Phức hợp kháng nguyên bạch cầu người (HLA: human leukocyte antigen) là phức hợp các protein màng tế bào đóng vai trò quan trọng trong điều hòa miễn dịch. Định típ HLA rất cần thiết cho việc ghép tạng cũng như ghép tế bào gốc. Giải trình tự Sanger là một công cụ giúp định típ HLA chính xác, độ phân giải cao và đang được thực hiện trên toàn thế giới.
Trang 1ĐỊNH TÍP PHỨC HỢP KHÁNG NGUYÊN BẠCH CẦU NGƯỜI (HLA:
HUMAN LEUKOCYTE ANTIGEN) LOCUS B BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN KẾT HỢP VỚI TẠO DÒNG
Mai Phương Thảo * , Lê Gia Hoàng Linh ** , Nguyễn Thế Vinh ** , Hoàng Anh Vũ ** , Đỗ Đức Minh **
TÓM TẮT
Mục tiêu: Phức hợp kháng nguyên bạch cầu người (HLA: human leukocyte antigen) là phức hợp các
protein màng tế bào đóng vai trò quan trọng trong điều hòa miễn dịch Định típ HLA rất cần thiết cho việc ghép tạng cũng như ghép tế bào gốc Giải trình tự Sanger là một công cụ giúp định típ HLA chính xác, độ phân giải cao và đang được thực hiện trên toàn thế giới
Đối tượng và phương pháp: Có 20 đối tượng tình nguyện tham gia nghiên cứu được định típ HLA locus
B bằng phương pháp giải trình tự Sanger kết hợp với tạo dòng
Kết quả: Chúng tôi phát hiện 3 trường hợp mang alen HLA-B đồng hợp tử và 17 trường hợp dị hợp tử Các
alen HLA-B được xác định bao gồm 07:02, 07:05, 13:01, 15:01, 15:02, 15:12, 15:25, 15:27, 15:35, 18:02, 27:06, 35:05, 38:02, 40:01, 44:03, 46:01, 55:02, 56:01, 57:01, 58:01
Kết luận: Kỹ thuật giải trình tự Sanger là một kỹ thuật định típ HLA chính xác và tiết kiệm chi phí
Từ khóa: phức hợp kháng nguyên bạch cầu người (HLA), giải trình tự thế hệ mới, phản ứng PCR, giải
trình tự Sanger, tạo dòng
ABSTRACT
HUMAN LEUKOCYTE ANTIGEN LOCUS B (HLA-B) TYPING
BY SANGER SEQUENCING AND CLONING
Mai Phuong Thao, Le Gia Hoang Linh, Nguyen The Vinh, Hoang Anh Vu, Do Duc Minh
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 – No 4 - 2019: 219 – 225
Objectives: Human leukocyte antigen, a cell-surface protein complex, is responsible for the regulation of the
immune system HLA typing is neccesary step in stem cell and organ transplantation Sanger sequencing is an accurate tool that can provide high resolution typing and has been applied worldwide
Methods: HLA-B 20 objects participated in the study were sequenced and cloned if nessesary
Results: HLA-B was found homozygous in 3 cases and heterozygous in 17 cases Identified alleles were
07:02, 07:05, 13:01, 15:01, 15:02, 15:12, 15:25, 15:27, 15:35, 18:02, 27:06, 35:05, 38:02, 40:01, 44:03, 46:01, 55:02, 56:01, 57:01, 58:01
Conclusion: HLA typing by Sanger sequencing and cloning is accurate and cost-saving
Keywords: human leukocyte antigen (HLA), next generation sequencing (NGS), polymerase chain reaction
(PCR), sanger sequencing, cloning
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hệ thống phức hợp kháng nguyên bạch
cầu người (HLA: Human leukocyte antigen) là
hệ thống các protein trên bề mặt hầu hết các tế bào trong cơ thể, được mã hóa từ locus các gen nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể số 6, chúng đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng
*Bộ môn Sinh lý-Sinh lý bệnh-Miễn dịch – Khoa Y – ĐH Y Dược TP Hồ Chí Minh
**Trung tâm Y sinh học phân tử - ĐH Y Dược TP Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: TS.BS Đỗ Đức Minh ĐT: 0932999989 Email: ducminh@ump.edu.vn
Trang 2miễn dịch, giúp hệ thống miễn dịch trong cơ
thể phân biệt được các tế bào trong cơ thể và
các tế bào ngoại lai để từ đó có thể tấn công các
tế bào lạ xâm nhập(4)
Các gen mã hóa cho hệ thống HLA được
chia thành 3 lớp chính, trong đó chủ yếu là lớp I
A, HLA-B và HLA-C) và lớp II
(HLA-DRB1 và HLA-DQB1) tham gia vào quá trình
tương tác giữa mảnh ghép và kí chủ Trên mỗi
phân tử HLA đều có vùng nhận diện, cấu trúc
protein của vùng nhận diện này thường khác
biệt giữa các cá thể và đây là cơ sở để định típ
HLA Vùng nhận diện này được mã hóa từ exon
2, 3 của các gen HLA lớp I và exon 2 của gen
HLA lớp 2
Kỹ thuật định típ HLA hiện tại ở Việt Nam
vẫn dùng hai phương pháp khuếch đại DNA
bằng chuỗi mồi đặc hiệu (SSP-PCR:
sequence-specific primer polymerase chain reaction và
SSO-PCR: sequence-specific oligonucleotide
polymerase chain reaction) Hai kỹ thuật này có
nguyên lý tương tự nhau và đã được phát minh
vào khoảng 20 năm trước Trong phản ứng
SSP-PCR, các bộ mồi (primer) được thiết kế sẵn để
nhận diện các vùng đa hình ở các locus HLA, các
típ HLA sau đó sẽ được xác định bằng cách điện
di sản phẩm PCR trên thạch agarose, phương
pháp này chỉ cho độ phân giải của HLA ở mức 2
chữ số Phương pháp SSO-PCR hiện đại hơn, có
độ phân giải cao hơn đạt mức 4 chữ số, cũng
dựa trên nền tảng thực hiện phản ứng PCR bằng
bộ mồi được thiết kế sẵn, nhưng sau đó sản
phẩm PCR sẽ không được phân tích trên thạch
agarose mà sẽ được chuyển lên một màng lai, tại
đó một bộ các phân tử đầu dò oligonucleotide có
gắn chất chỉ thị sẽ được lai với sản phẩm PCR và
sau đó típ HLA sẽ được xác định dựa vào các
chất chỉ thị gắn trên các đầu dò Các kỹ thuật
định típ HLA này còn nhiều nhược điểm:
Độ phân giải thấp (2-4 chữ số)
Tốn thời gian (một lần phản ứng SSO-PCR
chỉ xác định được 1 locus HLA)
Không phát hiện hoặc dễ nhầm lẫn trong các
trường hợp bệnh nhân mang các alen HLA
hiếm, mới
Ngày càng có nhiều các alen HLA mới được phát hiện, do đó các bộ kit này cần được cập nhật liên tục
Trong khi đó, trên thế giới, việc định típ HLA dựa chủ yếu vào phương pháp xác định trình tự nucleotid bằng phương pháp Sanger hoặc giải trình tự thế hệ mới (SBT: sequence-based typing) với độ phân giải có thể chấp nhận trên lâm sàng là 4 chữ số, đây được xem là phương pháp chính xác và đáng tin cậy nhất hiện nay và là tiêu chuẩn vàng trong việc xác định HLA ở các trung tâm cấy ghép lớn(6)
Do đó, thông qua nghiên cứu này, chúng tôi muốn tiến hành nghiên cứu áp dụng quy trình xác định phức hợp HLA, mà đầu tiên là locus HLA-B, bằng phương pháp giải trình tự với độ phân giải 4 chữ số nhằm khắc phục các nhược điểm của phương pháp PCR truyền thống
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu
Chúng tôi tiến hành định típ HLA locus B cho 20 người có nguồn gốc Kinh tình nguyện tham gia nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu
Cắt ngang mô tả hàng loạt ca
Tách chiết DNA bộ gene
Tiến hành lấy 2 ml máu tĩnh mạch, cho vào ống chống đông có EDTA, lắc đều nhẹ nhàng Genomic DNA của các tế bào bạch cầu trong máu toàn phần được tách chiết trong vòng 24 giờ bằng bộ kit GeneJetTM whole blood genomic DNA purification (Thermo Scientific, Mỹ) theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất
Phản ứng PCR khuếch đại và giải trình tự gen mục tiêu
Cặp mồi được thiết kế và tổng hợp (IDT,
Mỹ) dựa trên trình tự DNA của gen HLA-B
mang mã số NG_023187 trong kho dữ liệu của NCBI và tham khảo từ tác giả Lazaro(3) (Bảng 1)
Trang 3Bảng 1 Cặp mồi được sử dụng để khuếch đại trình
tự exon 2, 3 và vùng lân cận của gen HLA-B
khuếch đại
Tm ( 0 C)
ACGCCGA
Exon 2, 3 và vùng lân cận (1073 bp)
61,5
Bin3M13-R
GGCCATCCCCGGCGACC
TAT
64,5
Thiết lập điều kiện cho các PCR khuếch đại tương
ứng với bộ mồi
Mỗi tube PCR có thể tích 15µl chứa các
thành phần: 1,5µl PCR buffer 10X; 1,5µl dNTP
2,5mM, 0,75µl cho mỗi mồi xuôi và ngược
(10nM/µl), 0,1µl TaKaRa TaqTM HotStart
Polymerase (Takara, Nhật Bản), 2µl genomic
DNA (20-50ng/µl) và 8,4µl nước cất 2 lần khử
ion Các phản ứng luôn kèm theo một chứng âm
không chứa DNA để kiểm soát ngoại nhiễm
Chu trình luân nhiệt cho PCR được thực hiện
trên máy Mastercycler@Pro S (Eppendorf, Đức)
Chu kỳ nhiệt: khởi đầu tại 980C trong 3 phút,
tiếp theo với 40 chu kỳ lặp lại các bước 980C: 20
giây, 620C: 20 giây, 720C: 1 phút; kế tiếp với bước
720C: 2 phút Trữ sản phẩm PCR tại 40C Kiểm
tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose
2% và nhuộm bằng Diamond™ Nucleic Acid
Dye (Promega-Mỹ)
Kỹ thuật giải trình tự
Bảng 2 Cặp mồi được sử dụng để giải trình tự trình
tự exon 2, 3 và vùng lân cận của gen HLA-B
Chiều ngược, exon 2
exon 3
Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng
Exosap-IT glycerol solution (Affymetrix-Mỹ)
theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất và
được thực hiện phản ứng cycle sequencing với
BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit
(Applied Biosystems, Mỹ) cặp mồi theo Bảng 2
Sản phẩm sau đó được kết tủa bằng ethanol,
hòa tan trong Hi-Di formanide, biến tính ở
95C trước khi làm lạnh đột ngột Trình tự
DNA được đọc bằng máy ABI 3130 Genetic
Analyzer, với POP-7 polymer và capillary 50
cm (Applied Biosystems, Mỹ) Kết quả giải trình tự DNA được phân tích bằng phần mềm CLC Main Workbench
Thực hiện chuyển gen
Các mẫu sau khi giải trình tự được so với trình tự chuẩn từ kho dữ liệu của NCBI Blast server, hla.org và IMGT Blast của EBI để xác định alen HLA-B của các đối tượng tham gia nghiên cứu Với các mẫu có các alen HLA-B dị hợp tử khó xác định, chúng tôi sử dụng phương pháp tạo dòng chuyển một alen vào vector plasmid Sản phẩm PCR được nhân dòng trực tiếp vào vector pGEM-T dạng mạch thẳng có đầu dính T (theo bộ kit pGEM®-T Easy Vector Systems-Promega, Mỹ) Sản phẩm nhân dòng được nhiệt biến nạp vào tế bào khả biến E coli
DH5, plasmid mang gen lacZ giúp chọn lọc
những khuẩn lạc có gen chèn dựa trên sự chọn lọc màu sắc trắng/xanh của khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy chứa X-gal, IPTG và Ampicillin Plasmid tái tổ hợp được tách ra từ các khuẩn lạc trắng bằng kit PureYieldTM Plasmid Miniprep System (Promega, Mỹ) và kiểm tra sự có mặt của
gen HLA-B bằng PCR với các cặp mồi 5UT-F và
Bin3M13-R với cùng thể tích và chu trình luân nhiệt như ở bước đầu tiên Sản phẩm PCR từ plasmid sẽ được giải trình tự cũng bằng cặp mồi
từ Bảng 2 và đọc kết quả bằng phần mềm CLC
Main Workbench Kết quả giải trình tự lần 2 sẽ
có kết quả đồng hợp tử, dựa vào kết quả của 2 lần giải trình tự sẽ giúp xác định 2 alen dị hợp tử trên gen HLA-B
Thực hiện so sánh kết quả sử dụng phần mềm BLAST của EBI
Phần mềm HLA BLAST của EBI là một phần mềm online miễn phí có thể truy cập vào ở địa chỉ https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/blast.html Sau khi truy cập và lựa chọn chế độ so sánh cần thiết, toàn bộ trình tự DNA của exon 2 và 3 của các mẫu sẽ được nhập vào hệ thống Ngưỡng xác định (% identities) và mức độ dương tính (% positive) của mẫu phải đạt 100%
Trang 4mới được chấp nhận và phân típ HLA-B
Nếu vẫn chưa phân định được alen kết quả,
kết quả cuối cùng sẽ được chọn dựa theo các
alen HLA phổ biến và mô tả rõ (CWD: common
and well-documented) của Hiệp hội Phù hợp
mô và Di truyền miễn dịch Hoa Kỳ (ASHI:
American Society for Histocompatibility and
Immunogenetics) phiên bản 2.0.0
KẾT QUẢ
Phản ứng PCR khuếch đại exon 2,3 và vùng lân cận của gen HLA-B cho sản phẩn có hình ảnh kích thước đúng với thiết kế ban đầu khi
điện di trên gel agarose 1% (Hình 1)
Kết quả giải trình tự 20 mẫu cho thấy có 4 mẫu đồng hợp tử sẽ được phân tích tiếp tục trên
hệ thống BLAST của EBI (Hình 2), còn lại 16 mẫu
dị hợp tử sẽ được tiến hành tạo dòng (Hình 3)
Hình 1 Kết quả PCR khuếch đại exon 2,3 và vùng lân cận của gen HLA-B
Hình 2 Kết quả HLA-B đồng hợp tử
Trang 5Hình 3 Kết quả HLA-B dị hợp tử
Sau khi chuyển 1 alen HLA-B vào vector
DNA và tiến hành nhiệt biến nạp vào tế bào khả
biến E coli DH5, các tế bào khả biến sẽ được ủ
nuối cấy trên môi trường thạch LB qua đêm ở
nhiệt độ 370C Các tế bào sẽ tạo khúm trên thạch
LB như trên Hình 4 Chỉ có các khúm tế bào màu
trắng được chọn để tiếp tục tiến hành ly trích
DNA sau đó
Hình 4 Các khúm vi khuẩn xanh và trắng mọc trên
thạch LB
DNA ly trích từ khúm vi khuẩn màu trắng
được dùng làm khuôn để thực hiện phản ứng
PCR lần 2 khuếch đại đoạn gen HLA-B chèn
vào vector plasmid với cặp mồi trong Bảng 1
cho kết quả phù hợp với dự đoán, băng DNA
được khuếch đại có kích thước khoảng 1000bp
(Hình 5)
Hình 5 Sản phẩm PCR lần 2
Kết qủa giải trình tự lần 2 của các mẫu được tạo dòng đều cho sóng đơn dưới dạng đồng hợp
tử (Hình 6)
Phối hợp hai lần giải trình tự sẽ giúp xác định được 2 alen HLA-B di hợp tử Kết quả các alen HLA-B trên 20 mẫu tham gia nghiên cứu
được tóm tắt trong Bảng 3 với 4 mẫu cho kết quả
đồng hợp tử và 16 mẫu cho kết quả dị hợp tử Trong đó, các alen phổ biến nhất là 15:02, 46:01, 38:02 và 40:01 với tần suất lần lượt 20%, 10%, 7,5% và 7,5%
Trang 6Hình 6 Các kết quả trình tự trước và sau khi tạo dòng Bảng 3 Kết quả định típ HLA-B của 20 đối tượng
tham gia nghiên cứu
BÀN LUẬN
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xây
dựng hoàn chỉnh phương pháp định típ HLA-B
bằng phương pháp giải trình tự kết hợp với tạo dòng Các alen HLA-B được xác định trong nghiên cứu này bao gồm 07:02, 07:05, 13:01, 15:01, 15:02, 15:25, 15:27, 18:02, 27:06, 35:05, 38:02, 40:01, 44:03, 46:01, 55:02, 56:01, 57:01, 58:01 đều là các alen đã được báo cáo trong dân số người Kinh Việt Nam trước đây(1) Một số alen lần đầu
mô tả là 15:12 và 15:35 Kết quả nghiên cứu này cũng cho thấy số trường hợp mang alen HLA-B đồng hợp tử khá hiếm phù hợp với tính đa hình rất cao của locus HLA-B trong nhiều chủng tộc như người Kinh Việt Nam, người Hán Trung Quốc, Nhật Bản và Thái Lan(1,2,5,7) với số liệu
được so sánh trong Bảng 4 Các alen phổ biến ở
người Việt Nam cũng thể hiện phần nào trong nghiên cứu này là 15:02, 46:01 và 40:01, điều này góp phần cho thấy tính tương đồng giữa người Kinh Việt Nam, người Hán Trung Quốc và người Thái khi 2 trong 3 alen phổ biến nhất của HLA-B ở cả 3 dân số đều là 46:01 và 40:01(1,5,7) Ngoài ra, nghiên cứu của chúng tôi cũng sử dụng phương pháp giải trình tự Sanger cho kết quả chính xác hơn ở độ phân giải 4 chữ số so với các phương pháp SSO-PCR truyền thống
Bảng 4 So sánh kết quả tần suất lưu hành phổ biến của các alen HLA-B giữa các nghiên cứu
Tô đậm là các alen phổ biến chung trong dân số châu Á
Trang 7Dân số Việt Nam Trung Quốc Thái Lan Nhật Bản
HLA-B (%)
15:02 (20) 46:01 (10) 40:01 (7.5)
15:02 (13.5) 46:01 (11.5) 38:02 (6.5)
46:01 (14.4) 40:01 (11.7) 13:01 (8.4)
46:01 (16.8) 13:01 (9.1) 40:01 (6.9)
51:01 (8.9) 35:01 (8.2) 40:02 (7.9)
KẾT LUẬN
Định típ HLA bằng kỹ thuật giải trình tự
Sanger có ưu điểm là có khả năng xác định các
alen cơ bản, phổ biến, đã được mô tả rõ ở độ
phân giải 4 chữ số, giá thành rẻ Tuy nhiên, nó
vẫn có điểm giới hạn là khó xác định cụ thể típ
HLA độ phân giải cao hơn nếu chỉ dựa vào trình
tự exon 2 và 3 mà còn cần phải có trình tự các
exon và intron còn lại để có thể định típ HLA
chính xác trước xu hướng ngày càng có nhiều
alen mới được mô tả và đưa vào dữ liệu của
IMGT Việc tiếp tục xác định trình tự các exon và
intron còn lại bằng phương pháp giải trình tự
Sanger cần nhiều thời gian và công sức, vì vậy
cần phải có một phương pháp có khả năng giải
trình tự hàng loạt, đồng thời các exon và intron
này và phương pháp giải trình tự thế hệ mới
được xem như là một ứng cử viên phù hợp cho
việc định típ HLA trong tương lai
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Hoa BK, Hang NTL, Kashiwase K, et al (2008) HLAA, B, C,
-DRB1 and -DQB1 alleles and haplotypes in the Kinh population
in Vietnam Tissue Antigens, 71(2):127–134
2 Ikeda N, Kojima H, Nishikawa M, et al (2015) Determination of HLA-A, -C, -B, -DRB1 allele and haplotype frequency in
Japanese population based on family study Tissue Antigens,
85(4):252–259
3 Lazaro A, Tu B, Yang R, Xiao Y, Kariyawasam K, Ng J, Hurley
CK (2013) Human leukocyte antigen (HLA) typing by DNA
sequencing Methods Mol Biol Clifton NJ, 1034:161–195
4 Mosaad YM (2015) Clinical Role of Human Leukocyte Antigen
in Health and Disease Scand J Immunol, 82(4):283–306
5 Nakkam N, Konyoung P, Kanjanawart S, Saksit N, Kongpan T, Khaeso K, Khunarkornsiri U, Dornsena A, Tassaneeyakul W, Tassaneeyakul W (2018) HLA Pharmacogenetic Markers of
Drug Hypersensitivity in a Thai Population Front Genet, doi:
10.3389/fgene.2018.00277
6 Sanchez-Mazas A, Vidan-Jeras B, Nunes JM, et al (2012) Strategies to work with HLA data in human populations for histocompatibility, clinical transplantation, epidemiology and population genetics: HLA-NET methodological
recommendations Int J Immunogenet, 39(6):459–476
7 Shen Y, Cao D, Li Y, et al (2014) Distribution of HLAA, B, and
-C Alleles and HLA/KIR -Combinations in Han Population in
China J Immunol Res, doi: 10.1155/2014/565296
Ngày phản biện nhận xét bài báo: 30/07/2019 Ngày bài báo được đăng: 05/09/2019