Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và chế tạo Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) ở đàn trâu tại tỉnh Tuyên Quang (LA tiến sĩ)

Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và chế tạo Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) ở đàn trâu tại tỉnh Tuyên Quang (LA tiến sĩ)Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và chế tạo Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) ở đàn trâu tại tỉnh Tuyên Quang (LA tiến sĩ)Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và chế tạo Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) ở đàn trâu tại tỉnh Tuyên Quang (LA tiến sĩ)Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và chế tạo Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) ở đàn trâu tại tỉnh Tuyên Quang (LA tiến sĩ)Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và chế tạo Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) ở đàn trâu tại tỉnh Tuyên Quang (LA tiến sĩ)Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và chế tạo Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) ở đàn trâu tại tỉnh Tuyên Quang (LA tiến sĩ)Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và chế tạo Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) ở đàn trâu tại tỉnh Tuyên Quang (LA tiến sĩ)Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và chế tạo Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) ở đàn trâu tại tỉnh Tuyên Quang (LA tiến sĩ)Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và chế tạo Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) ở đàn trâu tại tỉnh Tuyên Quang (LA tiến sĩ)Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm và chế tạo Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) ở đàn trâu tại tỉnh Tuyên Quang (LA tiến sĩ)

NCS PHẠM THỊ TRANG

1

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM

VÀ CHẾ TẠO KIT CHẨN ĐOÁN BỆNH TIÊN MAO TRÙNG

NCS PHẠM THỊ TRANG

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM

VÀ CHẾ TẠO KIT CHẨN ĐOÁN BỆNH TIÊN MAO TRÙNG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chúng tôi Các kết quả nghiên cứu trong luận án này là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ một luận án nào khác Mọi thông tin trích dẫn trong luận án đều đã được chỉ

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án này, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới

GS TS Nguyễn Thị Kim Lan và PGS TS Phạm Công Hoạt - những Nhà khoa

học đã hướng dẫn, chỉ bảo tôi hết sức tận tình trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành Luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện to lớn về cơ sở vật chất, nhân lực, vật lực của Ban Giám đốc, Ban Đào tạo - Đại học Thái Nguyên; Đảng ủy, Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo, Ban chủ nhiệm Khoa Chăn nuôi thú y, Bộ môn Bệnh động vật, Bộ môn Dược lý & Vệ sinh an toàn thực phẩm Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, tập thể cán bộ giảng dạy, các học viên cao học Trần Nhật Thắng, Nguyễn Thị Thu Hiền, Hoàng Thị Hồng Hạnh và sinh viên các khóa 39, 40,

41, 42 Khoa Chăn nuôi Thú y - Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên Đặc biệt, tôi xin trân trọng cảm ơn PGS TS Phạm Thị Tâm cùng các cán bộ giảng viên, học viên và sinh viên Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở - Hà Nội đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian triển khai đề tài

Tôi xin trân trọng cảm ơn Chi cục Thú y tỉnh Tuyên Quang, các Trạm Thú y và cán bộ, nhân dân địa phương của các huyện Yên Sơn, Sơn Dương, Hàm Yên và Chiêm Hóa - tỉnh Tuyên Quang đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài Tôi vô cùng biết ơn các thành viên trong gia đình và bạn bè đã luôn ở bên tôi, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành Luận án

Thái nguyên, ngày tháng năm 2017

NGHIÊN CỨU SINH

Phạm Thị Trang

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 3

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3

4 Những đóng góp mới của đề tài 3

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Cơ sở khoa học của đề tài 4

1.1.1 Bệnh tiên mao trùng ở động vật 4

1.1.2 Kỹ thuật sinh học phân tử trong sản xuất kháng nguyên của tiên mao trùng T evansi 12

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 20

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 20

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 24

1.3 Điều kiện tự nhiên, điều kiện kinh tế - xã hội của tỉnh Tuyên Quang 35

1.3.1 Điều kiện tự nhiên 35

1.3.2 Điều kiện kinh tế - xã hội 36

Chương 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.1 Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu 38

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 38

2.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 38

2.1.3 Vật liệu nghiên cứu 38

2.2 Nội dung nghiên cứu 43

2.2.1 Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trên đàn trâu ở tỉnh Tuyên Quang và áp dụng phác đồ điều trị 43

2.2.2 Nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT trong chẩn đoán bệnh tiên

mao trùng cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang 44

2.3 Phương pháp nghiên cứu 45

2.3.1 Phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trên đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang và áp dụng phác đồ điều trị 45

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu chế tạo Kit chẩn đoán bệnh 51

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 64

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 65

3.1 Tình hình nhiễm tiên mao trùng trên đàn trâu ở 4 huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang và áp dụng phác đồ điều trị hiệu quả 65

3.1.1 Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại 4 huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang 65

3.1.2 Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng theo lứa tuổi trâu tại tỉnh Tuyên Quang 67

3.1.3 Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo tính biệt 71

3.1.4 Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo mùa vụ 72

3.1.5 Kết quả xác định loài tiên mao trùng gây bệnh trên đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang 75

3.1.6 Áp dụng phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang 80

3.2 Nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang 83

3.2.1 Kết quả tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 của T evansi 83

3.2.2 Kết quả biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của T evansi 95

3.2.3 Kết quả nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng 108

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 131

1 Kết luận 131

2 Đề nghị 132

TÀI LIỆU THAM KHẢO 133

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 148

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

ADN: Acide Deoxyribo Nucleic

bp: base pair

CATT: Card Agglutination Test for Trypanosomiasis

CBB: Coomassie Brilliant Blue

DMSO: Di Methyl Sulfoxide

EDTA: Ethylene Diamine Tetra Acetic acid

IPTG: Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

ISG: Invanant Surface Glycoprotein

kb: kilobase

kDa: kiloDalton

LB: Luria Bertani

OD: Optical Density

PBS: Phosphat Buffered Saline

PCA: Plate Count Agar

PCR: Polymerase Chain Reaction

PMSF: Phenyl Methyl Sulfonyl Fluoride

PVDF: Poly Vinylidene Di Fluoride

RT - PCR: Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

SDS: Sodium Dodecyl Sulfat

SDS - PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate Poly Acrylamide Gel Electrophoresis spp.: Species pluralis

TEA: Tris - axit acetic - EDTA

TMB: Tetra Methyl Benzidine

VAT: Variable Antigen Type

VSG: Variant Surface Glycoprotein

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần gel Tricine - SDS 41

Bảng 2.2 Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 42

Bảng 2.3 Thành phần và chu trình nhiệt phản ứng PCR 48

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 54

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng Klewnov cắt đầu bằng sản phẩm PCR 54

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng lai tạo vector tái tổ hợp 55

Bảng 2.7 Thành phần phản ứng kiểm tra sự mang gen của vector tái tổ hợp bằng phản ứng PCR với cặp mồi F1.2 và R1.2 57

Bảng 2.8 Thành phần phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào vector biểu hiện 58

Bảng 3.1 Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại 4 huyệnthuộc tỉnh Tuyên Quang 65

Bảng 3.2 Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng theo tuổi trâu 68

Bảng 3.3 Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo tính biệt 71

Bảng 3.4 Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo mùa trong năm 72

Bảng 3.5 Danh sách chuỗi gen 18S của Trypanosoma evansi sử dụng so sánh và phân tích trong nghiên cứu 78

Bảng 3.6 Kết quả áp dụng phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng trên diện hẹp 80

Bảng 3.7 Thử nghiệm phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng trên diện rộng 82

Bảng 3.8 Bảng tổng hợp kết quả so sánh trình tự xác địnhvới các trình tự trên NCBI 92

Bảng 3.9 Kết quả xác định mật độ hạt latex và nồng độ kháng nguyên để tạo phức hợp kháng nguyên - hạt latex 111

Bảng 3.10 Kết quả xác định nhiệt độ và thời gian để tạo phức hợp kháng nguyên - hạt latex 112

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của chất nhuộm màu đến khả năng ngưng kết kháng nguyên - kháng thể 113

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ và chất ức chế phân giải proteinđến kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 115

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của nhiệt độ và chất ổn định protein đến kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 117

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của nhiệt độ và chất diệt khuẩnđến kháng nguyên tái tổ

hợp RoTAT 1.2 118Bảng 3.15 Xác định độ pha loãng kháng thể, thời gian và nhiệt độ phản ứng 121Bảng 3.16 Kết quả phản ứng sử dụng Kit CATT phát hiện kháng thể kháng 125Bảng 3.17 Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ bảo quản đến độ nhạy của

phản ứng khi sử dụng Kit CATT 127Bảng 3.18 Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ bảo quản đến độ đặc hiệu của

Kit CATT chế tạo 127Bảng 3.19 So sánh kết quả chẩn đoán bệnh tiên mao trùng của Kit CATT với

kỹ thuật ELISA và phương pháp tiêm truyền chuột 128Bảng 3.20 So sánh hiệu quả sử dụng Kit CATT với kỹ thuật ELISA và phương

pháp tiêm truyền chuột 129

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc của tiên mao trùng T evansi 4

Hình 1.2 Phương thức truyền lây tiên mao trùng T evansi 5

Hình 1.3 Sơ đồ vector pCR 2.1 17

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tách dòng và biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của T evansi 51

Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm Kit CATT từ kháng nguyên tái tổ hợp của T evansi 52

Hình 3.1 Biểu đồ tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu tại 4 huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang 66

Hình 3.2 Đồ thị biến động nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo lứa tuổi 68

Hình 3.3 Biểu đồ tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo tính biệt 71

Hình 3.4 Biểu đồ tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu theo mùa trong năm 73

Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen 18S của các mẫu Trypanosoma spp trên thạch agarose 1% 75

Hình 3.6 Hình ảnh chuyển nạp sản phẩm PCR của mẫu CH-VN; Tev-HY-VN; Tev-SD-VN và Tev-YS-VN vào tế bào E coli chủng DH5α-T 76

Hình 3.7 Điện di kiểm tra sản phẩm cắt ADN plasmid tái tổ hợp mang gen 18S bằng enzyme EcoRI 77

Hình 3.8 Cây phả hệ dựa trên trình tự nucleotide chuỗi gen 18S rRNA của các mẫu Tev-CH-VN; Tev-HY-VN; Tev-SD-VN và Tev-YS-VN nghiên cứu với các mẫu Trypanosoma evansi đã được đăng ký trong Ngân hàng gen 79

Hình 3.9 Kết quả điện di ADN tổng số 83

Hình 3.10 Kết quả điện di sản phẩm PCR của mẫu ADN tổng số 84

Hình 3.11 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR 85

Hình 3.12 Sơ đồ thiết kế vector tái tổ hợp pJET1.2 - RoTAT 1.2 87

Hình 3.13 Kết quả nuôi cấy vi khuẩn biến nạp trên môi trường LB có

ampicillin, chất chỉ thị màu X-gal, chất cảm ứng IPTG 88

Hình 3.14 Kết quả tách chiết ADN plasmid pJET1.2 - RoTAT 1.2 89

Hình 3.15 Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phản ứng PCR 90

Hình 3.16 Kết quả kiểm tra pJET1.2 - RoTAT 1.2-1 bằng EcoRI và SalI 91

Hình 3.17 Trình tự nucleotide và axit amin suy diễn của đoạn gen đích RoTAT 1.2 92

Hình 3.18 Kết quả tinh sạch sản phẩm cắt bằng hai enzyme EcoRI và SalI 94

Hình 3.19 Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp pET22 - RoTAT 1.2 vào tế bào vi khuẩn E coli BL21 95

Hình 3.20 Kết quả tách chiết ADN plasmid pET22 - RoTAT 1.2 95

Hình 3.21 Sản phẩm PCR kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22 - RoTAT 1.2 96

Hình 3.22 Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22 - RoTAT 1.2 97

Hình 3.23 Kết quả điện di Tricine-SDS PAGE các dòng plasmid tái tổ hợp 99

Hình 3.24 Phản ứng western blot kiểm tra tính đặc hiệu của protein RoTAT 1.2 99

Hình 3.25 Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 theo thời gian cảm ứng 100

Hình 3.26 Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các nhiệt độ nuôi cấy 101

Hình 3.27 Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các giá trị OD khác nhau 102

Hình 3.28 Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các giá trị pH khác nhau 103

Hình 3.29 Mức độ biểu hiện kháng nguyên RoTAT 1.2 ở các nồng độ kháng sinh ampicillin bổ sung khác nhau 104

Hình 3.30 Kết quả khảo sát nồng độ chất cảm ứng IPTG ở các nồng độ khác nhau 105

Hình 3.31 Kết quả khảo sát thời gian cảm ứng 106

Hình 3.32 Kết quả khảo sát nhiệt độ cảm ứng 107

Hình 3.33 Quy trình sản xuất Kit CATT 109

Hình 3.34 Đánh giá hiệu quả kết hợp kháng nguyên - kháng thể dựa trên thang điểm từ âm tính (-), nghi ngờ (+/-) và dương tính (1+) - (4+) 110

Hình 3.35 Quy trình chẩn đoán bệnh tiên mao trùng bằng Kit CATT và phương pháp tiêm truyền chuột 129

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Bệnh tiên mao trùng là bệnh phổ biến ở nhiều loài gia súc như trâu, bò, dê,

ngựa, hươu, lạc đà… Elshafie E I và cs (2013) [54], Kocher A và cs (2015) [66],

Tehseen S và cs (2015) [116] cho biết, bệnh do Trypanosoma evansi (T evansi) -

ký sinh trùng đường máu, thuộc giới động vật nguyên sinh Protozoa, lớp trùng roi

Flagellata, giống Trypanosoma gây nên Bệnh thấy ở hầu hết các nước châu Phi,

Nam Mỹ và châu Á Ở Việt Nam, bệnh tiên mao trùng thấy phổ biến ở khắp các vùng, miền

Alves F M và cs (2011) [35] cho biết, bệnh tiên mao trùng do đơn bào T

evansi gây ra, nếu chẩn đoán và điều trị không kịp thời gia súc có thể chết, gây thiệt

hại lớn cho người chăn nuôi Chính vì vậy, yêu cầu cấp thiết hiện nay là phải tìm ra một phương pháp chẩn đoán bệnh nhanh, độ chính xác cao, chi phí thấp, dễ dàng áp dụng trên phạm vi rộng để có thể điều trị kịp thời, giảm tỷ lệ chết do bệnh gây ra

Hiện nay, nước ta đã sử dụng nhiều phương pháp chẩn đoán bệnh tiên mao trùng như phương pháp phát hiện tiên mao trùng trực tiếp, phương pháp tập trung tiên mao trùng, phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm, chẩn đoán huyết thanh học, chẩn đoán sinh học phân tử Trong đó, phương pháp soi tươi và phương pháp nhuộm tiêu bản máu khô thường khó phát hiện tiên mao trùng; phương pháp tiêm truyền chuột nhắt trắng cho kết quả chính xác, song cần nhiều thời gian mới có kết quả; phương pháp sinh học phân tử có độ chính xác cao nhưng cần có trang thiết

bị hiện đại mới thực hiện được; phương pháp chẩn đoán huyết thanh học được đánh giá là có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho kết quả nhanh và có khả năng chẩn đoán với số lượng mẫu lớn trong thời gian ngắn

Các phương pháp chẩn đoán huyết thanh học bệnh tiên mao trùng được thực hiện dựa trên nguyên tắc dùng các phản ứng huyết thanh học đặc hiệu để phát hiện kháng thể hoặc kháng nguyên tiên mao trùng Tuy vậy, kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng lại rất đa dạng với nhiều epitope biến đổi khác nhau Việc lựa chọn một epitope kháng nguyên có tính ổn định và tính đặc hiệu với nhiều serotype của

tiên mao trùng là công việc cần thiết để đảm bảo phương pháp chẩn đoán có độ nhạy và đặc hiệu cao

Theo nghiên cứu của Vương Thị Lan Phương (2004) [28], Abou El Naga T và

cs (2012) [33], kháng nguyên RoTAT 1.2 có mặt ở hầu hết các VAT (Variable

Antigen Type - kháng nguyên biến đổi) của T evansi Urakawa T và cs (2001)

[121], Phạm Thị Tâm và cs (2013) [29] cho biết, Kit chẩn đoán chế tạo từ kháng nguyên tái tổ hợp có độ nhạy, độ đặc hiệu cao hơn Nguyễn Thị Kim Lan và cs (2015) [18] cho biết, kháng nguyên này được chế tạo bằng công nghệ gen cho khả năng phát hiện đặc hiệu tiên mao trùng đạt trên 98%

Tuyên Quang là một tỉnh miền núi phía Bắc có địa hình đồi núi, khí hậu nhiệt đới gió mùa, thời tiết nóng ẩm, thích hợp cho ruồi trâu, mòng - vật môi giới phát triển, hút máu và truyền bệnh tiên mao trùng từ trâu, bò bệnh sang trâu, bò khỏe Đây là một trong những tỉnh nằm trong vùng dịch tự nhiên, trâu, bò thường mắc ở thể mạn tính, có biểu hiện lâm sàng không rõ rệt nên rất khó phát hiện và phòng chống bệnh Hàng năm, trâu, bò bị ốm và chết khá nhiều trong vụ Đông - Xuân, khi thời tiết giá lạnh và thức ăn khan hiếm Cơ sở hạ tầng phục vụ công tác chẩn đoán và điều trị bệnh cho đàn gia súc tại địa phương vẫn còn nhiều hạn chế, dẫn tới hệ quả là bệnh tiên mao trùng trở nên phổ biến hơn, nghiêm trọng hơn và gây thiệt hại lớn hơn

Những phân tích ở trên đã cho thấy, mức độ phổ biến cũng như những tác hại do bệnh tiên mao trùng gây ra trên đàn gia súc nói chung và đàn trâu nói riêng ở nước ta, đặc biệt là ở các tỉnh trung du miền núi, trong đó, có tỉnh Tuyên Quang Vì vậy, việc nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm, chế tạo kit chẩn đoán và xác định phác

đồ điều trị hiệu quả bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang là hết sức cần thiết

Xuất phát từ yêu cầu cấp thiết của thực tiễn, để có cơ sở khoa học xây dựng quy trình chẩn đoán, quy trình phòng trị bệnh tiên mao trùng hiệu quả cho đàn trâu

ở tỉnh Tuyên Quang, chúng tôi đã thực hiện đề tài: "Nghiên cứu xác định tỷ lệ

nhiễm và chế tạo Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) ở đàn trâu tại tỉnh Tuyên Quang"

2 Mục tiêu của đề tài

- Xác định được tỷ lệ nhiễm, định danh loài tiên mao trùng gây bệnh và áp

dụng phác đồ điều trị hiệu quả cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang

- Chế tạo được Kit CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng có độ nhạy và độ đặc hiệu cao

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả của đề tài là những thông tin khoa học về tỷ lệ nhiễm, nghiên cứu chế tạo Kit chẩn đoán và biện pháp phòng chống bệnh tiên mao trùng hiệu quả trên đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang

Sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp phục vụ chế tạo Kit chẩn đoán là hướng nghiên cứu công nghệ cao khẳng định việc làm chủ công nghệ, sản phẩm của công nghệ cao đã và đang được ứng dụng vào thực tiễn sản xuất tại Việt Nam

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Chế tạo được Kit từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 của loài T evansi

phục vụ công tác chẩn đoán bệnh nhanh và kịp thời, áp dụng phác đồ điều trị bệnh hiệu quả, từ đó góp phần nâng cao số lượng và chất lượng đàn trâu, cải thiện đời sống cho người chăn nuôi

4 Những đóng góp mới của đề tài

Chế tạo được các bộ Kit từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 của loài T

evansi, Kit có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể áp dụng chẩn đoán nhanh bệnh

tiên mao trùng ở các địa phương

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cơ sở khoa học của đề tài

1.1.1 Bệnh tiên mao trùng ở động vật

1.1.1.1 Căn bệnh

Bệnh tiên mao trùng - Trypanosomiasis - là bệnh do ký sinh trùng đơn bào

Protozoa, lớp trùng roi Flagellata gây ra Có nhiều loài thuộc giống Trypanosoma

như: Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma evansi, Trypanosoma

congolense, Trypanosoma gambiense, Trypanosoma vivax, Trypanosoma simiae…

có khả năng gây bệnh cho người và động vật (Kumar A và cs., 1991 [69]) Ở Việt

Nam, bệnh tiên mao trùng do loài đơn bào Trypanosoma evansi (T evansi) gây ra

Tiên mao trùng T evansi có hình thoi, dài 18 - 34 m Giữa thân tiên mao

trùng có một nhân, phía cuối cơ thể có một roi, roi này chạy dọc theo thân và tạo thành nhiều màng rung động, cuối cùng roi lơ lửng ở phần đầu và thành roi tự do (Nguyễn Thị Kim Lan, 2011 [12])

Kinetoplast Màng rung

Nhân

Roi tự do

Hình 1.1 Cấu trúc của tiên mao trùng T evansi

(Nguồn: Desquesnes M., 2004 [48])

1.1.1.2 Vật chủ và vật môi giới truyền bệnh tiên mao trùng

Trong tự nhiên, tiên mao trùng ký sinh ở hầu hết các loài thú nuôi và thú hoang, thấy phổ biến hơn ở trâu, bò, ngựa, trâu bò rừng, hươu, nai, hổ, báo, sư tử, chó, mèo, lạc đà, voi, thỏ, chuột cống, chuột lang, chuột bạch , không ký sinh ở người (Phạm Sỹ Lăng và cs., 2008 [22], Hasan M U và cs., 2006 [63], Youssif F và cs.,

2008 [128])

Sự lây truyền bệnh tiên mao trùng từ trâu, bò ốm sang trâu, bò khỏe là nhờ

các loài ruồi hút máu (thuộc họ phụ Stomoxydinae) và các loài mòng hút máu (thuộc họ Tabanidae) Sự lây truyền này chỉ mang tính chất cơ học Như vậy, ruồi

và mòng hút máu là những vật môi giới truyền bệnh tiên mao trùng quan trọng Đây là một trong những cơ sở khoa học để xây dựng biện pháp phòng và tránh lây lan bệnh tiên mao trùng hiệu quả (Nguyễn Thị Kim Lan, 2012 [13]; Baldacchino

F và cs., 2014 [36])

Hình 1.2 Phương thức truyền lây tiên mao trùng T evansi

(Nguồn: Desquesnes M và cs., 2004 [48])

1.1.1.3 Dịch tễ học bệnh tiên mao trùng

Bệnh tiên mao trùng phân bố rất rộng, từ phía Tây sang phía Đông bán cầu Ở

châu Phi, T evansi hiện diện tại tất cả các quốc gia có lạc đà, từ Senegal (15° Bắc)

đến Kenya (xích đạo), trên vành đai Glossina T evansi được tìm thấy không chỉ ở

Mauritania, Morocco, Algeria, Tunisia, Libya, Ai Cập, Sudan, Eritrea và Ethiopia,

mà còn ở khu vực phía bắc của Mali, Burkina Faso, Niger, Nigeria, Chad, Somalia, Kenya Ngày nay, phân bố địa lý của bệnh liên tục từ khu vực phía bắc của châu Phi, qua Trung Đông đến khu vực Đông Nam Á Bệnh phổ biến ở trâu, bò và ngựa các nước nhiệt đới ở châu Phi, châu Á và Nam Mỹ (Haridy F M và cs., 2011 [62], Sumbria D và cs., 2014 [110])

Ở Việt Nam, bệnh tiên mao trùng đã được phát hiện thấy phổ biến ở hầu hết các vùng sinh thái khác nhau như miền núi, trung du, đồng bằng và ven biển (Phạm

Sỹ Lăng và cs., 2008 [22])

Mùa phát bệnh có liên quan chặt chẽ với mùa côn trùng hoạt động, thường vào khoảng từ tháng 5 đến tháng 9 hàng năm (Phan Địch Lân và cs., 2002 [23])

1.1.1.4 Đặc điểm gây bệnh của T evansi

Khi ruồi, mòng đốt, hút máu và truyền tiên mao trùng vào gia súc, tiên mao trùng xâm nhập vào da, tạo nên các vết viêm trên mặt da

Độc tố của tiên mao trùng tác động tới bộ máy tiêu hoá, gây rối loạn tiêu hoá, làm con vật ỉa chảy Hội chứng tiêu chảy thường xảy ra khi xuất hiện tiên mao trùng trong máu con vật bệnh

Khi sống trong huyết tương vật chủ, tiên mao trùng sử dụng protein huyết tương, làm giảm áp lực keo trong máu, nước sẽ từ máu thẩm thấu qua thành mạch quản vào gian bào của tổ chức gây hiện tượng thủy thũng Ngoài ra, khi tiên mao trùng sinh sản nhiều trong máu có thể làm tắc các mạch máu nhỏ và các mao mạch, làm tăng tính thấm thành mạch, dần dần tạo ra các ổ thuỷ thũng chất keo vàng dưới da

Sau khi xâm nhập vào máu ký chủ, tiên mao trùng sinh sản theo cấp số nhân

Số lượng tiên mao trùng nhiều thì lượng độc tố cũng tăng lên, tác động vào trung khu điều hòa nhiệt làm cho con vật sốt Khi động vật sốt cao là lúc trong máu có nhiều tiên mao trùng phát triển

Theo Phạm Sỹ Lăng và cs (2008) [22], trâu, bò bị bệnh tiên mao trùng thể hiện các triệu chứng lâm sàng chủ yếu như: sốt cao và gián đoạn, có biểu hiện rối loạn thần kinh, thủy thũng dưới da, gầy yếu, suy nhược, thiếu máu, viêm kết mạc và giác mạc mắt Một số trâu, bò bệnh bị ỉa chảy nặng, phân lỏng màu vàng, sau

chuyển màu xám, có lẫn bọt và chất nhầy Các đợt ỉa chảy tiếp theo những cơn sốt cách quãng

Trâu, bò bị bệnh mạn tính thường kéo dài, cơ thể suy yếu, liệt hai chân sau, nằm tư thế quỳ và không đi lại được Mặc dù nằm liệt nhưng vẫn ăn và nhai lại cho đến khi sắp chết Triệu chứng viêm giác mạc và kết mạc mắt thấy ở hầu hết trâu, bò mắc bệnh: mắt có dử trắng hay vàng, chảy liên tục, nếu nặng thì mắt sưng, đỏ ngầu Khi khỏi bệnh, mắt có màng trắng như cùi nhãn kéo che kín giác mạc

Con vật mắc bệnh tiên mao trùng khi chết gầy xơ xác, mổ khám thấy có những biến đổi bệnh tích đại thể rõ rệt ở hệ tuần hoàn và hô hấp: tim nhão, xoang bao tim tích nước vàng; phổi sung huyết và tụ máu từng đám; gan sưng to, nhạt màu; lách sưng, mềm nhũn và nhạt màu; hạch lâm ba sưng và tụ máu trong hạch; cơ nhão, màu nhợt nhạt, nhát cắt rỉ nước; xoang ngực và xoang bụng tích dịch màu vàng nhạt

1.1.1.5 Chẩn đoán bệnh tiên mao trùng

Việc chẩn đoán bệnh tiên mao trùng tương đối khó khăn vì căn bệnh có khi

có ở mạch máu ngoại vi, có khi không Do đó, cần phải chẩn đoán bằng nhiều phương pháp khác nhau:

* Phương pháp chẩn đoán lâm sàng

Biểu hiện lâm sàng của bệnh tiên mao trùng không phải lúc nào cũng phát hiện được Chính vì vậy, việc chẩn đoán qua triệu chứng lâm sàng ở trâu, bò có độ chính xác không cao Vì vậy, ngoài chẩn đoán qua các triệu chứng lâm sàng, cần phải tiến hành các phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm để có kết quả chẩn đoán chính xác

* Phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm

Việc phát hiện tiên mao trùng được thực hiện trên các mẫu máu, có thể xét nghiệm các mẫu máu này bằng hình thức soi tươi, cố định, nhuộm giemsa và một số

phương pháp huyết thanh học khác (Desquesnes M., 2004) [48] Cụ thể như sau:

- Phương pháp phát hiện tiên mao trùng

Để phát hiện tiên mao trùng, có thể áp dụng phương pháp soi tươi máu (Direct smear); phương pháp nhuộm giemsa tiêu bản máu khô (Romanovsky); phương pháp tập trung tiên mao trùng

- Phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm

Đây là phương pháp phổ biến, hiệu quả, chính xác và thường được ứng dụng nhiều trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng Ở phương pháp này, người ta tiêm truyền máu của động vật cần chẩn đoán cho động vật thí nghiệm (thường dùng chuột nhắt trắng) Sau đó, hàng ngày kiểm tra máu của động vật đã được tiêm truyền để phát hiện tiên mao trùng Nếu trong máu động vật này có tiên mao trùng thì kết luận động vật cần chẩn đoán bị nhiễm bệnh và ngược lại

Theo Lê Ngọc Mỹ (1994) [26], phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm là phương pháp chẩn đoán chính xác, nhưng nhược điểm của phương pháp này là khi cần chẩn đoán nhanh, với số lượng mẫu nhiều trong khoảng thời gian ngắn thì phương pháp này không thể đáp ứng được

- Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học

Khi tiên mao trùng ký sinh, cơ thể vật chủ sản sinh ra kháng thể đặc hiệu chống lại tiên mao trùng Những phương pháp sau cho phép phát hiện kháng thể kháng tiên mao trùng trong máu vật chủ:

Phản ứng ngưng kết trên bản nhựa (CATT/T evansi: Card Agglutination Test for Trypanosomiasis)

Đây là phương pháp ngưng kết trực tiếp giữa kháng nguyên và kháng thể trên bản nhựa, được dùng để phát hiện kháng thể trong máu động vật nhiễm bệnh

Phương pháp CATT có ưu điểm cho kết quả nhanh chóng, dễ thực hiện, đặc biệt có thể áp dụng trong điều kiện thực địa thiếu các dụng cụ chẩn đoán chuyên biệt

Nguyên lý của phương pháp: kháng nguyên tiên mao trùng đã được nhuộm màu sẽ kết hợp với kháng thể có trong huyết thanh của động vật nhiễm bệnh, tạo thành những đám kết tủa li ti màu xanh, đó là phản ứng dương tính Nếu động vật không nhiễm bệnh, trong máu không có kháng thể đặc hiệu, phản ứng kết hợp kháng nguyên - kháng thể không xảy ra và không có các đám kết tủa, đó là phản ứng âm tính

Phương pháp ngưng kết trên phiến kính (SAT: Slide Agglutination Test)

Phương pháp ngưng kết trên phiến kính là phản ứng giữa kháng nguyên tiên mao trùng sống có sẵn, với kháng thể có trong huyết thanh của động vật nghi nhiễm Phương pháp này đơn giản, dễ tiến hành và có thể áp dụng trên diện rộng Tuy nhiên phải thường xuyên lưu giữ giống tiên mao trùng để có tiên mao trùng sống thực hiện phản ứng này

Phương pháp LATEX (Latex Agglutination Test)

Phương pháp LATEX được dùng để phát hiện kháng thể có trong huyết thanh của gia súc mắc bệnh tiên mao trùng

Nguyên lý: Đây là phản ứng dùng kháng nguyên gắn hạt latex, khi gặp kháng thể đặc hiệu, kháng nguyên và kháng thể sẽ kết hợp với nhau thành đám lớn mà mắt thường có thể quan sát được Khi cho kháng nguyên trộn với kháng thể đặc hiệu tương ứng, phản ứng ngưng kết sẽ xảy ra Kháng nguyên và kháng thể kết hợp với nhau qua cầu nối kháng thể đặc hiệu Do mỗi cầu nối với kháng nguyên dưới hình thức mạng lưới nhiều chiều, tạo nên những đám ngưng kết biểu hiện bằng những đám lấm tấm hoặc lổn nhổn như những hạt cát hoặc những cụm bông lơ lửng Nhờ

có hạt latex gắn vào kháng nguyên, hiện tượng ngưng kết này trở nên dễ dàng quan sát hơn

Phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp IFAT (Indirect Fluorescent Antibody Test)

Trong nhiều trường hợp, để phát hiện phức hợp kháng nguyên - kháng thể, cần phải sử dụng một số kỹ thuật miễn dịch mới nhìn thấy được Phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp IFAT dùng kháng kháng thể đã được nhuộm chất phát huỳnh quang để phát hiện kháng nguyên cần chẩn đoán Trong phương pháp này có ba thành phần tham gia là kháng nguyên cần chẩn đoán, kháng thể đặc hiệu

và kháng kháng thể đã gắn chất phát huỳnh quang Do đó, phương pháp này còn được gọi là phương pháp hai lớp

Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Phương pháp ELISA là một trong những phương pháp hiện đại được ứng dụng để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng Phương pháp này đang được sử dụng rộng

rãi ở các nước trên thế giới Thuy N T và cs (2012) [118] cho biết, sử dụng phản

ứng ELISA có khả năng phát hiện trâu nhiễm T evansi với độ nhạy, độ đặc hiệu và

độ ổn định cao

Nguyên lý: Trong phương pháp này, người ta dùng kháng thể hoặc kháng thể kháng globulin (kháng kháng thể) có mang một enzyme (phosphatase hoặc peroxydase) được gắn lên mảnh Fc, cho kết hợp trực tiếp hoặc gián tiếp với kháng nguyên Sau đó, cho cơ chất sinh màu vào, cơ chất sẽ kết hợp với enzyme và bị phân hủy tạo nên màu So sánh với màu của quang phổ kế sẽ định lượng được mức độ của phản ứng

- Phương pháp phát hiện ADN của tiên mao trùng bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR được xem là phương pháp hiện đại nhất, được ứng dụng để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trong những năm gần đây

Nguyên lý: dựa vào phản ứng chuỗi polymerase để xác định sự có mặt ADN của tiên mao trùng trong máu động vật nhiễm bệnh

1.1.1.6 Phòng bệnh tiên mao trùng cho gia súc

Theo Tổ chức Thú y thế giới OIE (2012) [84], chưa có vắc xin đặc hiệu để phòng bệnh tiên mao trùng cho gia súc Vấn đề phòng bệnh tiên mao trùng thường được thực hiện bằng các phương pháp sau đây:

* Biện pháp phòng đối với vật chủ

Để phòng bệnh tiên mao trùng, cần thực hiện các biện pháp tổng hợp Ở những vùng có bệnh, vào mùa ruồi trâu và mòng hoạt động, cần kiểm tra máu cho toàn bộ gia súc Nếu có bệnh hoặc nghi có bệnh thì cần cách ly và điều trị kịp thời Khi có bệnh xảy ra, phải báo cáo chính quyền và các cơ quan thú y để công bố dịch

Có thể phòng bằng thuốc: dùng thuốc trypamidium, liều 0,5 mg/kgTT, pha thành dung dịch 1 - 2%, tiêm bắp thịt làm nhiều điểm để phòng bệnh tiên mao trùng (Nguyễn Thị Kim Lan, 2012 [13])

Ngoài ra, để tránh lây lan bệnh, cần thường xuyên kiểm tra và kịp thời phát hiện gia súc nhiễm tiên mao trùng Ở vùng có động vật nhiễm bệnh và những vùng lân cận, nên nuôi nhốt gia súc trong chuồng có lưới để ngăn côn trùng vào hút máu

và truyền bệnh cho những động vật khác (Barros A T M và Foil L D., 2007 [41])

* Biện pháp diệt ruồi, mòng - vật môi giới truyền bệnh

Để bắt ruồi, mòng hút máu truyền bệnh, hiện nay người ta đã chế tạo được một số loại bẫy bắt ruồi, mòng có hiệu quả, như bẫy Nzi, bẫy Vavoua, bẫy Malaise, bẫy Manitoba Các loại bẫy này thường được sử dụng với chất kích thích, thu hút thị giác, khứu giác của ruồi, mòng như dioxid carbon, octenol, amoniac để dễ dàng cho việc tiêu diệt chúng Các loại bẫy này nên được để ở những nơi tập trung nhiều ruồi, mòng như ở chuồng nhốt gia súc, nơi nước tù đọng (Hall M J và Wall R.,

2004 [61])

Mặt khác, người ta có thể diệt ruồi, mòng bằng biện pháp sinh học Các nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng các loài ong và côn trùng ký sinh, có khả năng gây hại, tiêu diệt ruồi, mòng; phân lập và sử dụng một số loài vi khuẩn gây bệnh trên ruồi, mòng để tiêu diệt chúng; dùng tia phóng xạ nhằm gây đột biến gen ở ruồi, mòng, làm mất khả năng sinh sản, ngăn chặn sự phát triển của chúng

Ngoài ra, có thể dùng các hoá dược tiêu diệt ruồi, mòng bằng cách tắm hoặc phun vào các vùng của cơ thể gia súc như chân trước, chân sau, đầu và bụng - là những nơi ruồi, mòng tấn công gia súc nhiều nhất Không nên sử dụng những thuốc này cho gia súc vào mùa mưa, vì các thuốc này có thể bị nước mưa rửa trôi, làm giảm tác dụng của thuốc

Mặc dù vậy, các biện pháp trên mới chỉ hạn chế được một phần sự phát triển của ruồi, mòng Để đạt hiệu quả tốt hơn, cần tiến hành kết hợp đồng thời nhiều biện pháp trên phạm vi rộng

1.1.1.7 Điều trị bệnh

Nhiều loại hóa dược đã được sử dụng để điều trị bệnh tiên mao trùng cho gia súc Naganin, novarsenobenzol, trypamidium, berenil (azidin) là những loại hóa dược đã được sử dụng trong nhiều năm ở nước ta nhưng cho kết quả không ổn định

Vì vậy, muốn nâng cao biện pháp điều trị bệnh tiên mao trùng cần điều trị bệnh

bằng biện pháp tổng hợp, vừa chú ý chăm sóc con vật ốm, vừa dùng một trong những thuốc đặc hiệu mới thu được kết quả tốt (Nguyễn Thị Kim Lan, 2012 [13])

1.1.2 Kỹ thuật sinh học phân tử trong sản xuất kháng nguyên của tiên mao trùng T evansi

1.1.2.1 Kháng nguyên của T evansi

Kháng nguyên bề mặt của loài T evansi gây bệnh tiên mao trùng có khả năng biến dị cao Chính vì vậy, việc chẩn đoán gia súc bị nhiễm bệnh bằng các phương pháp truyền thống sẽ gặp nhiều khó khăn Paim F C và cs (2011) [86] cho biết,

kháng nguyên của T evansi được chia làm hai loại: kháng nguyên biến đổi và kháng

nguyên không biến đổi

* Kháng nguyên biến đổi

Mỗi T evansi có một số lượng lớn gen mã hóa cho các protein bề mặt nên

khả năng biến đổi của chúng rất cao Trong khi hệ thống miễn dịch của vật chủ

chưa kịp sản xuất ra kháng thể thì các thế hệ mới của T evansi đã xuất hiện và hoàn

toàn có khả năng chống lại đáp ứng miễn dịch của vật chủ Từ phát hiện này, người

ta đã tập trung nghiên cứu cơ chế phân tử về khả năng ức chế hay kích hoạt các gen này để áp dụng cho công tác phòng chống bệnh tiên mao trùng hiệu quả

Nghiên cứu về miễn dịch học, Pays E và cs (2006) [89], Paim F C và cs (2011) [86] có đồng quan điểm, tiên mao trùng có khả năng biến đổi kháng nguyên

bề mặt để né tránh đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của vật chủ Tuy nhiên, sự biến đổi này đã có ngay ở pha đầu tiên của quá trình nhiễm (trước khi xuất hiện đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ) Chính vì thế, việc biến đổi này của tiên mao trùng không gặp phải trở ngại do chưa có sự chống đỡ và bảo vệ của hệ thống miễn dịch của vật chủ

Tiên mao trùng tồn tại và nhân lên trong dịch ngoại bào của vật chủ, đặc biệt

là trong máu Do đó, chúng phải đối mặt với hệ miễn dịch của vật chủ, áp lực chọn lọc đã khiến chúng thiết lập cơ chế để chống lại sự tác động bởi hệ miễn dịch của vật chủ

Khi xâm nhập vào cơ thể vật chủ, tiên mao trùng sẽ phải chống lại kháng thể đặc hiệu Sau khi vào cơ thể vật chủ, không phải bao giờ tiên mao trùng cũng gây rối loạn cho ký chủ Trên quan điểm miễn dịch, tiên mao trùng chỉ gây bệnh được nếu chúng hòa nhập với vật chủ đến mức không còn được xem là phần tử lạ Tiên mao trùng có thể sẽ bị tiêu diệt nếu phân tử kháng nguyên bề mặt VSG (Variant Surface Glycoprotein - Glycoprotein bề mặt biến đổi) bị kết hợp bởi kháng thể đặc hiệu Điều này chính là nguyên nhân thúc đẩy tiên mao trùng hoạt hoá gen để biến đổi kháng nguyên bề mặt, nhằm né tránh sự kết hợp của kháng thể đặc hiệu do cơ thể vật chủ sản sinh ra

Phạm Đức Chương và cs (2007) [3] cho biết, phần lớn ký sinh trùng thuộc động vật nguyên sinh đều có các cơ chế để tránh khỏi tác dụng đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ Các cơ chế này gồm: tác động ức chế đáp ứng miễn dịch của vật chủ; thay đổi để trở thành không có tính kháng nguyên, làm cho cơ thể vật chủ không sinh kháng thể chống lại ký sinh trùng khi chúng xâm nhập vào cơ thể; phát triển khả năng biến đổi kháng nguyên bề mặt, vô hiệu hóa tác dụng của kháng thể đặc hiệu Tiên mao trùng có thể che giấu kháng nguyên của nó bằng cách náu mình dưới các kháng nguyên của ký chủ (ví dụ, chúng được bao bọc bởi một lớp protein huyết thanh của ký chủ) Vì vậy, khi vào cơ thể, chúng không bị cơ thể vật chủ xem

là phần tử lạ nên không có đáp ứng miễn dịch chống lại chúng

Các VSG được mã hoá là nhờ tiên mao trùng có các gen chuyên biệt Từ kho chứa hàng nghìn gen khác nhau, một gen VSG được hoạt hoá một cách chọn lọc để tổng hợp ra một loại kháng nguyên VSG mới Khi các phân tử kháng nguyên VSG được thay đổi hoàn toàn bằng các phân tử VSG mới thì kháng thể đặc hiệu lúc trước

đã không còn tác dụng đối với kháng nguyên mới này nữa, và nhờ đó tiên mao trùng tiếp tục phát triển được trong cơ thể vật chủ Đây cũng chính là nguyên nhân dẫn đến việc tiên mao trùng có thể tồn tại trong máu ký chủ lâu dài và bệnh thường xảy ra ở thể mãn tính (Urakawa T và cs., 2001 [121], Nguyễn Thị Kim Lan và cs., 2008 [11], Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2009 [8])

Kháng nguyên của tiên mao trùng có thể biến đổi theo hai cách Cách thứ nhất: sử dụng lần lượt các điểm biểu hiện (Expression Side - Điểm biểu hiện) khác nhau Trong bộ gen của tiên mao trùng tồn tại một số lớn gen VSG, các gen có các cơ

chế sắp xếp khác nhau Do vậy, tiên mao trùng có nhiều VSG khác nhau Các điểm biểu hiện khác nhau sẽ mang các gen VSG khác nhau, sự luân phiên này dẫn đến sự thay đổi các kiểu kháng nguyên Cơ chế trên quan sát được chủ yếu ở giai đoạn đầu của quá trình cảm nhiễm, do ở giai đoạn đầu này chưa có đáp ứng miễn dịch của vật chủ đối với VSG Cách thứ hai: tập hợp lại các đoạn ADN khác nhau để tái tổ hợp gen hoặc chuyển đổi gen Việc tái tổ hợp này cho phép thay thế hoàn toàn hoặc từng phần gen Như vậy, một gen hoạt hoá được thay thế bằng bản sao chép của một gen khác đã biến đổi một phần hoặc hoàn toàn (Phạm Đức Chương và cs., 2007 [3], Urakawa T và cs., 2001 [121])

* Kháng nguyên không biến đổi (kháng nguyên ổn định)

Ở màng nguyên sinh chất tế bào, tiên mao trùng T evansi có ba loại kháng

nguyên không biến đổi: ISG 65, ISG 75 và ISG 100 (ISG: Invanant Surface Glycoprotein) Các loại kháng nguyên này không kết hợp với kháng thể của vật chủ

Trên bề mặt tế bào của tiên mao trùng có khoảng 30 loại kháng nguyên khác nhau Trong số tất cả các kháng nguyên bề mặt này, chỉ có kháng nguyên RoTAT 1.2 không bị biến đổi, độ ổn định cao Kháng nguyên RoTAT 1.2 có mặt ở hầu hết

các VAT (Variable Antigen Type) của T evansi Kháng nguyên RoTAT 1.2 là kháng nguyên bề mặt chính của T evansi Nó xuất hiện sớm, ngay sau khi ký

sinh trùng xuất hiện, đồng thời không gây phản ứng chéo với kháng thể đặc hiệu của các loài ký sinh trùng khác (Abou El Naga T và cs., 2012 [33]) Đây là kháng nguyên có thể sử dụng để tạo kháng thể đặc hiệu, hoặc trực tiếp ứng dụng

trong các phương pháp chẩn đoán phát hiện kháng thể kháng tiên mao trùng T

evansi Để sản xuất kháng nguyên này, phải ứng dụng kỹ thuật gen, thực hiện qua

các bước tách dòng gen mã hóa kháng nguyên bề mặt và biểu hiện gen, tinh sạch kháng nguyên

các tế bào chủ phân chia, tạo nên vô số các tế bào cùng mang một đoạn ADN cần thiết giống nhau, tạo nên một dòng tế bào tái tổ hợp mang gen cần tách dòng

Khuất Hữu Thanh (2006) [31] cho biết, tách dòng gen có thể được thực hiện theo nhiều phương pháp khác nhau Các phương pháp tách dòng gen chủ yếu được

sử dụng nhiều trong công nghệ sinh học phân tử là tách dòng in vitro (tách dòng thực nghiệm) và tách dòng in sillico (tách dòng ảo)

Tách dòng in vitro (tách dòng thực nghiệm) là tách dòng gen được thực hiện

từ các mẫu sinh học (mô tế bào, lông, tóc, dịch sinh học…) mang các gen cần tách

dòng hoặc tổng hợp nhân tạo đoạn gen cần tách dòng Tách dòng in vitro gồm các

phương pháp khác nhau, có thể tách dòng từ ADN, tách dòng từ ARN hoặc tách dòng trên cơ sở trình tự các axit amin trong chuỗi polypeptide…

Tách dòng in sillico (tách dòng ảo) là sự tổng hợp, phân tích các kết quả tách dòng gen in vitro, trên cơ sở thông tin từ các ngân hàng dữ liệu để lựa chọn một đoạn ADN hoặc một gen cần thiết nào đó Kết quả tách dòng in silico cho phép lựa

chọn phương án thiết kế vectơ tái tổ hợp có hiệu quả, dự đoán trước kết quả tách dòng, hiệu quả biểu hiện gen cũng như mức độ thành công của thực nghiệm

* Vector tách dòng

Vector tách dòng còn gọi là phương tiện vận chuyển gen Vector tách dòng thường là các phân tử ADN có kích thước nhỏ, cho phép cài (gắn) các gen cần thiết, có khả năng tái bản không phụ thuộc vào sự phân chia của tế bào Vector tách dòng phải có khả năng tồn tại trong tế bào vật chủ qua nhiều thế hệ, ít gây biến đổi bộ gen của tế bào vật chủ Các vector tách dòng phải mang các gen tín hiệu để dễ dàng nhận biết các tế bào mang vector tái tổ hợp

Mục đích của việc tách dòng là để thu nhận được gen hay một trình tự ADN tinh sạch với hàm lượng lớn

Vector tách dòng có 3 đặc tính cơ bản, đó là: có khả năng xâm nhập vào tế bào; có điểm mở đầu để tái bản, tức là có khả năng tái bản tích cực, không phụ thuộc vào sự sao chép của bộ gen tế bào chủ; các thể biến nạp phải dễ dàng được chọn lọc và sinh trưởng tốt trên môi trường thạch Khả năng chọn lọc được mã hóa

bởi các gen chọn lọc, thường có đặc tính kháng với chất kháng sinh (Khuất Hữu Thanh, 2006 [31])

Ngoài ra, vector tách dòng sẽ được xem là càng mạnh khi có thêm các ưu điểm sau đây: có kích thước nhỏ để có thể thu nhận được tối đa lượng ADN, dễ xâm nhập vào tế bào chủ và sao chép nhanh; tồn tại được qua nhiều thế hệ trong tế bào chủ và ít gây xáo trộn đối với quá trình trao đổi chất của tế bào chủ; mang các vị trí nhận biết duy nhất của nhiều loại enzyme giới hạn, và vị trí đó nằm trong các gen chọn lọc Trong số các loại vector hiện có thì plasmid được sử dụng phổ biến nhất

do dễ dàng nhân lên trong tế bào chủ và có kích thước nhỏ (1 - 200 kb) Các thế hệ plasmid ngày càng được cải tiến và mang các đặc tính mới, tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách dòng

- Các loại vector tách dòng

Khuất Hữu Thanh (2003) [30] cho biết, mỗi loại vector tách dòng có những

ưu, nhược điểm nhất định Tùy thuộc kích thước của gen cần tách dòng và đặc điểm của loại tế bào chủ để chọn loại vector tách dòng thích hợp

Vector tách dòng có bản chất là plasmid

Plasmid là những phân tử ADN có kích thước nhỏ (2 - 5 kb) dạng vòng, nằm trong nguyên sinh chất của tế bào vi khuẩn, nấm men Một số loại vector tách dòng thường được sử dụng như pCR 2.1, pBR322, pSC101

Plasmid pCR 2.1 là vector tách dòng đang được sử dụng phổ biến, có hiệu quả cao, với ưu điểm nổi bật là có thể gắn trực tiếp sản phẩm pCR vào vector đã

được cắt mở vòng do có sẵn hai đầu dính, mỗi đầu có một bazơ Timin

Vector pCR 2.1 có kích thước 3,9 kb, mang điểm khởi đầu tái bản của plasmid pUC nên có khả năng nhân lên với số lượng rất lớn trong tế bào vi khuẩn E coli

Vector được thiết kế có gắn một operon chuyển hóa đường lactoza là operon - lac

Sau vị trí promoter là đoạn LacZα mã hóa cho 146 axit amin đầu tiên của enzyme β - galactosidase, là vùng cắt gắn đa vị được thiết kế trên đoạn này với 17

vị trí cắt cho các enzyme giới hạn: EcoRI, HindIII, NsiI, KpnI, SacI, BamHI, SpeI,

BstXI, EcoRV, NotI, AvaI, PaeR7I, XhoI, XbaI, ApaI Trong đó, EcoRI và BstXI có

2 vị trí cắt, các enzyme còn lại chỉ có 1 vị trí cắt Với vị trí của vùng cắt đa điểm

như vậy, sản phẩm β - galactosidase có thể được tạo ra (nếu vector không được

dính đoạn ADN ngoại lai, khuẩn lạc màu xanh) hoặc không được tạo ra (nếu vector được dính đoạn ADN ngoại lai và khuẩn lạc có màu trắng trên môi trường thạch) Dựa vào dấu chuẩn đó, người ta có thể lựa chọn được những tế bào mang vector tái

tổ hợp với tần suất cao

Một ưu điểm nữa của pCR 2.1 là nó mang promoter của thực khuẩn thể T và các vị trí gắn mồi xuôi và ngược của thực khuẩn thể M13, nhờ đó có thể phiên mã được đoạn ARN antisense và đọc trình tự đoạn ADN

Ngoài ra, vector pCR 2.1 có chứa gen kháng kháng sinh ampicillin và kanamycin, nhờ đó mà có thể sinh trưởng bình thường trên môi trường có chứa ampicillin hoặc kanamycin với nồng độ ức chế tối thiểu

Hình 1.3 Sơ đồ vector pCR 2.1

Vector tách dòng là phagemid

Phagemid là các cloning vector được cấu tạo trên cơ sở của vector tách dòng plasmid pBR322 được gắn thêm đoạn khởi đầu tái bản (Ori) của phage fl, một đoạn có chứa promoter của phage T3, T7 và polycloning site - vị trí đa tách dòng Điển hình cho phagemid là nhóm plasmid bluescript, là loại plasmid mạnh được sử dụng nhiều trong công nghệ ADN tái tổ hợp

1.1.2.3 Kỹ thuật biểu hiện gen

Trong tế bào sống, biểu hiện gen được hiểu là quá trình sinh tổng hợp protein trong mối liên hệ: ADN → ARN → protein, protein là sản phẩm cuối cùng của quá trình này Trong kỹ thuật di truyền, biểu hiện gen là hiện tượng protein của gen ngoại lai được tổng hợp trong tế bào chủ

Vector biểu hiện gen là những vector tách dòng mang các promoter mạnh, cho phép biểu hiện đồng thời cả gen chỉ thị và gen tách dòng, tạo nên các protein lai

Một vector biểu hiện gen gồm các thành phần chủ yếu: promoter mạnh, trình

tự sao chép, vị trí khởi đầu phiên mã, vị trí bám của riboxom, tín hiệu kết thúc dịch

mã, các trình tự cắt nối và các gen chỉ thị

Các hệ thống biểu hiện gen

Biểu hiện gen tái tổ hợp là kỹ thuật quan trọng quyết định tính thành bại của

kỹ thuật gen Hiện nay, có 4 hệ thường được sử dụng biểu hiện gen là Escherichia

coli, Baculovirus, nấm men (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris) và tế bào

động vật Tuy nhiên, vi khuẩn E coli và nấm men là hai hệ biểu hiện chính hiện

đang được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và ứng dụng (Đái Duy Ban và Lữ Thị Cẩm Vân, 1994 [1])

Biểu hiện gen trong tế bào vi khuẩn

Vi khuẩn E coli là tế bào chủ được ưa chuộng nhất trong biểu hiện gen, do mang nhiều ưu điểm hơn so với các tế bào khác Vi khuẩn E coli có tốc độ sinh

trưởng nhanh, khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp mạnh, chỉ sau khoảng 8 giờ nuôi cấy ở điều kiện thích hợp đã có sản phẩm protein tái tổ hợp, khả năng tạo ra sản phẩm gen cao từ 50 - 500 mg/lít dịch nuôi cấy

Biểu hiện gen trong tế bào vi khuẩn E coli có thể làm giảm các chi phí cho công nghệ và hóa chất nên giá thành sản phẩm hạ Cấu trúc bộ gen E coli và

các đặc điểm di truyền đã được biết tương đối đầy đủ, tạo điều kiện thuận lợi khi

biểu hiện protein tái tổ hợp ở E coli Tế bào E coli có thể biểu hiện tốt các loại

protein không biến đổi cấu trúc phân tử sau khi dịch mã và không có quá trình glycosyl hóa

Có rất nhiều chủng vi khuẩn E coli được sử dụng trong biểu hiện gen, trong

đó chủng E coli BL21 là một trong những chủng E coli được sử dụng rộng rãi để

biểu hiện các loại gen khác nhau

Theo Khuất Hữu Thanh (2006) [31], ngoài những ưu điểm trên, việc sử

dụng vi khuẩn E coli trong biểu hiện gen cũng có những hạn chế nhất định Các

gen mã hóa các loại protein có kích thước lớn hơn 50 kDa, protein giàu cystein (ví dụ như gen mã hóa plasminogen) hoặc những sản phẩm protein có sự hình

thành liên kết disunfua (S - S) rất khó biểu hiện gen trên vi khuẩn E coli Một số chủng vi khuẩn E coli có thể gây bệnh hoặc có thể tạo độc tố khi biểu hiện gen

của sinh vật bậc cao

Biểu hiện gen trong tế bào nấm men

Nấm men là nhóm tế bào chủ cũng được sử dụng rộng rãi trong biểu hiện gen của sinh vật bậc cao Nấm men có nhiều ưu điểm như: cho phép sử dụng cả hai loại vector biểu hiện trong prokaryote và trong eukaryote; có thể biểu hiện protein kích thước lớn 50 kDa; có cấu trúc bộ gen đã được nghiên cứu đầy đủ và không gây bệnh cho sinh vật bậc cao

Nấm men có khả năng tạo sản phẩm nhanh, chỉ sau khoảng 8 giờ nuôi cấy đã

có sản phẩm protein tái tổ hợp, hiệu suất biểu hiện gen khá cao (50 - 5000 mg/lít dịch nuôi cấy)

Các vector biểu hiện trong tế bào nấm men thường có promoter AOX (gen alcohol oxidase) rất mạnh, có khả năng kiểm soát gen cần biểu hiện cao Biểu hiện gen trong tế bào nấm men có thể thực hiện các phản ứng glycosyl hóa chính xác, phản ứng cắt chuỗi tín hiệu hoặc thay đổi cấu trúc protein sau dịch mã (Khuất Hữu Thanh, 2003 [30])

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

* Những nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng

Kiểm tra máu của 73 trâu ở xã Tả Thanh Oai - Thanh trì - Hà Nội bằng phương pháp tiêm truyền chuột bạch, Nguyễn Quốc Doanh và cs (1996) [4] đã phát

hiện 13 trâu có T evansi trong máu, chiếm 17,80% Tác giả cũng đã kiểm tra mẫu

máu của 83 trâu ở xã Phấn Mễ bằng phương pháp Card - test, phát hiện 25 trâu nhiễm bệnh, chiếm 30,12%

Hà Viết Lượng (1998) [25] cho biết, tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở bò tại các tỉnh miền Trung là 8,99%

Nguyễn Quốc Doanh và Phạm Sỹ Lăng (2001) [5] đã kiểm tra 670 mẫu máu

rắn và 90 mẫu máu ba ba, thấy tỷ lệ nhiễm T evansi trung bình là 7,89%

Phan Văn Chinh (2006) [2] cho biết, tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trên trâu, bò tại một số tỉnh miền Trung cao nhất ở 4 - 8 năm tuổi (ở trâu là 12,71%, ở bò là 5,77%), thấp nhất là trâu, bò dưới 3 năm tuổi (ở trâu: 6,92% và ở bò: 2,31%)

Nguyen Q D và cs (2013) [79] đã xét nghiệm 585 mẫu huyết thanh trâu thu thập được tại Thái Nguyên và Cao Bằng, kết quả cho thấy: có 131 mẫu dương tính với tiên mao trùng, chiếm tỷ lệ 22,4% Trong đó, trâu dưới 3 năm tuổi có tỷ lệ nhiễm thấp nhất

Thu thập 484 mẫu huyết thanh trâu ở 5 tỉnh miền Bắc Việt Nam để xác định

tỷ lệ nhiễm T evansi bằng phản ứng CATT và ELISA, Nguyen T T và cs (2014) [80] đã phát hiện được 27,1% số mẫu dương tính với T evansi

Kiểm tra mẫu máu một số loài gia súc của các tỉnh Thái Nguyên, Hòa Bình, Lạng Sơn, Lai Châu, Khánh Hòa và Tây Ninh, Nguyễn Thị Kim Lan và cs (2014)

[15] cho biết, tỷ lệ nhiễm T evansi của các loại gia súc ở các tỉnh không giống nhau Tỷ lệ nhiễm T evansi cao nhất ở trâu (15,58%), sau đó đến bò (12,94%),

ngựa (10,26%), dê (9,52%) và thấp nhất là ở lợn (0,99%)

Một nghiên cứu khác của Nguyễn Thị Kim Lan và cs (2014) [16] cho thấy,

các chủng T evansi phân lập từ các loài gia súc khác nhau (trâu, bò, dê, ngựa, lợn) đều có khả năng gây nhiễm chéo cho nhau Tuy nhiên, thời gian xuất hiện T evansi trong máu, tỷ lệ gia súc xuất hiện T evansi và các triệu chứng lâm sàng của từng loại gia súc khác nhau, phụ thuộc vào nguồn gốc phân lập T evansi và loại gia súc

được gây nhiễm

Van Vinh Chau N và cs (2016) [122] cho biết, đã phát hiện một phụ nữ 38 tuổi ở miền Nam, Việt Nam có các triệu chứng sốt, nhức đầu và đau khớp Kiểm tra

huyết thanh học cho thấy, người này đã nhiễm T evansi Theo kết quả điều tra, các

tác giả dự đoán khả năng bệnh nhân đã bị nhiễm qua vết thương khi tiếp xúc với thịt

bò bị nhiễm T evansi

* Những nghiên cứu về vật môi giới truyền bệnh tiên mao trùng

Kết quả nghiên cứu của Bùi Quý Huy (2006) [10] cho thấy: thời gian xâm nhập của tiên mao trùng vào ruồi, mòng càng lâu thì tỷ lệ gây bệnh càng giảm, điều

này có thể do thời gian càng lâu thì số lượng và độc lực của T evansi trong ruồi,

mòng càng giảm dần

Phan Văn Chinh (2006) [2] đã nghiên cứu ở các tỉnh miền Trung và cho biết,

mòng thường chỉ hoạt động khoảng 9 tháng trong một năm Ruồi Stomoxys

calcitrans hoạt động quanh năm, từ tháng 1 đến tháng 12, đạt cao điểm từ tháng 5

đến tháng 8 Đây là điều kiện sinh thái thuận lợi cho các loài ruồi, mòng phát triển, hút máu súc vật và truyền tiên mao trùng Vì vậy, theo tác giả mùa lây lan bệnh thường xảy ra từ tháng 4 đến tháng 9 hàng năm

Trong tổng số 1.801 cá thể ruồi, mòng thu thập tại Thái Nguyên, Lạng Sơn, Lai Châu và Hòa Bình, Nguyễn Thị Kim Lan và cs (2014) [15] đã xác định được

815 cá thể là loài ruồi Stomoxys calcitrans, chiếm 45,25%; 399 cá thể là loài mòng

Tabanus kiangsuensis, chiếm 22,15% và 587 cá thể là loài mòng Tabanus rubidus,

chiếm 32,59%

* Những nghiên cứu về đặc điểm gây bệnh của T evansi trên trâu, bò

Phạm Sỹ Lăng và Tô Long Thành (2006) [21] cho biết, trâu, bò bị bệnh ở thể mạn tính thường suy yếu, liệt hai chân sau, nằm tư thế quỳ và không đi lại được Mặc dù nằm liệt nhưng vẫn ăn và nhai lại cho đến khi sắp chết

Theo dõi trâu gây nhiễm và trâu mắc bệnh tiên mao trùng tự nhiên ở thể cấp

và mạn tính, Phan Văn Chinh (2006) [2] cho biết: không có sự khác biệt về triệu chứng và bệnh tích ở số trâu này Trâu bị bệnh tiên mao trùng có số lượng hồng cầu giảm, số lượng bạch cầu tăng cao hơn so với trâu khỏe

Đỗ Thị Vân Giang (2014) [6] cho biết, trâu mắc bệnh tiên mao trùng thường

có các triệu chứng: sốt lên xuống, trung bình từ 3 đến 8 ngày xuất hiện một đợt sốt; mắt sưng, chảy nước mắt, mắt có dử đặc; gầy yếu, lông khô xù; thủy thũng dưới hàm, ngực và bụng Ở trâu gây nhiễm: số lượng hồng cầu giảm; số lượng bạch cầu

và tiểu cầu tăng

* Những nghiên cứu về phương pháp chẩn đoán bệnh tiên mao trùng

Phạm Sỹ Lăng (1982) [20] đã chẩn đoán bệnh tiên mao trùng bằng phản ứng ngưng kết trên phiến kính (SAT) Phản ứng xảy ra giữa kháng nguyên tiên mao trùng với kháng thể có trong máu động vật nghi nhiễm Tác giả cho thấy, phương pháp này có độ chính xác là 70 - 80%

Lê Ngọc Mỹ (1994) [26] đã bước đầu chế kháng nguyên tiên mao trùng và ứng dụng để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho gia súc

Bằng phản ứng ELISA, Lê Ngọc Mỹ (2002) [27] đã kiểm tra tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở trâu Việt Nam Kết quả cho thấy, tỷ lệ nhiễm tương đối cao (53,33%), trong đó, trâu ở các tỉnh vùng đồng bằng có tỷ lệ nhiễm thấp hơn so với trâu ở vùng núi và trung du

Vương Thị Lan Phương (2004) [28] đã nghiên cứu và cho thấy, T evansi gây

bệnh cho đàn trâu, bò ở Việt Nam có sự biến đổi lớn về kháng nguyên bề mặt Tuy nhiên, sau khi giải trình tự các gen quy định tính kháng nguyên, tác giả nhận thấy, trong tất cả các loại kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng, chỉ có kháng nguyên RoTAT 1.2

không bị biến đổi, có độ ổn định cao Tác giả đã tinh chế kháng nguyên của loài T

evansi để dùng trong phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp, ứng dụng để chẩn đoán

bệnh tiên mao trùng Kết quả: phản ứng có độ nhạy và độ đặc hiệu cao

Áp dụng phương pháp ELISA để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò tại huyện Phổ Yên, tỉnh Thái Nguyên, Trần Đức Hạnh và cs (2009) [7] cho biết: trong 239 mẫu huyết thanh trâu kiểm tra có 36 mẫu dương tính, chiếm 15,06%; có

43 mẫu trong 246 mẫu huyết thanh bò kiểm tra dương tính, chiếm 17,48%

Phạm Thị Tâm và cs (2013) [29] đã nghiên cứu thiết lập phản ứng ELISA để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho trâu, bò ở Việt Nam Kết quả cho thấy, độ nhạy của phản ứng là 97,96%, độ đặc hiệu là 98,68%

Nguyễn Mạnh Hùng và cs (2015) [9] đã nghiên cứu chế tạo Kit Latex chẩn

đoán nhanh bệnh tiên mao trùng do T evansi gây ra

Sau khi chế tạo thành công bộ Kit TUAF - CATT từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2, Nguyễn Thị Kim Lan và cs (2015) [18] đã tiến hành thử nghiệm, đánh

giá tình hình nhiễm T evansi trên 1.570 mẫu huyết thanh trâu, bò, dê và ngựa tại 4

tỉnh Thái Nguyên, Lai Châu, Lạng Sơn và Hòa Bình trong năm 2013 và 2014 Kết quả thử nghiệm cho thấy, Kit TUAF - CATT cho kết quả đồng dương tính với biện pháp tiêm truyền chuột bạch là 98,24% Như vậy, Kit TUAF - CATT phát hiện gia súc mắc bệnh tiên mao trùng tương đương với phương pháp tiêm truyền chuột bạch

Nguyen T T và cs (2015) [81] đã sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp TeGM6-4r trong phản ứng sắc ký miễn dịch ICT để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng Kết quả cho

thấy, phản ứng có thể phát hiện 100% mẫu huyết thanh trâu, bò bị nhiễm T evansi ở thực

địa và tương đồng với kết quả xét nghiệm bằng phản ứng ELISA

* Những nghiên cứu về biện pháp phòng, trị bệnh tiên mao trùng

Phạm Sỹ Lăng và cs (2008) [22] đã nghiên cứu và đề xuất một số biện pháp phòng chống bệnh tiên mao trùng cho trâu, bò như sau: hàng năm, định kỳ kiểm tra máu để phát hiện tiên mao trùng ở trâu, bò và điều trị vào thời kỳ trâu, bò nghỉ cày kéo (vào khoảng tháng 4 và tháng 8); áp dụng các biện pháp phòng, chống vật môi giới truyền bệnh; tăng cường chăm sóc, nuôi dưỡng và sử dụng hợp lý để nâng cao sức đề kháng cho trâu, bò

Phan Địch Lân (2004) [24] đã sử dụng novarsenobenzol liều 10 mg/kgTT 2 lần, cách nhau 2 ngày Kết quả cho thấy, thuốc có hiệu lực điều trị đạt 80%, tỷ lệ an toàn đạt 80 - 82%

Phạm Sỹ Lăng và cs (2008) [22] đã sử dụng naganin liều 10 mg/kgTT, pha với dung dịch nước muối sinh lý hoặc nước cất thành dung dịch 10%, tiêm tĩnh mạch để điều trị bệnh tiên mao trùng cho trâu, bò Thuốc có hiệu quả điều trị cao và

an toàn với gia súc

Nguyen Q D và cs (2013) [79] đã sử dụng trypamidium và berenil điều trị bệnh tiên mao trùng cho trâu ở tỉnh Thái Nguyên và Cao Bằng Kết quả cho thấy, cả hai loại thuốc đều có tác dụng điều trị tốt, trong đó, berenil đạt hiệu quả 100%

Qua kết quả thử nghiệm khả năng mẫn cảm của tiên mao trùng với 4 loại

thuốc trypanosoma, azidin, trypamidium samorin, diminavet trong điều kiện in vivo

và in vitro, Nguyễn Thị Kim Lan và cs (2013) [14] cho biết, tiên mao trùng mẫn

cảm nhất với trypamidium samorin, sau đó là diminavet, rồi đến azidin và ít mẫn cảm nhất với trypanosoma Kết quả thử nghiệm trên trâu ở diện hẹp và diện rộng cho thấy, phác đồ sử dụng thuốc trypamidium samorin kết hợp với truyền dung dịch nước muối sinh lý, vitamin C, vitamin B1 sau khi tiêm cafein trợ tim 30 - 45 phút cho trâu, bò cho hiệu quả điều trị bệnh cao nhất, tỷ lệ khỏi đạt 100% và rất an toàn đối với trâu, bò

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

* Những nghiên cứu về tình hình nhiễm tiên mao trùng

Goossens B và cs (2006) [58] đã nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng ở

bò thuộc khu vực Mafia Island (Tanzania) và cho biết: trong 970 mẫu đã phát hiện 0,8% có tiên mao trùng trong máu

Tại Ethiopia, Sinshaw A và cs (2006) [105] đã nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm

T vivax ở bò Kết quả cho thấy: bò nhiễm 6,1%, trong đó, mùa mưa nhiễm 9,6%,

mùa khô nhiễm 3,6% Tác giả cũng đã phát hiện 1/122 mẫu máu cừu có tiên mao trùng, chiếm 0,81%; đối với dê, có 1/676 mẫu nhiễm, chiếm tỷ lệ là 0,14%

Simukoko H và cs (2007) [101] đã nghiên cứu tình hình nhiễm tiên mao trùng

ở khu vực Đông Zambia và cho biết: trong tổng số 1.526 mẫu huyết thanh thu thập và kiểm tra, phát hiện được 14,4% số mẫu có kháng thể kháng tiên mao trùng Trong đó,

tỷ lệ nhiễm T congolense chiếm tới 96%, nhiễm T vivax là 2% và T brucei là 2%

Desquesnes M và cs (2009) [49] cho biết, hình thái tiên mao trùng khi ở trong vòi ruồi, mòng biến đổi theo thời gian: từ 1 - 34 giờ, tiên mao trùng có hình thái, kích thước bình thường; 35 - 45 giờ: tiên mao trùng có hình dạng thay đổi, tăng kích thước chiều rộng và thô dần; 46 - 53 giờ, tiên mao trùng trương to, duỗi thẳng, mất khả năng di động và ngừng hẳn hoạt động Như vậy, khoảng thời gian từ khi tiên mao trùng vào vòi hút của ruồi, mòng đến 45 giờ là thời gian tiên mao trùng còn khả năng gây bệnh cho động vật nhiều nhất

Theo Alan Gunn và Sarah J P (2012) [34], T evansi không có giai đoạn phát triển ở trong bất kỳ một ký chủ trung gian nào T evansi sinh sản bằng hình thức trực phân ở trong cơ thể động vật máu nóng Tác giả cho biết, T evansi có một

giai đoạn sống trong cơ thể ruồi, mòng nhưng không sinh sản và phát triển Nhờ ruồi, mòng mà tiên mao trùng được truyền từ động vật này sang động vật khác và làm cho bệnh lây lan

Kiểm tra 1.664 mẫu máu của các loài gặm nhấm ở Lào, Campuchia và Thái Lan, Milocco C và cs (2012) [75] cho biết, chỉ có 21/1.664 mẫu (1,26%) dương tính với tiên mao trùng

Mcinnes L M và cs (2012) [74] cho biết, trong 179 mẫu máu trâu thu thập

ở 3 tỉnh của Philippine có 140 mẫu nhiễm T evansi

Eberhardt A T và cs (2014) [51] đã nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm tiên mao

trùng T evansi trong các mẫu thu thập được từ 60 chuột ở vùng Esteros del Iberá thuộc tỉnh Corrientes, Argentina Kết quả cho thấy, tỷ nhiễm T evansi là 10%

Fereig R M và cs (2017) [55] đã áp dụng phản ứng ELISA để xác định sự

lưu hành của Babesia bovis, Babesia bigemina, T evansi và Anaplasma marginale

ở miền nam Ai Cập Kết quả cho thấy, trong tổng số 301 mẫu huyết thanh gia súc,

có 27 mẫu dương tính với Babesia bovis, 100 mẫu dương tính với Babesia

bigemina, 127 mẫu dương tính với T evansi và 25 mẫu dương tính với Anaplasma marginale

Campigotto G và cs (2017) [44] đã tiến hành 2 thử nghiệm nhằm nghiên cứu

sự lây truyền T evansi qua đường sinh dục và truyền từ mẹ sang con Kết quả cho thấy,

T evansi không lây truyền qua đường sinh dục mà chỉ lây truyền từ mẹ sang con

* Những nghiên cứu về đặc điểm gây bệnh của T evansi trên trâu, bò

Tình trạng thiếu máu được thể hiện rõ trong bệnh do T evansi gây ra Theo

Tamarit A và cs (2010) [113], tiên mao trùng làm số lượng hồng cầu và hàm lượng huyết sắc tố giảm, số lượng bạch cầu tăng, thành phần bạch cầu thay đổi: bạch cầu lymphô, bạch cầu ái toan tăng nhưng bạch cầu trung tính giảm, protein tổng số và albumin giảm rõ rệt

Da Silva A S và cs (2011) [45] cho biết, các dấu hiệu lâm sàng về thần

kinh và vận động thường xuất hiện ở động vật bị nhiễm T evansi

Theo Defontis M và cs (2012) [47], khi lên cơn sốt, những trâu, bò mắc bệnh ở thể cấp tính có thể có biểu hiện điên loạn, mắt đỏ ngầu, lao đầu vào tường, chạy vòng quanh kêu rống lên Trường hợp nhẹ thấy trâu, bò run rẩy từng cơn, mắt trợn ngược rồi đổ ngã vật xuống, sùi bọt mép giống như bị cảm nắng

Da Silva A S và cs (2012) [46] cho rằng, ở trâu, bò bệnh, triệu chứng phù thũng dưới da thường thấy ở vùng thấp của cơ thể như ở bốn chân (từ khớp khuỷu trở xuống), phần yếm, ngực, bộ phận sinh dục và đôi khi còn thấy ở trên các mô mặt, mi mắt và tai của con vật

Verdillo J C và cs (2012) [124] đã nghiên cứu và so sánh sự khác nhau

giữa khả năng gây bệnh của 3 chủng T evansi phân lập ở Luzon, Visayas và

Mindanao Philippines Kết quả cho thấy, cả 3 chủng đều gây ra các tổn thương giống nhau ở gan, lá lách, phổi và triệu chứng lâm sàng như nhau ở các trâu nhiễm bệnh

Pascucci I và cs (2013) [88] đã nghiên cứu và thấy, ở thể bệnh cấp tính, trâu, bò thường gầy sút nhanh, chỉ sau 7 - 14 ngày từ khi phát bệnh, con vật đã gầy rộc, mắt trũng sâu Nếu bệnh kéo dài thì con vật gầy xơ xác, lông dựng ngược, da khô nhăn nheo, niêm mạc mắt nhợt nhạt, lông dễ rụng, dần dần suy nhược cơ thể nặng, mất khả năng cày kéo và sinh sản Trong thực tế, có khoảng 3% trâu bệnh ở thể ẩn vẫn béo khoẻ, làm việc bình thường khi được chăm sóc nuôi dưỡng tốt

Pandey V và cs (2015) [87] đã xét nghiệm mẫu máu của 5 trâu cái khỏe và

10 trâu cái bị nhiễm T evansi Kết quả nghiên cứu cho thấy, ở trâu nhiễm bệnh có

sự giảm đáng kể hemoglobin, đại thực bào và tăng enzyme superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), aspartate transaminase (AST) so với trâu khỏe mạnh

Misra K K và cs (2016) [76] cho biết, T evansi thường gây ra các triệu

chứng thần kinh Động vật nhiễm bệnh thường có một số triệu chứng tương tự như bệnh sốt rét ở người

Singh S K và cs (2016) [104] cho biết, ở trâu nhiễm T evansi, hoạt tính của

cholinesterase thấp hơn đáng kể so với trâu khỏe mạnh Điều này có liên quan đến

sự rối loạn thần kinh ở trâu khi bị nhiễm bệnh này

Wada Y A và cs (2016) [126] đã nghiên cứu và thấy, bệnh do T brucei và

T evansi có thể gây ra những tổn thương ở tinh hoàn, giảm tinh trùng và là nguyên

nhân quan trọng gây vô sinh ở những gia súc đực

Theo kết quả nghiên cứu của Ogundele F A và cs (2016) [83], T evansi ký

sinh gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến hiệu quả sinh sản của các gia súc đực

Shaapan R M (2016) [97] đã nghiên cứu một số bệnh phổ biến gây sảy thai

và cho biết, một số trường hợp sảy thai đã được ghi nhận ở trâu bị nhiễm T evansi Đặc biệt, tại Ấn Độ đã phát hiện một trường hợp người nhiễm T evansi bị sảy thai

Theo Baldissera M D và cs (2016) [38], T evansi có khả năng gây peroxid

hóa lipid trong mô thận, làm thay đổi tình trạng oxy hóa và gây nên các tình trạng bệnh lý ở thận của động vật nhiễm bệnh

Kết quả nghiên cứu của Krishnamoorthy P và cs (2016) [67] cho thấy: những thay đổi mô bệnh học chủ yếu xảy ra ở gan, thận, lá lách và tim, không có

biến đổi ở tinh hoàn và cơ bụng của động vật gây nhiễm T evansi

* Những nghiên cứu về phương pháp chẩn đoán bệnh tiên mao trùng

Ngaira J M và cs (2003) [77] đã dùng phương pháp CATT và phương pháp Suratex để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở lạc đà tại Kenya Kết quả cho thấy, độ nhạy của phương pháp CATT là 68,6% và của phương pháp Suratex là 58,8%; độ đặc hiệu của cả 2 phương pháp đều là 100%

Để đánh giá độ nhạy của các phương pháp chẩn đoán bệnh tiên mao trùng, trong năm 2002 - 2003, Singh N K và cs (2004) [102] đã tiến hành kiểm tra 217 mẫu máu lạc đà ở Tây Rajasthan (Ấn Độ) bằng các phương pháp PCR, Ag - ELISA (ELISA kháng nguyên), TBS (Stained thin Blood Smear - tiêu bản máu nhuộm theo

phương pháp giọt mỏng) và WBF (Wet Blood Film - tiêu bản máu tươi) Kết quả của nghiên cứu cho thấy, độ nhạy của phương pháp PCR là 100%; Ag - ELISA là 56,75%; TBS là 27,02% và WBF là 24,32%

Hilali M và cs (2004) [64] cũng đã sử dụng phương pháp CATT để kiểm tra

200 mẫu máu trâu thu thập từ các lò giết mổ Kết quả phát hiện được 48 mẫu dương

tính với T evansi (chiếm 24%)

Njiru Z K và cs (2004) [82] đã thu thập 549 mẫu máu lạc đà tại Kenya để

xác định tỷ lệ nhiễm T evansi và xét nghiệm bằng 3 phương pháp PCR, CATT và

ly tâm microhematocrit (MHCT) Kết quả cho thấy, phương pháp ly tâm MHCT chỉ phát hiện được 5,3% số mẫu dương tính; phương pháp PCR phát hiện được 26,6%

số mẫu dương tính và phương pháp CATT phát hiện được 45,9% số mẫu dương

tính với T evansi

Holland W G và cs (2005) [65] đã so sánh khả năng phát hiện T evansi của

các phương pháp chẩn đoán Kết quả thấy, phương pháp PCR cho tỷ lệ dương tính

là 78,2%, phương pháp tiêm truyền chuột là 74%

Thekisoe O M và cs (2005) [117] đã so sánh độ nhạy của một số phương

pháp phát hiện T evansi Kết quả cho thấy, phương pháp PCR, TBS và MHCT có

độ nhạy lần lượt là 33%, 38% và 24% Tất cả các phương pháp đều có độ đặc hiệu đạt trên 60%

Theo kết quả nghiên cứu của Fernandez D và cs (2009) [56], phương pháp

PCR phát hiện T evansi có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao

Sharma P và cs (2012) [99] đã sử dụng phương pháp PCR và các phương pháp thông thường để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho 80 bò và 29 trâu ở Ludhiana (Ấn Độ) Bằng các phương pháp thông thường phát hiện 2,5% số bò và

3,45% số trâu dương tính với T evansi Bằng phương pháp PCR, phát hiện 12,5%

số bò và 13,79% số trâu nhiễm đơn bào này

Theo Takeet M I và cs (2012) [112], bằng phương pháp phát hiện tiên mao trùng trực tiếp trong 411 mẫu máu động vật thu thập tại Nigeria, có 15,1% số mẫu

dương tính với T brucei, T congolense hoặc T vivax Bằng phương pháp PCR, phát hiện 63,7% số mẫu dương tính với ít nhất một trong bốn loài T brucei,

T congolense, T evansi và T vivax

Berlin D và cs (2012) [42] đã chẩn đoán bệnh tiên mao trùng bằng Kit CATT, phát hiện được 9/139 (chiếm 6,5%) mẫu huyết thanh ngựa ở khu vực Biển Arava và 5/122 (chiếm 4,1%) mẫu thu thập ở khu vực Biển Chết nhiễm tiên mao

trùng T evansi

Elshafie E I và cs (2012) [53] đã sử dụng phương pháp CATT để xác định

tỷ lệ nhiễm Trypanosoma spp trong 527 mẫu máu ngựa từ tám bang ở bán đảo

Malaysia Kết quả đã phát hiện được 13,90% số mẫu huyết thanh dương tính

Theo Singh N K và cs (2012) [103], kiểm tra bằng phương pháp huyết thanh học và phương pháp nhuộm giemsa, trong tổng số 703 bò thu thập tại Punjab,

Ấn Độ, có 22,9% (161/703) bò bị nhiễm tiên mao trùng T evansi

Elhaig M M và cs (2013) [52] cho biết, bằng phương pháp nhuộm giemsa

phát hiện 12/100 mẫu máu lạc đà thu thập tại Ismailia (Ấn Độ) dương tính với T

evansi Bằng phương pháp PCR đã phát hiện 46/100 mẫu dương tính với T evansi

Kundu K và cs (2013) [69] đã áp dụng phương pháp ELISA để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở trâu Kết quả cho thấy, phương pháp này có độ đặc hiệu đạt 89,15% và độ nhạy là 100%

Villareal M V và cs (2013) [124] đã sử dụng phương pháp PCR phân tích

79 mẫu huyết thanh thu thập từ các ổ dịch để đánh giá mức độ phổ biến và đa dạng

sinh học của các các chủng T evansi Kết quả cho thấy, có sự tương đồng cao 99 - 100% và khoảng cách di truyền tương đối nhỏ giữa các chủng T evansi phân lập từ

Philippine, Thái Lan và Ai Cập

Yadav S C và cs (2014) [127] đã sử dụng phản ứng ELISA để xác định hiệu

giá kháng thể của những con vật nhiễm T evansi Kết quả cho thấy, hiệu giá kháng thể

đạt cao nhất ở ngày thứ 10 đến 14 sau khi nhiễm, bắt đầu giảm dần từ ngày thứ 17, đến ngày thứ 180 gần như không có kháng thể trong máu tất cả các động vật thí nghiệm

Sengupta P P và cs (2014) [100] đã xét nghiệm các mẫu huyết thanh trâu,

bò, lạc đà và ngựa thu thập từ các bang khác nhau của Ấn Độ bằng phản ứng ELISA Kết quả cho thấy, phản ứng có độ nhạy là 95,6%, độ đặc hiệu là 98,0%