Phương pháp giải trình tự gen doc

BỘ CÔNG THƯƠNG BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HCM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & THỰC PHẨM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & THỰC PHẨM  ĐỀ TÀI BÁO CÁO ĐỀ TÀI BÁO CÁO : : LỚP: DHSH07LT SVTH: Nhóm 15 GVHD: Th.s Trần Hồng Bảo Quyên 1.Nguyễn Thanh Diệu 2.Trần Thị Tha La 3.Nguyễn Thị Cẩm Nương 4.Nguyễn Thị Phương 5.Dương Chí Sơn 6.Đinh Thị Yến Thi 7.Trần Văn Thiết 8.Trần Trung Thịnh NỘI DUNG 1. Khái niệm giải trình tự gen và ý nghĩa của GTTG 2. Phương pháp giải trình tự gen: 2.1 Phương pháp Maxam – Gilbert 2.2 Phương pháp Sanger 2.3 Phương pháp giải trình tự gen tự động 3. So sánh phương pháp Maxam–Gilbert và Sanger 4. Ứng dụng Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắp xếp các nucleotid trong phân tử DNA. 1.1.Khái Niệm: 1.2 Ý nghĩa Giúp xác định vị trí của gen trên NST, cho phép kết luận về bản chất của gen. Có ý nghĩa trong việc tìm hiểu những chức năng cấu trúc của gen cũng như các dòng gen. 5’OH 5’OH P 32 , ATP, enzyme 3’ 3’ 90 o C DNA đánh dấu P 32 P 32 P32 Tách lấy mạch đơn Điện di phân tách các mạch đơn Nguyên lý: Thủy giải đặc trưng phân tử DNA cần xác định trình tự bằng phương pháp hóa học. Bước 1: - Đánh dấu phóng xạ P32 ở đầu 5’ của mạch khuôn. - Biến tính bằng nhiệt độ. - Điện di tách lấy một mạch DNA làm mạch khuôn, dùng mạch khuôn này cho các xử lý tiếp theo. Các bước thực hiện 2.1 Phương pháp Maxam - Gibert 2.1 Phương pháp Maxam - Gibert Bước 2: Thực hiện các phản ứng hóa học đặc hiệu Có thể sử dụng 4 ống nghiệm để thực hiện các phản ứng hóa học đặc hiệu khác nhau, tạo các đoạn DNA cắt dài ngắn khác nhau. Ống 1 Hóa chất xử lý Vị trí cắt 1 Dimethyl sunrfat pH 8 G 2 Piperidine formate pH2 A và G 3 Hydrazine C và T 4 Hydrazine + Nacl 1,5M C 2.1 Phương pháp Maxam - Gibert 2.1 Phương pháp Maxam - Gibert 2.1 Phương pháp Maxam - Gibert 2.1 Phương pháp Maxam - Gibert Bước 3: Lấy sản phẩm xử lý trong mỗi ống nghiệm đem chạy điện di, hiện hình phóng xạ và xác định kết quả. Ví dụ: Xử lý Dimethylsunfat ở ống phản ứng 1, phản ứng cắt tại G. 2.1 Phương pháp Maxam - Gibert 2.1 Phương pháp Maxam - Gibert 32 P ATCG 32 P ATCGCCAG 32 P ATCGCCAGTTG 32 P ATCGCCAGTTGTACCAG 32 P ATC 32 P ATCGCCA 32 P ATCGCCAGTT 32 P ATCGCCAGTTGTACCA Trình tự gen ban đầu Sau khi xử lý bằng DMSO 4 2.1 Phương pháp Maxam - Gibert 2.1 Phương pháp Maxam - Gibert [...]... mềm trên máy tính để xử lý kết quả 2.3 Phương pháp giải trình tự gen tự động Bước 1: Chuẩn bị (DNA khuôn, các dNTP và ddNTP có gắn màu quỳnh quang, enzyme, mồi…) Bước 2: Nhân DNA bằng PCR Bước 3: Nạp sản phẩm PCR vào máy giải trình tự gen và chạy máy giải trình tự gen Bước 4: Phân tích kết quả từ các dữ liệu do máy tính cung cấp 2.3 Phương pháp giải trình tự gen tự động Đầu đọc laser trong máy kích hoạt... một đỉnh 2.3 Phương pháp giải trình tự gen tự động Đọc kết quả 2.3 Phương pháp giải trình tự gen tự động ABI Automated Sequencers (contd.) ABI 310 Capillary ABI 3700 Máy sắc ký khối phổ 3 So sánh phương pháp Maxam – Gibert và Sanger Đặc điểm Maxam – Gibert Sanger Giống nhau + Hình thành một tập hợp nhiều oligonucleotide có chiều dài khác nhau + Các trình tự này được phân tách bằng phương pháp điện di... 2.2 Phương pháp Sanger Bước 3 : Thực hiện các phản ứng tổng hợp DNA Bước 4: Điện di kết quả, so sánh kết quả các chuỗi mạch đơn DNA được tổng hợp để xác định trình tự của mạch khuôn 2.2 Phương pháp Sanger ddTTP 2.3 Phương pháp giải trình tự gen tự động Nguyên lý: Hoàn toàn được thiết kế trên nguyên tắc sử dụng ddNTP do Sanger và cộng sự phát minh Mồi và dNTP được đánh dấu huỳnh quang Mỗi loại dNTP được... quả được đọc trên bản phóng xạ tự ghi Khác nhau + Dùng các chất hóa + Dùng enzyme và học để làm cắt các các ddNTP để làm base dừng quá trình tổng hợp ADN 3 So sánh phương pháp Maxam – Gibert và Sanger Maxam – Gibert Sanger Ưu điểm: + Phương pháp dễ tiến hành + Chi phí thấp Ưu điểm: + Các bước tiến hành đơn giản + Có độ chính xác cao + Là cơ sở của các máy giải trình tự gen tự động Nhược điểm: Nhược điểm:...2.1 Phương pháp Maxam - Gibert Bước 4: Tập hợp kết quả thu được ở tất cả các ống nghiệm, thu được các đoạn polynucleotid dài ngắn hơn kém nhau 1 nucleotid, từ đó xác định được trình tự của DNA mạch khuôn 2.2 Phương pháp Sanger Nguyên lý: Dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ hoạt động của enzyme DNA Polymerase Với việc... Độ chuẩn xác không cao + Chỉ đọc được một đoạn trình + Phải thực hiện nhiều lần và tự ngắn loại bỏ các sai sót để chọn các kết quả gần đúng nhất 4 Ứng dụng So sánh một đoạn ADN bất kỳ với các dữ liệu trong ngân hàng gen có thể chúng ta xác định được đoạn ADN đó của sinh vật nào Biết được trình tự sắp xếp các nucleotit của một đoạn ADN có thể suy ra trình tự các axit amin tương ứng trên mạch polypeptide... này để tiến hành các bước xử lý tiếp theo 2.1 Phương pháp Sanger Bước 2: Chuẩn bị cho phản ứng tổng hợp DNA Lấy 4 ống Eppendorf, cho các thành phần cần thiết vào mỗi ống : mạch khuôn, mồi có đánh dấu phóng xạ P32, enzyme DNA polymerase, dNTP, dung dịch đệm thích hợp và thêm vào mỗi ống tương ứng một loại ddNTP nhất định 2.2 Phương pháp Sanger 2.2 Phương pháp Sanger Bước 3 : Thực hiện các phản ứng tổng... mạch polypeptide nếu đoạn ADN đó mã hóa 4 Ứng dụng Xác định đột biến, sự sai khác về trình tự nucleotit trong cùng một sản phẩm gen, có ý nghĩa trong nghiên cứu tiến hóa và ứng dụng thực tiễn Tạo ra các sinh vật mới mang những đặc tính mong muốn hoặc có thể chuyển gen vào các tế bào vi khuẩn, nấm men… để sản xuất sản phẩm gen theo con đường tái tổ hợp (protein, enzym, vaccine và các hợp chất có hoạt tính... định nhờ hoạt động của enzyme DNA Polymerase Với việc sử dụng thêm các dideoxynucleotid (ddNTP) và các deoxynucleotid thông thường 2.2 Phương pháp Sanger Việc tổng hợp mạch bổ sung sẽ bị dừng lại do ddNTP không có khả năng hình thành liên kết phosphodieste 2.2 Phương pháp Sanger Vật liệu: - Primer( 20 nucleotides) - DNA polymerase - DNA template - dNTP và ddNTP - Vật liệu đánh dấu - Hệ thống điện di . Phương pháp giải trình tự gen: 2.1 Phương pháp Maxam – Gilbert 2.2 Phương pháp Sanger 2.3 Phương pháp giải trình tự gen tự động 3. So sánh phương pháp Maxam–Gilbert. máy giải trình tự gen và chạy máy giải trình tự gen. Bước 4: Phân tích kết quả từ các dữ liệu do máy tính cung cấp 2.3 Phương pháp giải trình tự gen tự