Xác định tỷ lệ nhiễm Rickettsia bằng kỹ thuật Realtime-PCR ở bệnh nhân tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương năm 2015 - 2016

Biểu hiện lâm sàng của bệnh đa dạng, từ thể nhẹ đến nặng,thậm chí có những thể gây nguy hiểm đến tính mạng, phụ thuộc vào từng loài Rickettsia bị nhiễm, vào đặc điểm di truyền và tình tr

PHAN THANH LUÂN

Xác định tỷ lệ nhiễm Rickettsia bằng kỹ thuật Realtime-PCR ở bệnh

nhân tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương năm 2015 - 2016

Lời đầu tiên, tôi muốn được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới ThầyNguyễn Vũ Trung, Thầy Thuốc Ưu Tú, PGS.TS Trưởng bộ môn Vi sinhTrường Đại học Y Hà Nội, Phó Giám Đốc Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trungương là người hướng dẫn khoa học, đã luôn giúp đỡ tôi, tận tình truyền đạtnhững kiến thức và những kinh nghiệm quý báu để tôi có thể hoàn thành luậnvăn Thầy là người luôn định hướng cho tôi trong nghiên cứu, truyền dạy chotôi biết bao kiến thức khoa học và cuộc sống Sự trưởng thành của tôi trênmỗi bước đường khoa học cũng như trong sự nghiệp đều có bàn tay và khối

óc của Thầy Sự động viên, giúp đỡ và dìu dắt của Thầy đã cho tôi thêm nghịlực để vượt lên chính mình, vượt lên những khó khăn trở ngại

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS Lê Thị Hội, Trưởng phòngNghiên cứu và Hợp tác Phát triển (R&D), Phó Trưởng phòng Hợp tác Quốc tếBệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương, giáo viên đồng hướng dẫn Người đãluôn nhiệt tình giúp đỡ, chỉ bảo, động viên tôi trong quá trình học tập và thựchiện nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Bằng tình cảm yêu mến và lời cám ơn chân thành, tôi xin gửi tới cácThầy Cô, các anh chị và các bạn đồng nghiệp Khoa Xét nghiệm Bệnh viện BệnhNhiệt đới Trung ương đã quan tâm, giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiệnnghiên cứu và hoàn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn trân trọng tới:

- Ban Giám hiệu và phòng Đào tạo Sau Đại học của Đại học Y Hà Nội

- Ban Giám đốc Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương

- Khoa Kế Hoạch Tổng Hợp, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương

- Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương

Xin cám ơn những người bệnh đã cho phép tôi lấy bệnh phẩm làm xétnghiệm để thực hiện đề tài Sự đóng góp của những người bệnh đã giúp tôi

Cuối cùng, nhưng vô cùng quan trọng tôi xin nói những lời cám ơn đầythương yêu với gia đình tôi, những người đã sinh thành, nuôi dưỡng Tôi luônkhắc cốt ghi tâm tình yêu thương của Cha mẹ tôi và anh chị em trong giađình, những người đã động viên, thương yêu chăm sóc, khích lệ tôi Nhữngngười đã luôn ở bên tôi, là chỗ dựa vững chắc để tôi yên tâm học tập và hoànthành luận văn

Hà Nội, ngày 10 tháng 07 năm 2017

Phan Thanh Luân

Tôi là Phan Thanh Luân, Bác sĩ nội trú khóa 40, Trường Đại học Y Hà

Nội, chuyên ngành Vi sinh y học, xin cam đoan

1 Đây là Luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫncủa thầy PGS.TS Nguyễn Vũ Trung và TS Lê Thị Hội

2 Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã đượccông bố tại Việt Nam

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực

và khách quan, đã được xác nhận và chấp nhận của cơ sở nơi nghiên cứu

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này

Tác giả luận văn

Phan Thanh Luân

AND Acid Desoxyribonucleic

ARN Acid Ribonucleic

DIF Direct Immuno-Fluorescent Assay

Xét nghiệm Miễn dịch huỳnh quang trực tiếpIFA Indirect Immunofluorescent Antibody

Xét nghiệm kháng thể miễn dịch huỳnh quang gián tiếpIgG Immunoglobulin G

IgM Immunoglobulin M

IHC Immuno-Histo-Chemical staining

Kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịchIIP Indirect Immunoperoxidase Antibody Assay

Xét nghiệm kháng thể miễn dịch peroxidase gián tiếp

kDa Kilo Dalton

PCR Polymerase Chain Reaction

Phản ứng trùng hợp chuỗiRFLP Restricted Fragment Length Polymorphism Analysis

Phân tích tính đa hình chiều dài các đoạn giới hạn

TỔNG QUAN 3

1.1 Bệnh do Rickettsia 3

1.1.1 Lịch sử 3

1.1.2 Đặc điểm sinh học Rickettsia 4

1.1.2.1 Hình thái 4

1.1.2.2 Cấu trúc 4

1.1.2.3 Khả năng đề kháng 5

1.1.2.4 Độc tố 5

1.1.2.5 Kháng nguyên và khả năng tạo miễn dịch 6

1.1.3 Hệ gen của vi khuẩn thuộc họ Rickettsiaceae 6

1.1.4 Dịch tễ học 7

1.2 Phân loại Rickettsia 7

1.2.1 Spotted Fever Group (SFG) Rickettsiae 9

1.2.2 Typhus Group (TG) Rickettsiae 10

1.2.3 Scrup Typhus Group (STG) Rickettsiae 10

1.3 Đặc điểm các nhóm bệnh do Rickettsia 11

1.3.1 Sốt phát ban do Rickettsia (Spotted Fever Group) 11

1.3.1.1 Sốt phát ban vùng núi Rocky (Rocky Spotted Fever Group) 11

1.3.1.2 Sốt Địa Trung Hải và các vùng lân cận 12

1.3.1.3 Sốt Đông Phi và Nam Phi 12

1.3.1.4 Sốt do ve truyền ở vùng Bắc Á 12

1.3.1.5 Sốt do ve truyền ở Bắc Australia 12

1.3.2 Sốt phát ban dịch tễ (Typhus Group) 12

1.3.3 Sốt mò (Scrub Typhus Group) 14

1.4 Vector truyền bệnh của vi khuẩn họ Rickettsiaceae 15

1.4.1 Bét, ve 15

1.4.2 Bọ chét 15

1.4.3 Chấy rận 16

1.4.4 Mò, mạt 16

1.5 Các kỹ thuật phát hiện nhiễm Rickettsia 17

1.5.1 Kỹ thuật miễn dịch học 17

1.5.1.1 Phản ứng Weil-Felix với kháng nguyên OX-K 17

1.5.1.2 Xét nghiệm kháng thể miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (Indirect Fluorescent Antibody – IFA) 18

Vào năm 1978, các nhà nghiên cứu đã phát triển phương pháp miễn dịch huỳnh quang để phát hiện Rickettsia thay cho phương pháp Weil-Flix Hiện nay phương pháp này được sử dụng phổ biến nhằm chẩn đoán nhanh chóng nhiễm Rickettsia 18

Phương pháp miễn dịch huỳnh quang có độ nhạy cao, tuy nhiên sự khác nhau giữa các loài Rickettsia khó phân biệt do có phản ứng liên kết chéo kháng thể Một phương pháp được phát triển bởi phòng thí nghiệm tham chiếu Rickettsia của Úc đã tối ưu hoá phương pháp này, tăng giá trị ngưỡng phát hiện lên 1:128 nhằm giảm tỉ lệ dương tính giả [41] 18

1.5.1.3 Xét nghiệm kháng thể miễn dịch peroxidase gián tiếp (Indirect Immunoperoxidase – IIP) 18

1.5.1.4 Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch gắn men (Enzyme Linked Immunosorbent Assay-ELISA) 18

1.5.3.1 Kỹ thuật PCR 20

1.5.3.2 Real-time PCR sử dụng probe làm chất phát huỳnh quang 20

1.5.4 Các kỹ thuật chẩn đoán khác 21

Nhuộm soi trực tiếp và soi kính hiển vi điện tử 21

1.6 Các nghiên cứu về bệnh do Rickettsia trên thế giới và trong nước Các hạn chế chưa nghiên cứu tại Việt Nam hiện nay 22

1.6.1 Các nghiên cứu trên thế giới 22

1.6.1.1 Nghiên cứu về dịch tễ 22

1.6.1.2 Nghiên cứu về lâm sàng và kỹ thuật chẩn đoán 22

1.6.2 Các nghiên cứu về bệnh do Ricketsia trong nước 22

1.6.3 Những hạn chế chưa nghiên cứu tại Việt Nam 23

CHƯƠNG 2 25

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 25

2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 25

2.2.3 Quy trình nghiên cứu 26

2.3 Vật liệu nghiên cứu 27

2.3.1 Vật liệu thu thập thông tin bệnh nhân 27

2.3.2 Hóa chất tách chiết DNA và hóa chất phản ứng realtime PCR phát hiện Rickettsia 27

2.3.2.1 Hóa chất 27

2.3.3 Sử dụng cặp mồi và probe 27

2.4 Quy trình thu nhận bệnh phẩm 28

2.5 Quy trình tách chiết DNA vi khuẩn Rickettsia 29

2.5.1 Tách chiết lớp bạch cầu máu đơn nhân ngoại vi (PBMC) 29

2.5.2 Tách chiết DNA từ PBMC 29

2.6 Quy trình kỹ thuật Realtime PCR 31

2.6.1 Quy trình thực hiện 31

2.6.1.1 Chuẩn bị Mix cho phản ứng PCR 31

2.6.1.2 Kỹ thuật thực hiện 31

2.6.1.3 Đảm bảo chất lượng xét nghiệm 32

2.6.1.4 Lưu hồ sơ 32

2.7 Nhận định kết quả và báo cáo 32

2.8 Địa điểm nghiên cứu 33

2.9 Xử lý và phân tích số liệu 33

2.10 Đạo đức nghiên cứu 33

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 34

3.1 Xác định tỷ lệ nhiễm Rickettsia ở bệnh nhân bằng kỹ thuật Realtime PCR 34

3.2 Phân loại một số loài Rickettsia bằng kỹ thuật Realtime-PCR 39

3.2.1 Độ nhạy của phản ứng Realtime-PCR trên DNA tổng số tách từ chủng vi khuẩn Rickettsia nuôi cấy 40

3.2.2 Độ đặc hiệu của phản ứng 42

3.2.3 Phân loại sốt mò bằng kỹ thuật Realtime PCR Taqman Probe 43

Kỹ thuật đã xác định được 82 bệnh nhân nhiễm sốt mò O tsutsugamushi

trong tổng số 254 bệnh nhân nghiên cứu chiếm tỷ lệ 32,3% 43Dựa trên gen 47 kDa đã được thiết kế cho kỹ thuật Realtime PCR

Taqman Probe đặc hiệu cho sốt mò do vậy để xác định nhiễm sốt

mò thì nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR TaqmanProbe cho chẩn đoán nhiễm sốt mò 43Đặc điểm của bệnh nhân nhiễm sốt mò 433.2.4 Phân loại sốt phát ban bọ chét chuột R typhi bằng kỹ thuật

Realtime PCR Taqman Probe 48 Tương tự như với sốt mò O tsutsugamushi Gen OmpB đặc hiệu cho

xác định tác nhân gây bệnh sốt phát ban bọ chét chuột Kỹ thuậtRealtime PCR Taqman Probe cho độ nhạy 102 copies/ml 48

Kỹ thuật đã xác định được 10 bệnh nhân nhiễm sốt mò R typhi trong

tổng số 254 bệnh nhân nghiên cứu chiếm tỷ lệ 3,9% 48Dựa trên gen OmpB đã được thiết kế cho kỹ thuật Realtime PCR

Taqman Probe đặc hiệu cho sốt phát ban bọ chét chuột Do vậy, đểxác định nhiễm sốt phát ban bọ chét chuột thì nghiên cứu ứngdụng kỹ thuật Realtime PCR Taqman Probe cho chẩn đoán nhiễmsốt phát ban bọ chét chuột 48Một số đặc điểm dịch tễ học lâm sàng của bệnh nhân nhiễm R typhi 493.2.5 Phân loại sốt phát ban Rickettsia bằng kỹ thuật Realtime PCR

Taqman Probe 53

dụng kỹ thuật Realtime Taqman Probe trong phát hiện nhiễm sốt phát ban do Rickettsia Trong nghiên cứu của chúng tôi chưa có

bệnh nhân nhiễm sốt phát ban do Rickettsia 53

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 53

4.1 Xác định tỷ lệ nhiễm Rickettsia ở bệnh nhân bằng kỹ thuật Realtime PCR 53

4.2 Phân loại số loài Rickettsia bằng kỹ thuật Realtime PCR 56

4.2.1 Đặc điểm dịch tễ học của sốt mò 57

4.2.2 Đặc điểm dịch tễ học sốt phát ban do bọ chét chuột truyền 63

KẾT LUẬN 67

KIẾN NGHỊ 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 81

DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Trình tự các cặp mồi và probe của các gen 47 kDa, 17 kDa và OmpB: 28

Bảng 3.1: Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo nghề nghiệp 36

Bảng 3.4: Độ đặc hiệu của phản ứng Realtime PCR 42 Bảng 3.5: Phân loại bệnh nhân nhiễm Rickettsia 43 Bảng 3.6: Phân bố bệnh nhân nhiễm sốt mò theo nghề nghiệp 45 Bảng 3.7: Phân bố bệnh nhân nhiễm sốt phát ban do bọ chét chuột theo nghề nghiệp 50

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ 1

DANH MỤC BẢNG 11

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 3

TỔNG QUAN 3

1.1 Bệnh do Rickettsia 3

Hình 1.1: Hình ảnh Rickettsia 5

Hình 1.1: Hình ảnh Rickettsia 5

1.2 Phân loại Rickettsia 7

Hình 1.2: Mối quan hệ di truyền khác nhau giữa Rickettsia và các vi sinh vật gần giống Rickettsia 8

Hình 1.2: Mối quan hệ di truyền khác nhau giữa Rickettsia và các vi sinh vật gần giống Rickettsia 8

Hình 1.3: Hình minh họa TG và SFG Rickettsia trong vật chủ 10

Hình 1.3: Hình minh họa TG và SFG Rickettsia trong vật chủ 10

1.3 Đặc điểm các nhóm bệnh do Rickettsia 11

1.4 Vector truyền bệnh của vi khuẩn họ Rickettsiaceae 15

1.5 Các kỹ thuật phát hiện nhiễm Rickettsia 17

Vào năm 1978, các nhà nghiên cứu đã phát triển phương pháp miễn dịch huỳnh quang để phát hiện Rickettsia thay cho phương pháp Weil-Flix Hiện nay phương pháp này được sử dụng phổ biến nhằm chẩn đoán nhanh chóng nhiễm Rickettsia 18 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang có độ nhạy cao, tuy nhiên sự khác nhau giữa các loài Rickettsia khó phân biệt do có phản ứng liên kết

tăng giá trị ngưỡng phát hiện lên 1:128 nhằm giảm tỉ lệ dương tính giả

[41] 18

1.6 Các nghiên cứu về bệnh do Rickettsia trên thế giới và trong nước Các hạn chế chưa nghiên cứu tại Việt Nam hiện nay 22

CHƯƠNG 2 25

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.3 Vật liệu nghiên cứu 27

Bảng 2.1: Trình tự các cặp mồi và probe của các gen 47 kDa, 17 kDa và OmpB: 28

2.4 Quy trình thu nhận bệnh phẩm 28

2.5 Quy trình tách chiết DNA vi khuẩn Rickettsia 29

2.6 Quy trình kỹ thuật Realtime PCR 31

2.8 Địa điểm nghiên cứu 33

2.9 Xử lý và phân tích số liệu 33

2.10 Đạo đức nghiên cứu 33

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 34

3.1 Xác định tỷ lệ nhiễm Rickettsia ở bệnh nhân bằng kỹ thuật Realtime PCR 34

Bảng 3.1: Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo nghề nghiệp 36

3.2 Phân loại một số loài Rickettsia bằng kỹ thuật Realtime-PCR 39

Bảng 3.2: Nồng độ và độ tinh sạch DNA 40

Hình 3.1: Đường chuẩn Realtime-PCR từ DNA tổng số tách chiết từ các chủng vi khuẩn Rickettsia nuôi cấy 40

Hình 3.2: Đồ thị khuếch đại của mẫu vi khuẩn nuôi cấy pha loãng 41

Hình 3.2: Đồ thị khuếch đại của mẫu vi khuẩn nuôi cấy pha loãng 41

Bảng 3.3: Độ nhạy của phản ứng RT-PCR trên plasmid tách dòng 41

Hình 3.3: Kết quả xác định độ đặc hiệu của phản ứng Realtime-PCR 42

Hình 3.3: Kết quả xác định độ đặc hiệu của phản ứng Realtime-PCR 42

Bảng 3.4: Độ đặc hiệu của phản ứng Realtime PCR 42

Bảng 3.5: Phân loại bệnh nhân nhiễm Rickettsia 43

Bảng 3.6: Phân bố bệnh nhân nhiễm sốt mò theo nghề nghiệp 45

Bảng 3.7: Phân bố bệnh nhân nhiễm sốt phát ban do bọ chét chuột theo nghề nghiệp 50

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 53

4.1 Xác định tỷ lệ nhiễm Rickettsia ở bệnh nhân bằng kỹ thuật Realtime PCR 53

4.2 Phân loại số loài Rickettsia bằng kỹ thuật Realtime PCR 56

KẾT LUẬN 67

KIẾN NGHỊ 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 81

Biểu đồ 3.2 Phân bố bệnh nhân nhiễm Rickettsia theo nhóm tuổi 35

Biểu đồ 3.3 Tỷ lệ bệnh nhân nghiên cứu theo giới 36

Biểu đồ 3.4 Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo vùng địa phương 37

Biểu đồ 3.5 Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo miền địa phương 37

Biểu đồ 3.6 Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo tỉnh, thành 38

Biểu đồ 3.7 Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo 39

các tháng trong năm 39

Biểu đồ 3.8 Phân bố bệnh nhân nhiễm sốt mò theo nhóm tuổi 44

Biểu đồ 3.9 Tỷ lệ nhiễm sốt mò theo giới 45

Biểu đồ 3.10 Phân bố nhiễm sốt mò theo vùng địa phương 46

Biểu đồ 3.11 Phân bố nhiễm sốt mò theo miền địa phương 46

Biểu đồ 3.12 Phân bố bệnh nhân nhiễm sốt mò theo tỉnh, thành 47

Biểu đồ 3.13 Phân bố bệnh nhân nhiễm sốt mò theo các tháng trong năm 48

49

Biểu đồ 3.14 Phân bố bệnh nhân nhiễm sốt phát ban do bọ chét chuột theo nhóm tuổi 49

Biểu đồ 3.15 Phân bố bệnh nhân nhiễm sốt phát ban do 50

bọ chét chuột theo giới 50

Biểu đồ 3.16 Phân bố nhiễm sốt phát ban do bọ chét chuột theo 51

vùng địa phương 51

Biểu đồ 3.17 Phân bố nhiễm sốt phát ban do bọ chét chuột theo 52

miền địa phương 52

thành 52 Biểu đồ 3.19 Phân bố bệnh nhân nhiễm sốt phát ban do bọ chét chuột theo các tháng trong năm 53

R canada; (ii) nhóm gây bệnh sốt phát ban (Spotted Fever Group) gồm

khoảng 20 loài khác nhau phân bố khắp thế giới; (iii) nhóm gây bệnh sốt mò

(Scrub Typhus Group) chỉ có duy nhất 1 loài Orientia tsutsugamushi [2]

Rickettsiosis là bệnh sốt cấp tính lưu hành và gây dịch ở nhiều nơitrên thế giới Biểu hiện lâm sàng của bệnh đa dạng, từ thể nhẹ đến nặng,thậm chí có những thể gây nguy hiểm đến tính mạng, phụ thuộc vào từng

loài Rickettsia bị nhiễm, vào đặc điểm di truyền và tình trạng sức khỏe của

người bệnh [2] Ở một số nơi, tỷ lệ tử vong có thể lên tới 36,8% [3]

Rickettsiosis đã được nghiên cứu ở một số nước như Nhật Bản, Đài

Loan… Đã có một số tác giả Việt Nam nghiên cứu bệnh do Rickettsia Phạm

Thanh Thủy [4], Nguyễn Văn Sơn [5] đã nghiên cứu các vấn đề của sốt mò

thuộc một trong các nhóm bệnh gây bởi Rickettsia, nhưng chủ yếu tập trung

nghiên cứu các khía cạnh lâm sàng và điều trị

Việc phát hiện Rickettsia trong phòng thí nghiệm trên thế giới cũng như

ở Việt Nam chủ yếu dựa vào phản ứng huyết thanh học vì các Rickettsia rất

khó nuôi cấy do tính chất ký sinh nội bào bắt buộc của nó (đòi hỏi phải có phòng

an toàn sinh học cấp 3) Phản ứng huyết thanh học xác định nhiễm Rickettsia có

những điểm hạn chế nhất định Đó là: (i) đáp ứng miễn dịch kháng thể chỉ có thểphát hiện được ở tuần thứ hai của bệnh; (ii) không có ngưỡng giá trị của hiệu giá

kháng thể cho chẩn đoán; (iii) mẫu máu kép để tìm động lực kháng thể cho chẩnđoán xác định là yêu cầu bắt buộc cho chẩn đoán song không phải lúc nào cũngđảm bảo được; (iv) có phản ứng chéo xảy ra giữa các loài khác nhau; (v)

Rickettsiae khó nuôi cấy nên việc sản xuất kháng nguyên phục vụ cho chẩn đoán

huyết thanh học cũng gặp khó khăn [1, 2]

Hiện nay, khi các kỹ thuật sinh học phân tử ra đời, mở ra một kỷ nguyên

mới cho việc chẩn đoán các căn nguyên gây bệnh nói chung và Rickettsia nói riêng Kỹ thuật PCR chẩn đoán đặc hiệu Rickettsia không những cho kết quả nhanh, chính xác mà nó còn có thể xác định được Rickettsia từ bệnh phẩm là

vết loét trên bệnh nhân [6]

Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương là cơ sở đầu ngành tiếp nhận,chẩn đoán và điều trị các bệnh nhân bị bệnh nhiễm trùng Trong thời gian qua,nhiều bệnh nhân nhập viện với các triệu chứng sốt và dấu hiệu lâm sàngkhông điển hình Kỹ thuật PCR đã được triển khai và góp phần quan trọng

trong xác định nhiễm Rickettsia Nhằm xác định về tỷ lệ nhiễm Rickettsia ở

bệnh nhân đến khám và điều trị tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương

năm 2015-2016, chúng tôi tiến hành đề tài “Xác định tỷ lệ nhiễm Rickettsia

bằng kỹ thuật Realtime-PCR ở bệnh nhân tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới

Trung ương năm 2015-2016” với 2 mục tiêu:

1 Xác định tỷ lệ nhiễm Rickettsia ở bệnh nhân bằng kỹ thuật Realtime-PCR.

2 Phân loại một số loài Rickettsia bằng kỹ thuật Realtime-PCR.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Bệnh do Rickettsia

1.1.1 Lịch sử

Chi Rickettsia lần đầu tiên được Howard Rickett mô tả khi ông điều tra

sự bùng nổ của bệnh Sốt phát ban rừng núi năm 1906 và 1907 [7] Người ta

đã thấy được vai trò quan trọng của các động vật trung gian truyền bệnh

(vector) Chu kỳ sống của Rickettsia xảy ra ở cả động vật có xương sống và

động vật không xương sống Trong đó, động vật chân đốt đóng vai trò quantrọng không chỉ là vector truyền bệnh mà còn là vật chủ chứa đầu tiên và giúp

quá trình nhân lên của Rickettsia Một số động vật như chuột và động vật có

túi cũng là vật chứa [8]

Hiện nay có 3 nhóm gây bệnh Rickettsioisis như loại gây sốt phát ban,

sốt dịch tễ và sốt mò [9], [10] Hai nhóm đầu thuộc về chi Rickettsia Trong khi đó nhóm thứ 3 thuộc về chi Orientia Sự phân loại Rickettsia đã có thay

đổi lớn trong thập kỷ qua, dựa vào sự ra đời của phương pháp sinh học phân

tử khi phân tích giải trình tự gen 16S rRNA [11] Những thay đổi này đã dẫn

đến loại ra một số vi sinh vật không phải Rickettsia, mặc dù chúng được mô tả giống Rickettsia như Coxiella burnetii và Bartonella Hiện nay Fournier và cộng sự đã đề xuất một hướng dẫn phân loại Rickettsia ở mức độ chi, nhóm, loài bằng giải trình tự gen 16S rRNA (rss), 4 gen gltA (citrate synthase),

OmpA, OmpB và sca4 (genD) [12].

Chi Rickettsia hiện nay có hơn 24 loài Tuy nhiên, có 16 loài gây bệnh

cho người Các giả thuyết cho rằng, tất cả các loài được tìm thấy trong độngvật chân đốt có khả năng là tác nhân gây bệnh cho người [13]

1.1.2 Đặc điểm sinh học Rickettsia

1.1.2.1 Hình thái

Rickettsia là những cầu trực khuẩn, ngắn, không có lông, không di

động, chiều dài khoảng 0,8 – 2,0 µm, chiều rộng khoảng 0,3 – 0,5 µm, đahình thái, hình dạng thay đổi qua các giai đoạn phát triển: cầu khuẩn đứng riêng

rẽ hoặc thành từng đôi có khi xếp thành chuỗi ngắn hoặc từng đám trong hoặc

ngoài tế bào Rickettsia không bắt màu Gram, khi nhuộm bằng phương pháp

Giemsa, vi khuẩn bắt màu tím hồng, bằng phương pháp Macchiavello cho màu

đỏ của fuschin trên nền xanh (trừ O tsutsugamushi bắt màu xanh)

1.1.2.2 Cấu trúc

Rickettsia đã có một thời được xem như virus vì kích thước nhỏ bé

(0,3-0,5 μm x 0,8-2,0 μm) và phát triển nội bào Ngày nay, Rickettsia được khẳng định là vi khuẩn vì: Rickettsia có tất cả đặc tính cấu tạo của vi khuẩn,

đặc biệt là có vách tế bào điển hình, có tất cả các enzyme cần thiết cho sựchuyển hóa, có chứa cả 2 loại acid nucleic: ADN và ARN và phân bào giống

vi khuẩn

Kích thước bộ gen của họ Rickettsiaceae nhỏ hơn nhiều so với các

loài vi khuẩn khác Nó có dạng vòng kích thước từ 1,1 đến 1,6 triệu bazenitơ Một số loài, khoảng 24% DNA không mang mã di truyền hoặc gen giả

Họ Rickettsiaceae là gồm các vi khuẩn kí sinh nội bào bắt buộc Do vậy,

chúng ít khi tương tác với các vi khuẩn khác và ít có cơ hội trao đổi DNA

Tuy nhiên gần đây, một số nhà nghiên cứu đã xác định R felis là vi khuẩn kí

sinh nội bào đầu tiên mang 2 plasmid

Hình 1.1: Hình ảnh Rickettsia (Nguồn: David H Walker Didier Raoult, Infectious Diseases)

1.1.2.3 Khả năng đề kháng

Rickettsia là những vi khuẩn rất yếu, bị tiêu diệt nhanh chóng bởi sức

nóng, độ ẩm, độ khô và các chất hóa học, bị bất hoạt ở nhiệt độ thường nhưngtồn tại tốt ở nhiệt độ thấp (-250C đến -700C) bằng phương pháp đông lạnh Chỉ

có Coxiella burnetii có khả năng đề kháng với khô ráo và có thể sống trong

phân của bọ chét nhiều tháng

1.1.2.4 Độc tố

Một số Rickettsia sinh ra một loại độc tố hòa tan trong môi trường lỏng

nuôi cấy, đồng thời gây tan máu và hoại tử Độc tố này rất yếu, gây tổn thương

ở các cơ quan nhiễm trùng giống như dạng tổn thương của ngoại độc tố Cấutạo vỏ ngoài của vi khuẩn cũng có tính kháng nguyên, vỏ cũng có vai trò đặc

biệt trong gây tan huyết Như vậy, hoạt tính gây tan huyết của Rickettsia ngoài

độc tố còn phụ thuộc vào cấu trúc gây tan huyết của vỏ và cả enzym gây tan

huyết của vi khuẩn Độc tố gắn liền với thân của Rickettsia, nếu đun ở 600Ctrong 30 phút hoặc xử lý bằng formalin 0,37%, độc tố sẽ bị hủy nhưng vẫn giữđược tính kháng nguyên , [91]

1.1.2.5 Kháng nguyên và khả năng tạo miễn dịch

Rickettsia có hai loại kháng nguyên, một kháng nguyên hòa tan đặc

hiệu của nhóm và một kháng nguyên chéo.

- Kháng nguyên đặc hiệu bao gồm kháng nguyên không chịu nhiệt và

kháng nguyên chịu nhiệt

+ Kháng nguyên không chịu nhiệt: là kháng nguyên không hòa tan, bảnchất là protein, đặc hiệu loài

+ Kháng nguyên chịu nhiệt: là kháng nguyên hòa tan, có bản chất làpolysaccharid, đặc hiệu nhóm

- Kháng nguyên không đặc hiệu: Bản chất là polysaccharid, kháng

nguyên này có cấu trúc gần giống với kháng nguyên của Proteus vulgaris

(chủng OX19, OX2, OXk) Vì vậy, kháng nguyên này được sử dụng trong

phản ứng Weil - Felix để chẩn đoán huyết thanh, riêng R burnetii không có

kháng nguyên này

Khi nhiễm Rickettsia hoặc sau khi tiêm vắc xin, cơ thể sẽ đáp ứng miễn

dịch sinh kháng thể Các loại kháng thể xuất hiện là kháng thể ngưng kết,kháng thể hòa tan đặc hiệu và có thể chống lại bệnh nhiễm trùng Độc tố của

Rickettsia cũng có thể hình thành kháng thể hòa tan chống lại độc tố của nó.

Trong thực tế, người ta thấy các nhiễm khuẩn Rickettsia gây nên sốt phát ban

có khả năng tạo ra miễn dịch mạnh mẽ, lâu dài và có thể hình thành miễn dịch

chéo với các loài Rickettsia khác Những người đã một lần mắc Rickettsiosis, lần sau có tiếp xúc với Rickettsia cũng có thể không bị mắc bệnh , [92].

1.1.3 Hệ gen của vi khuẩn thuộc họ Rickettsiaceae

Kích thước bộ gen của vi khuẩn thuộc họ Rickettsiaceae nhỏ hơn nhiều

so với các loài vi khuẩn khác Đó là dạng vòng có kích thước từ 1,1 đến 1,6triệu baze nitơ Trong một số loài, khoảng 24% DNA là không mang mã ditruyền hoặc gen giả [4], [29], [30], [31]

Rickettsiaceae là vi khuẩn kí sinh nội bào bắt buộc, do vậy chúng ít khitương tác với các vi khuẩn khác và ít có cơ hội trao đổi DNA Tuy nhiên gần

đây, một số nhà nghiên cứu đã xác định R felis là vi khuẩn kí sinh nội bào

đầu tiên mang 2 plasmid [9], [32]

1.1.4 Dịch tễ học

Vi khuẩn họ Rickettsiaceae được tìm thấy ở tất cả các châu lục trên thế

giới [33] O tsutsugamushi được tìm thấy trên 13 triệu km vuông, từ ven

Châu Á-Thái Bình Dương, Tây Bắc Afghanistan qua bán đảo Kamchatka đếnvùng Đông Bắc Nga và Úc [34], [35] Những năm gần đây, do sự phát triển

kỹ thuật chẩn đoán, ngày càng nhiều loài mới được phát hiện Nhiều loàithuộc nhóm gây bệnh sốt phát ban được tìm thấy ở tất cả các nơi như Châu

Âu, Châu Mỹ, Châu Á, Châu Úc và Châu Phi [2], [36], [37], [38] Các nước

Châu Á-Thái Bình Dương, bệnh nhân nhiễm Orientia gây sốt mò chiếm tỉ lệ

cao [39] [36] [29] [40] [37] Điều này do tác động của nhiều yếu tố như điềukiện khí hậu, điều kiện kinh tế xã hội cũng như là thói quen sinh hoạt

1.2 Phân loại Rickettsia

Họ Rickettsiaceae là vi khuẩn Gram (-), sống kí sinh nội bào bắt buộc ởđộng vật có xương sống trong một giai đoạn của quá trình phát triển Quátrình phân loại các vi khuẩn họ Rickettsiaceae đã trải qua nhiều thay đổi, đến

nay họ Rickettsiaceae chia thành 2 chi là Rickettsia và Orientia Dựa vào dữ

liệu về di truyền và tính kháng nguyên, họ Rickettsiaceae được chia làm 3nhóm: (i) Nhóm gây bệnh sốt dịch tễ (Typhus Group-TG) gồm các loài

Rickettsia typhi, Rickettsia prowazekii; (ii) Nhóm gây bệnh sốt phát ban

(Spotted Fever Group-SFG) gồm 20 loài khác nhau phân bố khắp thế giới

trong đó có 12 loài được xác định gây bệnh Rickettsia như Rickettsia

rickettsii, Rickettsia conorii, Rickettsia africae, Rickettsia sibirica, Rickettsia heilongjiangensis, Rickettsia japonica, Rickettsia slovaca, Rickettsia aeschlimanii, Rickettsia massiliae, Rickettsia honei, Rickettsia parkeri,

Rickettsia australis; (iii) Nhóm gây bệnh sốt mò (Scrub Typhus Group-SFG)

có 2 loài Orientia tsutsugamushi và Orientia chuto Hai nhóm đầu thuộc chi

Rickettsia, nhóm thứ 3 thuộc chi Orientia [45], [6]

Hình 1.2: Mối quan hệ di truyền khác nhau giữa Rickettsia và các vi sinh vật

gần giống Rickettsia.

Chi Rickettsia được phân thành 2 nhóm dựa vào vị trí ký sinh nội bào,

nhiệt độ sinh trưởng tối ưu, phần trăm G+C, đặc điểm lâm sàng, dịch tễ học

và đặc điểm kháng nguyên của vi khuẩn [33] Bằng phân tích hệ gen, hainhóm khác gần đây cũng được đề xuất là nhóm Ancestral Group (AG) bao

gồm R bellii và R Canadensis và Transitional Group (TRG) bao gồm R.

akari và R felis [9], [46]

Một điểm phân loại Rickettsia đáng chú ý khác đã được phân loại lại là

Rickettsia tsutsugamushi được phân thành chi riêng là Orientia (Orientia tsutsugamushi), và đang trong cùng phân nhóm α-1 như các chi Rickettsia

(Hình 1.2) [7] Coxiella burnetii (trước đây là Burnetii Rickettsia) cũng đã

được phân loại lại do sinh học phân tử giải trình tự gen 16S rRNA của chúng

là tương tự như các thành viên của nhóm γ và chúng không còn được xem

như là một Rickettsia [8].

1.2.1 Spotted Fever Group (SFG) Rickettsiae

Nhóm SFG là nhóm gây bệnh có biểu hiện lâm sàng chính ở người

Hiện nay có 20 loài (loại trừ R akari và R felis) và trong đó có 12 loài được xác định là nguyên nhân gây bệnh Rickettsia [9] R akari và R felis

không thuộc nhóm SFG do vector truyền bệnh của nhóm này không phải do

bét, ve gây ra Trong đó, có 11 loài liên quan đến bệnh sốt Rickettsia do

vector truyền bệnh là bét, ve Tất cả các loài Rickettsia truyền bệnh qua

vector bét, ve được phân loại thuộc nhóm SFG Đó là Rickettsia rickettsii,

Rickettsia conorii, Rickettsia africae, Rickettsia sibirica, Rickettsia heilongjiangensis, Rickettsia japonica, Rickettsia slovaca, Rickettsia aeschlimanii, Rickettsia massiliae, Rickettsia honei, Rickettsia parkeri, Rickettsia australis [10], [11], [12]

Các thành viên trong nhóm SFG tồn tại ở dạng tự do trong tế bào chấtcủa vật chủ như động vật có vú và chân đốt Không như TG, SFG có thể xuyên

qua màng nhân của tế bào vật chủ Vách tế bào của Rickettsia có 3 lớp với một

lớp không gian ngăn cách vách tế bào với tế bào chất [13] Kháng nguyên đặchiệu loài được nằm ở lớp vỏ siêu vi ở bên ngoài của vách tế bào

Hình 1.3: Hình minh họa TG và SFG Rickettsia trong vật chủ.

1.2.2 Typhus Group (TG) Rickettsiae

Nguyên nhân gây bệnh phát ban và sốt chuột là R prowazekii và R.

typhi Hiện tại chỉ có 2 loài này thuộc nhóm TG [47].

Hiện nay, các ca bệnh trên thế giới đều cho rằng vector truyền bệnh cho

người là do chấy rận (Pediculus humanus) đối với R prowazekii [48] và bọ chét chuột (Xenopsylla cheopis) đối với R typhi [49] Các báo cáo mới đây đã chỉ ra rằng các vector đối với R typhi không chỉ được giới hạn là bọ chét

chuột mà có thể bao gồm các loài khác của bọ chét khác như bọ chét mèo

(Felis Ctenocephalides) [50]

1.2.3 Scrup Typhus Group (STG) Rickettsiae

Sốt mò được biết đến từ rất sớm Mô tả đầu tiên về một bệnh nhân cótriệu chứng tương tự như sốt mò được tìm thấy tại Trung Quốc vào thế kỷ thứ

tư sau công nguyên [45] Tại Nhật Bản, bệnh được Hashimoto mô tả lần đầutiên vào năm 1810 nhưng cho đến năm 1878 mới được biết đến rộng rãi quathông báo của bác sỹ Theodor Palm với tên địa phương là “shima mushi” Vai

trò lây truyền bệnh của ấu trùng mò Leptotrombidium được Brumpt đề cập

đến lần đầu tiên vào năm 1910 Bản chất của vi khuẩn gây sốt mò được xácđịnh vào cuối những năm 1920 [45]

Vi khuẩn sốt mò – Orientia tsutsughamushi có kích thước 0,5-0,8 µm x

1,2-3,0 µm; là vi khuẩn Gram (-), ký sinh nội bào Mỗi tế bào vi khuẩn đượcbao bọc bởi một lớp thành tế bào rất mềm và một màng tế bào Vỏ vi khuẩnkhông chứa các peptidoglycan và lipopolysaccharide; lá ngoài của thành tế

bào dày hơn đáng kể so với lá trong Orientia bắt màu Giemsa hoặc Gimenez,

mọc trong túi thể vàng của phôi gà hoặc một loạt các dòng tế bào nuôi cấy

Orientia xâm nhập vào tế bào vật chủ thông qua cơ chế thực bào, đi vào màng

nguyên sinh chất, và phát triển chủ yếu ở vùng cận nhân tế bào Vi khuẩnđược giải phóng ra khỏi tế bào vật chủ, tương tự như những virus có vỏ

Orientia nhân bản bằng phương pháp phân đôi; chu kỳ nhân bản kéo dài

khoảng 9-19 giờ [1]

Trước năm 1995, Rickettsia tsutsughamushi được xếp ở trong chi

Rickettsia, là loài duy nhất trong nhóm sốt mò Tuy nhiên, những nghiên cứu

về cấu trúc và di truyền học của vi khuẩn cho thấy có sự khác biệt lớn giữa R.

tsutsughamushi với các Rickettsia khác Cấu trúc thành tế bào của Orientia có

lá ngoài dày hơn lá trong, không chứa peptidoglycan và lipopolysaccharide;

Orientia đề kháng tự nhiên cao với Penicillin Khi phân tích trình tự gen 16S

rARN, khoảng khác biệt giữa R tsutsughamushi và các vi khuẩn khác trong chi Rickettsia gần bằng khoảng khác biệt tiến hóa giữa các giống trong họ

Rickettsiaece Vì những lý do này, R tsutsughamushi được tách ra thành một

chi riêng mang tên Orientia tsutsughamushi [1].

1.3 Đặc điểm các nhóm bệnh do Rickettsia

1.3.1 Sốt phát ban do Rickettsia (Spotted Fever Group)

Bệnh lưu hành rải rác hoặc thành dịch, mang tính chất địa phương bao gồm:

1.3.1.1 Sốt phát ban vùng núi Rocky (Rocky Spotted Fever Group)

- Mầm bệnh là R rickettsii

- Trung gian truyền bệnh là ve rừng, ve chó

- Ổ chứa là ve rừng, thú rừng, gia súc

- Phân bố: Bệnh mang tính tản phát và lưu hành nhiều ở các vùng địa lýkhác nhau như: Mỹ, Canada, Braxin, Columbia,

1.3.1.2 Sốt Địa Trung Hải và các vùng lân cận

- Mầm bệnh là R rickettsii và R coronii

- Trung gian truyền bệnh là ve chó

- Ổ chứa là ve chó và chó mắc bệnh

- Phân bố: Ở Vùng Địa Trung hải và các vùng lân cận

1.3.1.3 Sốt Đông Phi và Nam Phi

- Mầm bệnh là R pijperi.

- Trung gian truyền bệnh là loài ve Haemophylasi leachi và Amblyomma

hebraeum

- Hiện chưa rõ ổ chứa của mầm bệnh này

- Bệnh mang tính tản phát lành tính, ít nguy hiểm

1.3.1.4 Sốt do ve truyền ở vùng Bắc Á

- Mầm bệnh là R dermacentroxenus.

- Môi giới truyền bệnh là ve rừng loại Dermacenter

- Ổ chứa mầm bệnh là các loại ve, chuột đồng, chuột cống, chuột nhắt

1.3.1.5 Sốt do ve truyền ở Bắc Australia

- Mầm bệnh là R dermacentroxenus biến chủng

- Trung gian truyền bệnh là ve Ixodes holocyclus.

- Ổ chứa mầm bệnh là loại gặm nhấm và ve Ixodes holocyclus.

1.3.2 Sốt phát ban dịch tễ (Typhus Group)

1.3.2.1 Sốt phát ban chấy rận

Bệnh được Nicolle mô tả đầu tiên vào năm 1911, được biết đến với các vụdịch có liên quan đến chiến tranh, thảm họa và các cuộc di dân lớn, do có điềukiện thuận lợi để người có nhiều rận, giảm sức đề kháng, thiếu vệ sinh, suy dinhdưỡng Ngày nay bệnh có xu hướng giảm dần trên thế giới

- Mầm bệnh là R prowazekii, nguồn bệnh duy nhất là người Trung gian truyền bệnh chính là rận Pendiculis corporis và Pendiculis capitis ngoài ra chấy

đóng vai trò thứ yếu

- Cơ chế gây bệnh: Sau khi rận hút máu bệnh nhân, R prowazekii vào

ruột rận nhân lên và phát triển rất mạnh trong ống tiêu hóa của rận trong 7 ngàyđầu Khoảng ngày thứ 8 - 10 các tế bào ruột rận vỡ ra và giải phóng nhiều mầmbệnh vào ruột rận, rồi được đào thải ra ngoài theo phân Khi rận đốt làm người

ngứa, cào, gãi làm xước da, R prowazekii chui vào cơ thể người gây bệnh qua vết xước da hoặc niêm mạc Sau khi vào máu, Rickettsia tập trung vào những tế

bào biểu mô của mạch máu, độc tố và yếu tố tan máu gây nhiễm độc tại chỗ, gâyviêm, phù nề, dẫn đến tắc nghẽn và thoát quản ở mao mạch các nội tạng và xuấthuyết ở ngoài da

1.3.2.2 Sốt phát ban do bọ chét chuột (Murin Typhus Fever)

Sốt phát ban do chuột (Murin Typhus Fever) hay sốt phát ban bọ chétchuột truyền (flea – borne typhus fever) lần đầu tiên được Mooser mô tả năm

1921 Bệnh hay xảy ra ở những nơi có sự tiếp xúc nhiều giữa người và chuộtnhư hầm tàu thuyền, kho thức ăn,

- Mầm bệnh: là R typhi (R mooseri) Ổ chứa là chuột cống, chuột nhắt.

- Trung gian truyền bệnh là bọ chét chuột (Xynopsylla cheopis) ưa hút

máu chuột Bọ chét phân bố khắp nơi trên thế giới và ký sinh ở động vật Nó

là vector truyền bệnh quan trọng trong các bệnh truyền nhiễm qua động vật

Trong nhóm bệnh Rickettsia, bọ chét là trung gian truyền bệnh của R typhi và

R felis Tuy nhiên con đường lây nhiễm của 2 loài này thì hoàn toàn khác

nhau R felis nhiễm vào cơ thể người qua nước bọt của bọ chét qua vết đốt, còn R typhi thì nhiễm qua phân bọ chét qua vết đốt hoặc vết xước trên da.

- Cơ chế truyền bệnh: Bọ chét nhiễm R typhi sau khi hút máu chuột bị

bệnh, truyền bệnh sang chuột lành thông qua phân bọ chét có chứa mầm bệnh,qua da bị xước và niêm mạc Người bị bệnh khi bị bọ chét đốt, phân bọ chét

có chứa mầm bệnh dính vào vết đốt hoặc qua da bị xây xát rồi xâm nhập vàomáu Đôi khi người bị nhiễm qua niêm mạc mắt, đường hô hấp, thức ăn bịnhiễm phân và nước tiểu chuột chứa mầm bệnh

- Phân bố: Bệnh gặp ở nhiều nơi trên thế giới thành từng ổ dịch, nhất là

ở Trung Mỹ, các nước Châu Âu, ven Địa Trung Hải, các nước Châu Phi,

1.3.3 Sốt mò (Scrub Typhus Group)

Sốt do ấu trùng mò (gọi tắt là sốt mò) là bệnh truyền nhiễm cấp tính

- Mầm bệnh: do O tsutsugamushi gây nên.

- Trung gian truyền bệnh: là mò đỏ Trombicula (nay gọi là Leptotrombidium).

Mò phát triển qua 4 giai đoạn gồm trứng, ấu trùng, thanh trùng và con trưởngthành Ấu trùng là giai đoạn sống ký sinh duy nhất của mò trong vòng đờiphát triển của nó Sau khi nở, chúng bò lên cỏ hoặc những bụi cây thấp để chờđợi vật chủ là người và các động vật gặm nhấm nhỏ như chuột, chim, thỏ điqua Khi đó ấu trùng mò bám vào da vật chủ để chích đốt máu

- Cơ chế gây bệnh:

Cơ chế bệnh sinh của bệnh được biểu hiện qua sơ đồ sau:

Orientia xâm nhập và nhân lên

qua vết đốt của ấu trùng mò

Nốt phỏng, loét, hoại tử, đóng vảy + sưng hạnh (do vi khuẩn xâm nhập vào hệ bạch huyết)

Vào máu, tăng sinh trong tế bào nội mô mạch máu, viêm mạch

máu nhỏ

Tăng tính thấm thành mạch, thoát huyết tương

Phù nề tổ chức, Tràn dịch các màng

Tụt huyết

áp, Huyết khối

1.4 Vector truyền bệnh của vi khuẩn họ Rickettsiaceae

Tất cả các vi khuẩn thuộc họ Rickettsiaceae gây bệnh đều do trung giantruyền bệnh là động vật chân đốt Động vật chân đốt đồng thời cũng là ổ chứa

và nơi nhân lên của vi khuẩn chúng còn đóng vai trò quan trọng trong việc lâylan Tuy nhiên cách thức lây truyền từ động vật chân đốt sang người là khácnhau Vi khuẩn lây nhiễm vào vật chủ qua nước bọt, vết đốt của côn trùng như

ve, bét, chấy rận hoặc mò mạt Ngoài ra chúng còn được truyền qua phân qua

vết xước ở da vật chủ [53] Rickettsia và Orientia lây nhiễm sang các tế bào

da như lớp nội mạc mạch máu (tế bào bị nhiễm chính), nguyên bào sợi, tế bàonội mô bạch huyết và đại thực bào

Đặc điểm sinh thái và sự phân bố của vector truyền bệnh Rickettsia liênquan trực tiếp đến yếu tố dịch tễ học của bệnh như điều kiện khí hậu, vùng địa

lý lưu hành bệnh, điều kiện vệ sinh, điều kiện kinh tế xã hội và yếu tố nguy cơtiếp xúc

1.4.1 Bét, ve

Là loài ký sinh trùng thuộc động vật có xương sống truyền bệnh chongười và phân bố khắp nơi trên thế giới Gần đây chúng được xem là vectortruyền bệnh quan trọng đứng thứ hai sau muỗi Có hai họ bét chính Ixodidae

và Argasidae Ixodid chiếm đa số và là trung gian truyền bệnh chủ yếu Ixodid

là vector truyền bệnh của ít nhất 15 loài Rickettsia gây sốt phát ban [54] Người ta cũng tìm thấy sự có mặt của vi khuẩn Rickettsia gây bệnh sốt phát

ban trong Argasid ở Nhật và ở Mỹ [55] Bét không chỉ là vector truyền bệnh

mà còn là ổ chứa [53], [54] Sự phân bố về địa lý của bét và Rickettsia mà bét

là trung gian truyền bệnh phụ thuộc vào các yếu tố môi trường như khí hậu,mùa trong năm cũng như là quần thể bét và vật chủ

nhiên con đường lây nhiễm của 2 loài này thì hoàn toàn khác nhau R felis nhiễm vào cơ thể người qua nước bọt của bọ chét qua vết đốt, còn R typhi thì

nhiễm qua phân bọ chét qua vết đốt hoặc vết xước trên da

1.4.3 Chấy rận

Chấy rận là loài ký sinh trên vật chủ đặc biệt Chấy rận ở người có 2 loài

Pediculus humanus humanus và Pediculus humanus corporis Chúng là

vector truyền nhiễm của ít nhất 3 bệnh ở người như sốt phát ban dịch tễ do R.

prowazekii, sốt tái phát do chấy rận Borrelia recurrentis và sốt mương Bartonella Quintana [33] Các đại dịch bệnh do chấy rận là trung gian truyền

bệnh liên quan trực tiếp đến quá trình tiến hoá của con người Trận dịch nổi

tiếng do R prowazekii lây truyền qua chấy rận xảy ra trong cuộc chiến tranh

của Napolion Tại thời điểm đó khoảng 20% quân lính chết do sốt dịch tễ và

12 triệu người Nga nhiễm bệnh từ năm 1917 đến 1925 trong đó 3 triệu người

bị chết [35], [33] Bệnh do R prowazekii được truyền từ chấy rận cũng được

báo cáo ở thế kỷ thứ 21, xảy ra chủ yếu ở các nước đang phát triển, nơi cóđiều kiện vệ sinh kém, dân cư tập trung nhiều ở vùng nông thôn Chấy rận chỉ

là vector truyền bệnh R prowazekii mà không phải là ổ chứa Con đường lây

truyền qua vết đốt, phân rận ở da

1.4.4 Mò, mạt

Mò Leptotrombidium là vector truyền bệnh của vi khuẩn thuộc chi

Orientia [34] Mò phát triển qua 4 giai đoạn gồm trứng, ấu trùng, thanh

trùng và con trưởng thành Ấu trùng là giai đoạn sống ký sinh duy nhất của

mò trong vòng đời phát triển của nó Sau khi nở, chúng bò lên cỏ hoặcnhững bụi cây thấp để chờ đợi vật chủ là người và các động vật gặm nhấmnhỏ như chuột, chim, thỏ đi qua Khi đó ấu trùng mò bám vào da vật chủ

để chích đốt máu

Mò có sự phân bố rất đa dạng về mặt địa lý và sinh thái Mò thườngsống ở những nơi bụi rậm, ven rừng, cánh đồng và những cánh rừng đã bịphát quang Chúng cũng được phát hiện ở những công viên, vườn, bãi cỏ

và những nơi ẩm thấp dọc theo các bờ sông, bờ suối, ruộng bỏ hoang vànhững vườn ven các đô thị lớn Về mặt địa lý mò phân bố ở các nước ChâuÁ-Thái Bình Dương, từ Nhật Bản qua các nước Đông Á và Đông Nam Á,Châu Úc, Châu Mỹ [34] Mật độ của mò thay đổi theo mùa, cao nhất là cáctháng mùa mưa ở những nơi có khí hậu nhiệt đới, và các tháng có nhiệt độcao ở những nơi có khí hậu ôn đới Sự thay đổi về số lượng và mật độ của

quần thể mò cũng như là tỉ lệ mò nhiễm O tsutsugamushi theo vùng là yếu

tố phản ánh mức độ lưu hành bệnh sốt mò ở các nước trên thế giới Sốt mò

là nguyên nhân chính gây sốt cấp tính ở các vùng nông thôn của các nướcĐông Nam Á [37], [36]

1.5 Các kỹ thuật phát hiện nhiễm Rickettsia

1.5.1 Kỹ thuật miễn dịch học

1.5.1.1 Phản ứng Weil-Felix với kháng nguyên OX-K

Một trong những phương pháp xét nghiệm nhiễm Rickettsia sớm nhất

được phát triển đó là phương pháp Weil-Felix [56] Phương pháp này đầu

tiên được thiết kế để phát hiện kháng thể kháng Proteus dựa vào nguyên lý liên kết chéo với kháng nguyên Rickettsia Xét nghiệm Weil-Flix phát hiện

kháng thể IgM trong huyết thanh 5-10 ngày sau khi nhiễm bệnh Bây giờngười ta ít sử dụng phương pháp này do độ đặc hiệu và độ nhạy kém.Phương pháp miễn dịch huỳnh quang được phát triển thay thế phương phápWeil-Felix [57], [58], [59], [33]

1.5.1.2 Xét nghiệm kháng thể miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (Indirect Fluorescent Antibody – IFA)

Vào năm 1978, các nhà nghiên cứu đã phát triển phương pháp miễn dịchhuỳnh quang để phát hiện Rickettsia thay cho phương pháp Weil-Flix Hiệnnay phương pháp này được sử dụng phổ biến nhằm chẩn đoán nhanh chóngnhiễm Rickettsia

Phương pháp miễn dịch huỳnh quang có độ nhạy cao, tuy nhiên sự khácnhau giữa các loài Rickettsia khó phân biệt do có phản ứng liên kết chéokháng thể Một phương pháp được phát triển bởi phòng thí nghiệm thamchiếu Rickettsia của Úc đã tối ưu hoá phương pháp này, tăng giá trị ngưỡngphát hiện lên 1:128 nhằm giảm tỉ lệ dương tính giả [41]

1.5.1.3 Xét nghiệm kháng thể miễn dịch peroxidase gián tiếp (Indirect Immunoperoxidase – IIP)

Nguyên lý của phương pháp IIP tương tự như IFA chỉ khác huyết thanhkháng globulin người được gắn với peroxidase thay vì gắn với chất pháthuỳnh quang trong IFA Phức hợp kháng nguyên-kháng thể-kháng globulinsau đó dược phát hiện bằng dung dịch cơ chất chứa diaminobenzindine vàperoxide IIP có độ nhạy và độ đặc hiệu tương tự như IFA, cũng sử dụng

kháng nguyên từ Rikettsia tuy nhiên kết quả được đọc bằng kính hiển vi

thường không cần kính hiển vi huỳnh quang Tuy nhiên, cũng giống như IFA,

IIP sử dụng kháng nguyên là Rickettsia nuôi cấy trên chuột hoặc các dòng tế

bào nên cũng không có sẵn để sử dụng ở các vùng bệnh lưu hành nhưngnguồn lực còn hạn chế

1.5.1.4 Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch gắn men (Enzyme Linked Immunosorbent Assay-ELISA).

ELISA sử dụng kháng nguyên là Rickettsia nuôi cấy trên các dòng tế bào hoặc kháng nguyên vỏ Rickettsia [46], [57], [47], [17], [84] Các xét

nghiệm ELISA thương mại thường được sản xuất dưới dạng kit 96 giếng

Kháng nguyên của Rickettsia được gắn vào màng polystyrene ở đáy của

giếng phản ứng hình chữ U Xét nghiệm được thực hiện qua các bướcchính như sau: cho huyết thanh của người bệnh phản ứng với khángnguyên; cho IgM/IgG trong phức hợp kháng nguyên kháng thể phản ứngvới kháng IgM hoặc IgG người gắn peroxidase; cho peroxidase phản ứngvới tetramethyl benzidine và ủ trong 10 phút; ngừng phản ứng và đọc kếtquả trên máy đọc ELISA

ELISA có độ nhạy và độ đặc hiệu tương tự IFA và IIP, có thể tiến hànhhàng loạt cho một số lượng lớn đối tượng bệnh phẩm, phù hợp cho chẩn đoánhồi cứu hoặc khảo sát dịch tễ học Khác với IFA và IIP, kết quả ELISA đượcđọc bằng máy và không phụ thuộc chủ quan vào người đọc [17] Do có những

ưu điểm về độ nhạy, độ đặc hiệu và khả năng sản xuất kit thương mại, ELISAđược khuyến cáo sử dụng như xét nghiệm chuẩn cho chẩn đoán sốt mò ởvùng bệnh lưu hành [17] Để khẳng định bệnh nhân bị sốt mò bằng phươngpháp này thì đòi hỏi mẫu bệnh phẩm phải được thu thập ở 2 giai đoạn, giaiđoạn sốt cấp tính và giai đoạn phục hồi ELISA có độ nhạy và độ đặc hiệutương tự IFA và IIP Tuy nhiên do yêu cầu thu mẫu bệnh phẩm như trên nênrất khó áp dụng

1.5.2 Kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn Rickettsia

Phân lập Rickettsia bằng phương pháp nuôi cấy nhằm xác định đặc điểm kiểu gen và kiểu hình của vi khuẩn Kỹ thuật nuôi cấy Rickettsia tương tự như nuôi cấy vi rút và được áp dụng hiệu quả trong nuôi cấy Rickettsia từ các mẫu

bệnh phẩm máu [33], [60], [61] Phương pháp nuôi cấy truyền thống sử dụngdòng tế bào động vật (L929, Vero, HEL) hoặc côn trùng (DEA 100, Aa23,Sua5B) vẫn được sử dụng phổ biến [62], [63] Hiện nay phương pháp nuôi

cấy đối với Rickettsia vi khuẩn kí sinh nội bào đòi hỏi phải có phòng an toàn

sinh học cấp 3 chỉ sử dụng trong nghiên cứu không áp dụng cho các cơ sở ytế

1.5.3 Kỹ thuật sinh học phân tử

Kỹ thuật PCR phát hiện Rickettsia đã được phát triển và ứng dụng rộng

rãi tại những phòng thí nghiệm hiện đại Kỹ thuật PCR xác định chính xácnhiễm Rickettsia trước khi có sự chuyển đổi huyết thanh của bệnh nhân và

trước khi nuôi cấy Nhiều gen đích của Rickettsia đã được sử dụng trong PCR như citrate synthase gltA, OmpA, [7], OmpB, [23], 16S rRNA, [23] và gen D

[66] Kỹ thuật Realtime-PCR cũng đã được phát triển nhằm tăng độ nhạy và

độ đặc hiệu của phương pháp cũng như định lượng Rickettsia trong mẫu bệnh

phẩm [25] Fournier và cộng sự đã đề xuất các tiêu chuẩn để xác định các

nhóm Rickettsia [22]

1.5.3.1 Kỹ thuật PCR

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) do Karl Mullin vàcộng sự phát minh năm 1985 Thực ra đây là một phương pháp nhân 1 đoạngen in vitro không cần sự hiện diện của tế bào PCR là một phản ứng tổnghợp chuỗi DNA với sự tham gia của enzym DNA – polymerase chịu nhiệt,một đoạn DNA được dùng để làm mồi và một mạch đơn DNA làm khuôn

Kỹ thuật này đã có ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh vực như khoa họchình sự, mô bệnh học, các chẩn đoán trước sinh và chẩn đoán các mầmbệnh… [67], [34]

1.5.3.2 Real-time PCR sử dụng probe làm chất phát huỳnh quang

Probe được dịch là “đoạn dò” hay “dò”, đó là những đoạnoligonucletides sợi đơn có trình tự có thể bắt cặp bổ sung với một trình tự đặchiệu trên DNA đích (trong PCR, đó là sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNAđích) Sử dụng probe làm chất phát huỳnh quang dựa trên nguyên tắc là khi cómặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu trong ống phản ứng thì sẽ có sự bắt cặpcủa probe lên trình tự đặc hiệu của sản phẩm khuếch đại, và khi có sự bắt cặpnày thì sẽ có sự phát huỳnh quang từ ống phản ứng khi nó nhận được nguồnsáng kích thích Có nhiều loại probe, và thậm chí cả primers được sử dụng

làm chất phát huỳnh quang cho real-time PCR [114].

o Real-time PCR sử dụng Taqman probe

Nguyên tắc kỹ thuật real-time PCR sử dụng Taqman probe

Kỹ thuật TaqMan bao gồm một đầu dò oligonucleotide (probe) được gắn

ở đầu 5´ một chất phát tín hiệu huỳnh quang (reporter) và ở đầu 3´ là một chấtthu nhận tín hiệu (quencher) Probe được thiết kế gắn với trình tự đích củamầm bệnh ở giữa mồi xuôi và mồi ngược của phản ứng PCR Ở giai đoạn gắnmồi, probe gắn đặc hiệu vào trình tự đích, khi đó tín hiệu huỳnh quang phát ra

từ Reporter đều bị Quencher dập tắt Trong giai đoạn kéo dài khi mồi xuôi củaphản ứng được kéo dài đến vị trí gắn của Probe thì taq DNA polymerase sẽphá hủy các liên kết gắn giữa probe với trình tự đích và đồng thời phá hủyprobe, làm cho Reporter và Quencher không còn ở gần nhau Kết quả reporterphát ra tín hiệu huỳnh quang và hệ thống máy realtime PCR sẽ thu nhận tínhiệu huỳnh quang phát này Tín hiệu huỳnh quang thu được tỷ lệ thuận vớinồng độ các probe bị phá hủy Tín hiệu này tăng lên gấp đôi sau mỗi chu kỳkhuếch đại Dựa vào tín hiệu huỳnh quang thu được của mẫu bệnh phẩm vàcác mẫu chuẩn, phần mềm sẽ tính toán ra nồng độ ban đầu của vật chất ditruyền trong mẫu thử

1.5.4 Các kỹ thuật chẩn đoán khác

Nhuộm soi trực tiếp và soi kính hiển vi điện tử

Rickettsia có thể phát hiện trong một số bệnh phẩm như dịch màng bụng

chuột, qua nhuộm Giemsa Soi kính hiển vi điện tử các tế bào nuôi cấy

Rickettsia, dịch màng bụng của chuột và mô của mò/ấu trùng mò có thể phát

hiện vi khuẩn gây bệnh [4]

1.6 Các nghiên cứu về bệnh do Rickettsia trên thế giới và trong nước Các hạn chế chưa nghiên cứu tại Việt Nam hiện nay.

1.6.1 Các nghiên cứu trên thế giới

1.6.1.1 Nghiên cứu về dịch tễ

Vi khuẩn họ Rickettsiaceae được tìm thấy ở tất cả các châu lục trên thế

giới [33] O tsutsugamushi được tìm thấy trải dài 13 triệu km2, từ ven Châu Á

- Thái Bình Dương, Tây Bắc Afghanistan qua bán đảo Kamchatka đến vùngĐông Bắc Nga và Úc Những năm gần đây do sự phát triển công nghệ chẩnđoán, ngày càng nhiều loài mới được phát hiện Nhiều loài thuộc nhóm gâybệnh sốt phát ban được tìm thấy ở tất cả các nơi như Châu Âu, Châu Mỹ,Châu Á, Châu Úc và Châu Phi [2], [36], [37], [38] Các nước Châu Á-Thái

Bình Dương, bệnh nhân nhiễm Orientia gây Rickettsia chiếm tỉ lệ cao Điều

này do tác động của nhiều yếu tố như điều kiện khí hậu, điều kiện kinh tế xãhội cũng như là thói quen sinh hoạt

1.6.1.2 Nghiên cứu về lâm sàng và kỹ thuật chẩn đoán

Chẩn đoán bệnh Rickettsia rất khó nếu không có phương pháp chẩn đoán

phù hợp Ngày nay trên thế giới, có 3 phương pháp chính được sử dụng để chẩn

đoán Rickettsia, đó là phương pháp nuôi cấy, phương pháp miễn dịch và phương

pháp sinh học phân tử , ,

1.6.2 Các nghiên cứu về bệnh do Ricketsia trong nước

Trong những năm 1920 và đầu 1930, một số ca sốt mò lẻ tẻ được mô tảtrong y văn về biểu hiện lâm sàng bao gồm sốt, có vết loét kèm theo nổi hạch tạichỗ, và phản ứng huyết thanh trong giai đoạn hồi phục dương tính với ProteusX19 Trong nghiên cứu về tiêu chuẩn chẩn đoán, trên Bán đảo Đông Dương saunăm 1945, sốt mò trở nên là một vấn đề y tế quan trọng, gây những tổn thất đáng

kể cho Quân đội Pháp về lực lượng: 5708 người bị bệnh và 158 ca tử vong

Những nơi được coi là vùng dịch sốt mò tiềm tàng tại Việt Nam là: Lạng Sơn,Sơn La (miền Bắc), Đông Hà – Quảng Trị (miền Trung) và Bến Cát – BìnhDương (miền Nam) Một số yếu tố dịch tễ học của bệnh tại Việt Nam cũng đượcchỉ ra là thảm thực vật thấp phù hợp với sinh cảnh của sốt mò, tính chất đất ở

nhiều nơi phù hợp cho sự phát triển của mò Trombicula Sau hòa bình lập lại,

ở miền Bắc Việt Nam một số vụ dịch sốt mò và các trường hợp bệnh lẻ tẻ đãđược thông báo Năm 1965, Bùi Đại và Nguyễn Hòe đã thông báo về 5 cabệnh được chẩn đoán là sốt mò trên cơ sở vết loét đặc hiệu ngoài da và phảnứng huyết thanh OXK Một số trường hợp sốt nghi do Ricketssia nhưng khôngthể chẩn đoán xác định do không có phương tiện chẩn đoán xác định

Trong những năm gần đây, nhờ tiến bộ của khoa học kỹ thuật, một số

trung tâm, bệnh viện lớn có khả năng chẩn đoán xác định bệnh do Ricketssia

gây ra Một số tác giả đã nghiên cứu về dịch tễ, đặc điểm lâm sàng và điềutrị bệnh sốt mò như Lê Đăng Hà, Nguyễn Văn Sơn, Phạm Thanh Thủy, PhanQuận, , [106], [107]

1.6.3 Những hạn chế chưa nghiên cứu tại Việt Nam

Một số báo cáo gần đây cho thấy có sự lưu hành của cả ba nhóm bệnh

do Rickettsia ở miền Bắc, Việt Nam [4], [68] Tuy nhiên cho đến nay, ở Việt

Nam vẫn chưa có một nghiên cứu nào đề cập một cách đầy đủ và toàn diện về

3 nhóm bệnh gây bởi Rickettsia Chúng ta chưa biết về sự tồn tại, lưu hành, phân bố cũng như vector lây truyền của các loài Rickettsia khác nhau và tác

nhân nào là tác nhân gây bệnh phổ biến nhất ở Việt Nam cũng chưa từng đượcxem xét

Bệnh Rickettsia có bệnh cảnh lâm sàng đa dạng, một số báo cáo cho

thấy vi khuẩn bắt đầu giảm nhạy cảm với các kháng sinh thông thường Nếuchậm trễ chẩn đoán và điều trị, bệnh có thể để lại những biến chứng thần kinhnặng nề và có thể gây tử vong cho bệnh nhân Do vậy, chẩn đoán xác định cănnguyên gây bệnh sớm và chính xác để điều trị sớm có ý nghĩa rất lớn đối với