 Kết quả

Gen SCN1A CACNA1A

CLNDSDBID N/A N/A

CLNSIG N/A N/A

DBSNP N/A N/A

COMMON N/A N/A

ESP-AF-GLOBAL N/A N/A

POPMAX N/A N/A

ESP-AF-ESP-AC N/A N/A

Polyphen2_HVA R: pred_score N/A N/A

MutationTaster : pred_score N/A N/A

Thông tin biến thế nghi ngờ ở bệnh nhi 7C

3 Kết quả

Polyphen2_HVAR : pred_score D_0.998

3 Kết quả

Tập trung phân tích phân tích, đánh giá: biến thể c.1178G>A

gen SCN1A và biến

Kết quả giải trình tự Sanger của exon 9 của gen SCN1A

trên bố, mẹ, con

3 Kết quả

Kết quả giải trình tự Sanger của exon 7 của gen GABRB3

trên bố, mẹ, con

3 Kết quả

Biến thể Đánh giá khả năng gây bệnh của biến thể theo tiêu chuẩn ACMG

Đột biến c.1178G>A (p.Arg393His) trên SCN1A và hiện

tượng khảm ở hội chứng Dravet

Vùng hình thành lỗ DIS5-S6 của protein

Nav1.1

Clinvar:

“Pathogenic”, gây bệnh

“Severe myoclonic epilepsy in infancy”

WES 1: biến thể dạng khảm ở người cha và di truyền sang bệnh nhi

Nghiên cứu trước: không phát hiện biến thể

do yếu tố chủ quan

3 Kết quả

Đột biến c.1178G>A (p.Arg393His) trên SCN1A và hiện

tượng khảm ở hội chứng Dravet

Báo cáo về các trường hợp dạng khảm ngày càng tăng

15 trên 174 (8,6%) bệnh nhân

Thể khảm không hiếm, phương pháp NGS hiệu quả

3 Kết quả

Đột biến c.695G>A (p.Arg232Gln) trên GABRB3

Chất trung gian

sơ cấp truyền tín hiệu ức chế

Liên kết ligand: kênh ion mở,

Cl - di chuyển

Biến thể có liên quan động

kinh

Gồm 5 tiểu phần

Giảm biểu hiện

Hội chứng Rett, hội

chứng Angelman và

các rối loạn phổ tự

kỷ

3 Kết quả

Đột biến c.695G>A (p.Arg232Gln) trên GABRB3

o 12 biến thể liên quan đến bệnh não động kinh

o 3 biến thể liên quan động kinh vắng

Đặc điểm của biến thể

Di truyền trội, khởi phát mới

Gen mã hóa cho các protein (liên quan synap, kênh

ion)

Đột biến thể

khảm

3 Kết quả

Tỉ lệ phát hiện biến thể bằng phương pháp WES

Tỷ lệ phát hiện bệnh trên thế giới tương đối cao

Xác định nguyên nhân 2 trường hợp Một trường

hợp nghi ngờ

3 Kết quả

Ý nghĩa của

nghiên cứu gen trong phát triển các liệu pháp mới

và cải thiện chăm sóc bệnh

nhân động kinh

Làm sáng tỏ các cơ chế phân tử => phát triển các liệu pháp điều trị mới

Cơ sở triển khai chẩn đoán gen => Tác động lên bệnh nhân và gia đình (tìm nguyên nhân, điều trị, tư vấn di truyền )

3 Kết quả

4 KẾT LUẬN

4 Kết luận

Đột biến trên gen

SCN1A dạng

khảm

Đột biến de novo trên gen GABRB3 gây

hội chứng Dravet

Công nghệ WES

• Tiềm năng:

nghiên cứu, xét nghiệm, chẩn đoán

• Tiết kiệm chi phí

Đầu tư nghiên cứu

• Nguyên nhân gây

bệnh

• Phương pháp

chẩn đoán, điều

trị