Giới thiệu kỹ thuật giải trình tự gen và Real - Time PCR pot

TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004 Giới thiệu kỹ thuật giải trình tự gen và Real - Time PCR Lê Văn Phủng* Trờng Đại học Y Hà Nội 1. Kỹ thuật giải trình tự gen Giải trình tự gen là tìm ra trình tự sắp xếp của các nucleotides trên đoạn gen đợc quan tâm nhằm phát hiện sự đột biến gen hoặc để thiết kế gen mồi (primer) và các vector tách dòng (cloning) nhằm tạo ra các protein tái tổ hợp có giá trị cao trong Y học (vaccine, thuốc chữa bệnh, các sinh phẩm phục vụ chẩn đoán bệnh hoặc nghiên cứu khoa học). Kỹ thuật giải trình tự gen đợc công bố năm 1975 bởi Sanger (nguyên lý enzym) và Maxam - Gilbert năm 1977 (nguyên lý phân giải hoá học). Hiện nay, các kỹ thuật này đã đợc cải tiến rất nhiều nhờ những tiến bộ mới về khoa học và công nghệ (Hoá học, Vật lý, Điện tử và Công nghệ thông tin), làm cho hiệu suất của việc giải trình tự gen ngày một cao; ngời ta có thể giải một trình tự dài hàng nghìn cặp base chỉ trong vòng vài tiếng đồng hồ, điều mà trớc đây phải làm hàng tuần. Có nhiều kỹ thuật giải trình tự gen, sau đây xin giới thiệu một kỹ thuật hiện nay đang đợc áp dụng phổ biến thông qua một ví dụ cụ thể, giải mã gen FliC. Gen FliC là gen mã hoá cho kháng nguyên lông (protein) pha I của vi khuẩn Salmonella. Các Salmonella có lông thì đều có kháng nguyên này, nhng tính đặc hiệu thì khác nhau ở mỗi loài. Sự khác nhau này là do mã hoá khác nhau (trình tự các nucleotides khác nhau) ở gen FliC quy định. Chính vì vậy, giải đợc trình tự gen FliC sẽ cho phép thiết kế đợc các gen mồi đặc hiệu cho từng loài Salmonella nhằm phát triển các kỹ thuật sinh học phân tử (chẳng hạn PCR) để chẩn đoán đặc hiệu cho từng loài hoặc phục vụ cho các nghiên cứu tìm kiếm vaccine có độ đặc hiệu và công hiệu cao. Để giải trình tự đợc gen FliC, bớc đầu tiên là phải thiết kế cặp mồi đặc hiệu. Cặp mồi này đã đợc thiết kế tại Labo trung tâm Y Sinh học, đợc đặt tên là FliC_b_seqF (aag cgg cta ttt cgc cgc c = 19 nucleotides) và FliC_b_SeqR (cgt gtc ggt gaa tca atc gc = 20 nucleotides). Các trình tự này đã đợc gửi đi tổng hợp thành các olignucleotide tại Công ty Invitrogen (Hồng Kông). Để thiết kế đợc các cặp mồi này, các thông tin về gen FliC phải đợc thu thập tr ớc trên các ngân hàng dữ liệu gen (GenBank hoặc EMBL chẳng hạn). Bớc thứ hai là tách chiết ADN từ các chủng Salmonella, các ADN này sẽ dùng làm khuôn trong phản ứng PCR ở bớc tiếp theo. Quá trình tách chiết này không khó, các Labo sinh học phân tử đều có thờng quy này. Bớc thứ ba là chạy PCR lần 1 với cặp mồi và ADN khuôn nói trên. Điều kiện tối u cho phản ứng PCR này phải dò tìm, nếu máy PCR có chơng trình Gradient thì việc tìm kiếm các điều kiện nhiệt độ tối u sẽ thuận lợi hơn nhiều. Bớc thứ t là tinh sạch sản phẩm của phản ứng PCR nói trên. Có thể dùng phơng pháp tách băng ADN đặc hiệu ngay trên thạch điện di (rẻ tiền) hoặc dùng KIT thơng mại (đắt hơn). Bớc thứ năm là chạy PCR lần hai. Khác với PCR lần 1, lần này trong hỗn hợp phản ứng, ngời ta cho thêm dideoxynucleoside triphosphate (hai vị trí, trong đó có vị trí 3, không có nhóm OH - ) có gắn chất màu huúnh quang. Hiện nay, kỹ thuật đã cho phép gắn các chất màu huúnh quang khác nhau trên 4 loại nucleotide này, vì vậy, chỉ cần làm một phản ứng PCR trong một ống duy nhất chung cho cả 4 loại nucleotide (A, C, G và T); so với trớc đây phải làm 4 phản ứng riêng rẽ ở 4 ống. 26 * PGS. TS. Trởng Labo trung tâm, Phó chủ nhiệm Bộ môn Vi sinh vật - Trờng Đại học Y Hà Nội. TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004 Bớc thứ sáu là làm tinh sạch sản phẩm (ADN) của phản ứng PCR 2 và làm biến tính chúng để tạo ra ADN sợi đơn duỗi thẳng. Bớc thứ bảy là đa ADN đã đợc xử lý vào máy giải trình tự gen để đọc tự động trình tự các nucleotide trên FliC. Có thể chỉ đọc một sợi hoặc đọc đồng thời cả hai sợi để tăng độ chính xác của các trình tự đợc đọc ra. Kết quả của quá trình giải trình tự gen FliC đợc lu trong máy dới hai dạng (hình ảnh và chữ). Kết quả này đã đợc so sánh với các dữ liệu cùng loại có trong ngân hàng gen (GenBank, www. ncbi. nlm. nih. gov) và đã đợc đăng ký và công bố chính thức với số truy cập là AY657000 và AY657001. Sau đây xin giới thiệu gen FliC của Salmonella paratyphi B (Hình 1). Hình 1. Gen FliC - b của Salmonella paratyphi B trên GenBank (http: //www. ncbi. nlm. nih. gov) 27 TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004 Các gen FliC của 5 Salmonella khác nhau đã đợc giải trình tự và so sánh với nhau để tìm ra vùng đặc trng cho mỗi loài, trong đó FliC - a là gen FliC của Salmonella paratyphi A, FliC - b là của Salmonella paratyphi B, FliC - c là của Salmonella paratyphi C, FliC - d là của Salmonella typhi và FliC - i là của Salmonella typhimurium; dấu * là biểu diễn các vị trí giống nhau và dấu . là biểu hiện các vị trí khác nhau. FliC - a 1: ATGGCACAAGTCATTAATACAAACAGCCTGTCGCTGTTGACCCAGAATAACCTGAACAAA 60 FliC - b 1: ATGGCACAAGTCATTAATACAAACAGCCTGTCGCTGTTGACCCAGAATAACCTGAACAAA 60 FliC - c 1: ATGGCACAAGTCATTAATACAAACAGCCTGTCGCTGTTGACCCAGAATAACCTGAACAAA 60 FliC - d 1: ATGGCACAAGTCATTAATACAAACAGCCTGTCGCTGTTGACCCAGAATAACCTGAACAAA 60 FliC - i 1: ATGGCACAAGTCATTAATACAAACAGCCTGTCGCTGTTGACCCAGAATAACCTGAACAAA 60 ************************************************************ FliC - a 61: TCCCAGTCCGCTCTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCCGGTCTGCGTATCAACAGC 120 FliC - b 61: TCCCAGTCCGCTCTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGTCTGCGTATCAACAGC 120 FliC - c 61: TCCCAGTCTGCTCTGGGTACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCCGGTCTGCGTATCAACAGC 120 FliC - d 61: TCCCAGTCCGCACTGGGCACTGCTATCGAGCGTTTGTCTTCCGGTCTGCGTATCAACAGC 120 FliC - i 61: TCCCAGTCCGCTCTGGGCACCGCTATCGAGCGTCTGTCTTCCGGTCTGCGTATCAACAGC 120 ********.**.*****.**.************.*******.****************** FliC - a 121: GCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCAATTGCTAACCGTTTCACCGCGAACATCAAAGGT 180 FliC - b 121: GCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTTACCGCGAACATCAAAGGT 180 FliC - c 121: GCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTCACCGCGAACATCAAAGGT 180 FliC - d 121: GCGAAAGACGATGCGGCAGGACAGGCGATTGCTAACCGTTTTACCGCGAACATCAAAGGT 180 FliC - i 121: GCGAAAGACGATGCGGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTTACCGCGAACATCAAAGGT 180 ********************.*****.**************.****************** FliC - a 181: CTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGC 240 FliC - b 181: CTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGC 240 FliC - c 181: CTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATTTCTATTGCGCAGACCACTGAAGGC 240 FliC - d 181: CTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGC 240 FliC - i 181: CTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGC 240 ***********************************.**.********************* FliC - a 241: GCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCT 300 FliC - b 241: GCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCT 300 FliC - c 241: GCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCT 300 FliC - d 241: GCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCG 300 FliC - i 241: GCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCT 300 ***********************************************************. FliC - a 301: AACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTG 360 FliC - b 301: AACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTG 360 FliC - c 301: AACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGTCTG 360 FliC - d 301: AATGGTACTAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTG 360 FliC - i 301: AACAGCACCAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTG 360 ** *.**.***********************************************.*** 28 TCNCYH phô b¶n 32 (6) - 2004 FliC - a 361: AACGAAATCGACCGTGTATCCGGTCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAG 420 FliC - b 361: AACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAG 420 FliC - c 361: AACGAAATCGACCGTGTATCCGGTCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAG 420 FliC - d 361: AACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAG 420 FliC - i 361: AACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAG 420 ***********************.************************************ FliC - a 421: GACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGTGCCAACGACGGTGAAACCATTGATATCGATCTG 480 FliC - b 421: GACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGCGCGAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTG 480 FliC - c 421: GACAACACTCTGACCATCCAGGTTGGTGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTG 480 FliC - d 421: GACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGTGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATTGATTTA 480 FliC - i 421: GACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGTGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATCGATCTG 480 ********.*****************.**.**************.**.*****.***.*. FliC - a 481: AAACAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGATACGCTGAATGTGCAGAAAAAATATGAT 540 FliC - b 481: AAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGATACTTTAAGTGTACAGGATGCCTATACG 540 FliC - c 481: AAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGCCTAGATACGCTGAATGTGCAGAAAAAATATGAT 540 FliC - d 481: AAAGAAATCAGCTCTAAAACACTGGGACTTGATAAGCTTAATGTCCAAGATGCCTACACC 540 FliC - i 481: AAGCAGATCAACTCTCAGACCCTGGGTCTGGATACGCTGAATGTGCAACAAAAATATAAG 540 ** *.****.****.*.**.*****.**.**** *.*.***.**. * ** FliC - a 541: GTGAAGAGCGAAGCGGTCACGCCTTC - GGCTA - - CATTAAGCACTACTGCACTTGATGGT 597 FliC - b 541: CCAAAAGGTACCGCTGTTACCAGAGA - TGTTA - - CCACCTATAAAAATGGTGGTACTACT 597 FliC - c 541: GTGAGCGATACTGCTGTAGCTGCTTC - - - CTATTCCGACTCGAAACAGAATATTGCTGTT 597 FliC - d 541: CCGAAAGAAACTGCTGTAACCGTTGA - TAAAA - - CTACCTATAAAAATGGTACAGATCCT 597 FliC - i 541: GTCAGCGATACGGCTGCAACTGTTACAGGATATGCCGATACTACGATTGCTTTAGACAAT 600 * **.* * * * * * FliC - a 598: GCTGGCCTCAAAACCGGAACCGGTTCTACAACTGATACTGGTTCAATTAAGGATGGTAAG 657 FliC - b 598: CTTACAGCACCTAACGCAGCAGCAATTGATACCGCTTTAGGTACGACTGGTGCGGCGGGT 657 FliC - c 598: CCTGA - - - TAAAACAGCTATTACTGCAAAAATTGGTGCAGCAACCAGTGGTGGTGCTGGT 654 FliC - d 598: ATTACAGCCCAGAGCAATACTGATATCCAAACTGCAATTGGCGGTGGTGCAACGGGGGTT 657 FliC - i 601: AGTACTTTTAAAGCCTCGGCTACTGGTCTTGGTGGTACTGACCAGAAAATTGATGGCGAT 660 * * * * FliC - a 658: GTTTACTATAACAGCACCTCTAAA - - - - - - AATTATTATGTTGAAGTAGAATTTACCGAT 711 FliC - b 658: ACTGCGGCTG - - - TGAAATTTAAAGACGGTAACTACTTCGTTGAGGTGACCGGTACAACT 714 FliC - c 655: ATAAAAGCAGATATTAGCTTTAAAGATGGCAAGTATTACGCGACTGTCAGTGGATACGAT 714 FliC - d 658: ACTGGGGCTGATATCAAATTTAAAGATGGTCAATACTATTTAGATGTTAAAGGCGGTGCT 717 FliC - i 661: TTAAAATTTGATGATACGACTGGA - - - - - - AAATATTACGCCAAAGTTACCGTTACGGGG 714 * * * * **.* ** 29 TCNCYH phô b¶n 32 (6) - 2004 FliC - a 712: GCGACCGATC - - - AAACCAACGAAGGCGGATTCTATAAAGTTAATGTTGCTGATGATGGT 768 FliC - b 715: AAAGATGGTCTGTATGAAGCGACAGTTGATGCAGCTG - - - - GCGCGGTGACAATGA - - CC 768 FliC - c 715: GATGCCGCAG - - - ATACAGATAAAAATGGAACCTATGAAGTCACTGTTGCCGCAGA - - - T 768 FliC - d 718: TCTGCTGGTGTTTATAAAGCCACTTATGATGAAACTACAAAGAAAGTTAATATTGATACG 777 FliC - i 715: GGAACTGGTA - - - AAGATGGCTATTATGAAGTTTCCGTTGATAAGACGAACGGTGA - GGT 770 * * * ** . FliC - a 769: GCAGTCACAATGAC - - T - GCGGCTACCAC - CAAAGAGGCT - ACAAC - TCCTACAGGTATT 822 FliC - b 769: GCAAATAAAGCAACAGT - - - AACTGGGGCTAGT - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ACAGTT 804 FliC - c 769: ACAGGAGCAGTTACTTTTGCGACTACACC - AACAGTGGTTGACTTA - - CCAACTGATGCA 825 FliC - d 778: ACTGATAAAACTCCGTTGGCAACTGCGGAAGCTACAGCTATTCGGGGAACGGCCACTATA 837 FliC - i 771: G - ACTCTTGCTGGCGGT - GCGACTTCCCCGCTTACAGGTGGACTACCTGCGACAGCAACT 828 * * ** FliC - a 823: ACTGAAGTTACTCAAGTCCAAA - - - AACCTGTGGCTGCTC - - - CAGCTGCTAT - - - - CCA 872 FliC - b 805: ACTGAAAACCAAATTGTAGACGCTGTTACACCGACGCCAGTTGATACAGTCGCAGCAGCT 864 FliC - c 826: AAAGCAGTTTCAAAAGTTCAAC - - - AGAATGATACTGAAATAGCAGCAACAAATGCGAAA 882 FliC - d 838: ACCCACAACCAAATTGCTGAAG - - - TAACAAAAGAGGGTGTTGATACGACCACAGTTGCG 894 FliC - i 829: GAGGATGTGAAAAATGTACAAG - - - TTGCAAATGCTGATTTGACAGAGGCTAA - - - - - - A 879 * * FliC - a 873: GGCTCAGTTGACTGCTGCCCATGTGACCGGCGCTGATACTG - - - - - - CTGAAATGGTTAA 926 FliC - b 865: ACTGCA - TTGACCAATGCAGGTGTGACAGGTGC - GACAGGTA - - ATACCAGCTTGGTTAA 920 FliC - c 883: GCTGCA - TTAAAAGCTGCAGGAGTTGCAGATGCAGAAGCTGATACAGCTACTTTAGTGAA 941 FliC - d 895: GCTCAA - CTTGCTGCAGCAGGGGTTACTGGCGCCGATAAGGACAATACTAGCCTTGTAAA 953 FliC - i 880: GCCGCA - TTGACAGCAGCAGGTGTTACCGGCACAGCATCTG - - - - - - TTG - - - - - - TTAA 926 *.* ** ** * * * * *.** FliC - a 927: GATGTCTTATACGGATAAAAACGGTAAGACTATTGATGGCGGTTTCGGTGTTAAAGTTGG 986 FliC - b 921: AATGTCATTTGAAGATAAAAATGGCAAAGTTACTGATGCGGGTTACGCGCTTAAAGTTGG 980 FliC - c 942: AATGTCTTATACAGATAATAATGGCAAAGTTATTGATGGTGGGTTCGCATTTAAGACCTC 1001 FliC - d 954: ACTATCGTTTGAGGATAAAAACGGTAAGGTTATTGATGGTGGCTATGCAGTGAAAATGGG 1013 FliC - i 927: GATGTCTTATACTGATAATAACGGTAAAACTATTGATGGTGGTTTAGCAGTTAAGGTAGG 986 *.**.*.* *****.**.**.** **.***** **.* * *.** FliC - a 987: GGCTGATATTTATGCTGCAACAAAAAAT - - - AAAGATGGATCGTTCAGCATTAACACCAC 1043 FliC - b 981: AAATGATTATTATGCCGCTGATTACGATGAAAAAACTGGTGAGATAAAAGCTAAAACTGT 1040 FliC - c 1002: CGGTGGTTATTATGCAGCATCTGTTGAT - - - AAATCTGGCGCAGCTAGCTTGAAAGTTAC 1058 FliC - d 1014: CGACGATTTCTATGCCGCTACATATGATGAGAAAACAGGTGCAATTACTGCTAAAACCAC 1073 FliC - i 987: CGATGATTACTATTCTGCAACTCAAAAT - - - AAAGATGGTTCCATAAGTATTAATACTAC 1043 *.* ***.* ** ** *** ** * ** 30 TCNCYH phô b¶n 32 (6) - 2004 FliC - a 1044: TGAATATACCGATA - - AAGAC - GGCAACACTAAAACTGCACTAAACCAACTGGGTGGCGC 1100 FliC - b 1041: AAATTATACTGACG - - - CTACTGGTGCGACAAAAACCGGTGCTGTGAAATTTGGCGGTGC 1097 FliC - c 1059: TAGCTACGTTGACGCTACCACTGGTACCGAAAAAACTGCTGCGAATAAATTAGGTGGCGC 1118 FliC - d 1074: TACTTATACAGATG - - - GTACTGGCGTTGCTCAAACTGGAGCTGTGAAATTTGGTGGCGC 1130 FliC - i 1044: GAAATACACTGCAG - - ATGAC - GGTACATCCAAAACTGCACTAAACAAACTGGGTGGCGC 1100 ** * **.** ****.* **.* **.**.** FliC - a 1101: AGACGGTAAAACTGAAGTTGTTTCTA - - - TCGACGGTAAAACCTACAATGCCAGCAAAGC 1157 FliC - b 1098: GAATGGTAAAACTGAAGTTGTGACCACCGTTGATGGTAATACTTATCAGGCTAGTGATGT 1157 FliC - c 1119: AGACGGTAAAACCGAAGTTGTTACTA - - - TCGACGGTAAAACCTACAATGCCAGCAAAGC 1175 FliC - d 1131: AAATGGTAAATCTGAAGTTGTTACTGCTACCGATGGTAAGACTTACTTAGCAAGCGACCT 1190 FliC - i 1101: AGACGGCAAAACCGAAGTTGTTTCTA - - - TTGGTGGTAAAACTTACGCTGCAAGTAAAGC 1157 *.**.***.*.******** * * *****.**.** ** ** * FliC - a 1158: CGCTGGTCACAACTTTAAAGCACAGCCAGAGCTGGCTGAAGCGGCTGCTGCAACCACCGA 1217 FliC - b 1158: AAAAGGGCATAATTTCCAGAGTGGTGGCGCTTTAAGCGAGGCTGTAACCACTAAAACTGA 1217 FliC - c 1176: CGCTGGGCACAACTTCAAAGCACAGCCAGAGCTGGCGGAAGCGGCTGCTACAACCACTGA 1235 FliC - d 1191: TGACAAACATAACTTCAGAACAGGCGGTGAGCTTAAAGAGGTTAATACAGATAAGACTGA 1250 FliC - i 1158: CGAAGGTCACAACTTTAAAGCACAGCCTGATCTGGCGGAAGCGGCTGCTACAACCACCGA 1217 **.**.** * * **.* * * **.** FliC - a 1218: AAACCCGCTGGCTAAAATTGATGCCGCGCTGGCGCAGGTTGATGCGCTGCGTTCTGACTT 1277 FliC - b 1218: AAACCCGCTGGCTAAAATTGATGCCGCGCTGGCGCAAGTTGATGCGCTGCGTTCTGACTT 1277 FliC - c 1236: AAACCCGCTGCAGAAAATTGATGCTGCTTTGGCGCAGGTGGATGCGCTGCGTTCTGACCT 1295 FliC - d 1251: AAACCCACTGCAGAAAATTGATGCTGCCTTGGCACAGGTTGATACACTTCGTTCTGACCT 1310 FliC - i 1218: AAACCCGCTGCAGAAAATTGATGCTGCTTTGGCACAGGTTGACACGTTACGTTCTGACCT 1277 ******.*** ***********.**.****.**.**.** * *.*********.* FliC - a 1278: GGGTGCGGTTCAGAACCGTTTCAACTCCGCTATCACCAACCTGGGCAATACCGTAAATAA 1337 FliC - b 1278: GGGTGCGGTTCAGAACCGTTTCAACTCCGCTATCACCAACCTGGGCAATACCGTAAACAA 1337 FliC - c 1296: GGGTGCGGTTCAGAACCGTTTCAACTCCGCTATCACCAACCTGGGCAATACCGTAAATAA 1355 FliC - d 1311: GGGTGCGGTTCAGAACCGTTTCAACTCCGCTATCACCAACCTGGGCAATACCGTAAATAA 1370 FliC - i 1278: GGGTGCGGTACAGAACCGTTTCAACTCCGCTATTACCAACCTGGGCAACACCGTAAACAA 1337 *********.***********************.**************.********.** FliC - a 1338: CCTGTCTTCTGCCCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCGACCGAAGTTTCCAACAT 1397 FliC - b 1338: CCTGTCTGAAGCCCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCGACCGAAGTCTCCAACAT 1397 FliC - c 1356: CCTGTCTTCTGCCCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCGACCGAAGTTTCCAACAT 1415 FliC - d 1371: CCTGTCTTCTGCCCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCAACCGAAGTCTCCAACAT 1430 FliC - i 1338: CCTGACTTCTGCCCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCGACCGAAGTTTCCAACAT 1397 ****.** ********************************.********.******** 31 TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004 FliC - a 1398: GTCTCGCGCGCAGATCCTGCAGCAGGCCGGTACCTCCGTTCTGGCGCAGGCGAACCAGGT 1457 FliC - b 1398: GTCCCGCGCGCAGATTCTGCAGCAGGCCGGTACCTCCGTTCTGGCGCAGGCGAACCAGGT 1457 FliC - c 1416: GTCTCGCGCGCAGATTCTGCAGCAGGCCGGTACCTCCGTTCTGGCGCAGGCGAACCAGG - 1474 FliC - d 1431: GTCTCGCGCGCAGATTCTGCAGCAGGCCGGTACCTCCGTTCTGGCGCAGGCGAACCAGGT 1490 FliC - i 1398: GTCTCGCGCGCAGATTCTGCAGCAGGCCGGTACCTCCGTTCTGGCGCAGGCGAACCAGGT 1457 ***.***********.*******************************************. FliC - a 1458: TCCGCAAAACGTCCTCTCTTTACTGCGTTAA 1488 FliC - b 1458: TCCGCAAAACGTCCTCTCTTTACTGCGTTAA 1488 FliC - c 1474: - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1474 FliC - d 1491: TCCGCAAAACGTCCTCTCTTTACTGCGTTAA 1521 FliC - i 1458: TCCGCAAAACGTCCTCTCTTTACTGCGTTAA 1488 2. Kỹ thuật Real - Time PCR Trong nhiều trờng hợp, ngời ta cần biết số lợng acid nucleic trong mẫu nghiên cứu để phục vụ cho điều trị hoặc tìm hiểu cơ chế của một quá trình nào đó. Ví dụ nh, để áp dụng phơng pháp điều trị viêm gan B thích hợp, ngời ta cần biết số lợng các hạt virus (copy numbers) trong 1 ml máu bệnh nhân. Các nhu cầu loại này đợc giải quyết nhờ kỹ thuật Real - Time PCR hay còn gọi là là kỹ thuật PCR định lợng. Real - Time PCR đợc thực hiện dựa trên khái niệm giá trị C t (C t value). Ct là số chu kỳ nhỏ nhất trong phản ứng PCR mà ở đó có sự nhân lên của ADN khuôn (Hình 2). Hình 2: Sơ đồ biểu diễn giá trị Ct (ở đây, Ct = 17,5) 32 TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004 Để có thể định lợng đợc, phải lập đờng chuẩn với các giá trị đã biết của các nồng độ ADN khác nhau (Hình 3): 5 4 2 3 1 Hình 3. Đờng chuẩn với 5 nồng độ ADN khác nhau Căn cứ vào giá trị Ct, ngời ta sẽ tính đợc số lợng ADN mẫu (copy numbers) đã đa vào phản ứng. Bảng 1 là một ví dụ kết quả Real - Time PCR của một số mẫu trong số 110 mẫu huyết thanh bệnh nhân đã đợc xét nghiệm chẩn đoán HBV, trong đó 75% số mẫu dơng tính với số lợng copies virus HBV khác nhau. Giá trị Ct càng bé thì số copies number càng lớn và ngợc lại: Bảng 1: Kết quả xét nghiệm HBV (*, E = exponent value; ví dụ E+11 = 10 11 ) Ký hiệu mẫu Giá trị Ct Copies/ml 83 2,0 7,8E+11* 35 8,2 3,7E+11 13 16,1 7,5E+09 10 17,9 2,8E+09 14 17,4 2,4E+09 6 18,4 7,6E+08 41 20,4 2,7E+08 66 Không xác định 0 68 Không xác định 0 110 Không xác định 0 33 TCNCYH phô b¶n 32 (6) - 2004 Summary Introduction of sequencing and Real - Time PCR techniques DNA sequencing was first introduced in 1975 by Sanger. The sequencing technique was started with the related information on the interested gene in internet. The following steps consisted of: - Design specific primers - Extract and purify DNA templates - Conduct first PCR (PCR - 1) with the specific primers and template - Purify the DNA product from PCR - 1 - Conduct second PCR (PCR - 2) with the addition of dideoxynucleosides triphosphate and only one primer (not pair of the primers) - Purify the PCR - 2 product and denature the DNA to get single - stranded DNA - Read sequences with ABI 3100 avant sequencer - Processing the collected data and publish Real - Time PCR was a quantitative PCR. The principle of the PCR was based on the threshold value (Ct). The Ct value was minimum number of the cycles of a PCR at which the double - stranded DNA was first synthetized. Thus, the smaller Ct value we got, the greater DNA template present at the beginning of the reaction and vise versa. The basic differentiation in Real - Time PCR compared to the normal one was known standards (the DNA template with the defined concentration). The standards were run paralell with the samples. The results of Real - Time PCR will then show exactly the copy numbers of templates in the original samples. 34 . 1488 FliC - b 1458: TCCGCAAAACGTCCTCTCTTTACTGCGTTAA 1488 FliC - c 1474: - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1474 FliC - d 1491:. CAAAGAGGCT - ACAAC - TCCTACAGGTATT 822 FliC - b 769: GCAAATAAAGCAACAGT - - - AACTGGGGCTAGT - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ACAGTT 804 FliC - c 769: