Phức hợp kháng nguyên bạch cầu người (HLA: human leukocyte antigen) là phức hợp các protein màng tế bào đóng vai trò quan trọng trong điều hòa miễn dịch. Định típ HLA rất cần thiết cho việc ghép tạng cũng như ghép tế bào gốc. Giải trình tự thế hệ mới là một công cụ hiện đại giúp định típ HLA dễ dàng, nhanh chóng và dần trở thành xu hướng trên toàn thế giới.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học ĐỊNH TÍP PHỨC HỢP KHÁNG NGUYÊN BẠCH CẦU NGƯỜI (HLA: HUMAN LEUKOCYTE ANTIGEN) BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI Mai Phương Thảo*, Lê Gia Hoàng Linh**, Nguyễn Thế Vinh**, Hồng Anh Vũ**, Đỗ Đức Minh** TĨMTẮT Mục tiêu: Phức hợp kháng nguyên bạch cầu người (HLA: human leukocyte antigen) phức hợp protein màng tế bào đóng vai trò quan trọng điều hòa miễn dịch Định típ HLA cần thiết cho việc ghép tạng ghép tế bào gốc Giải trình tự hệ cơng cụ đại giúp định típ HLA dễ dàng, nhanh chóng dần trở thành xu hướng toàn giới Đối tượng phương pháp: 66 đối tượng tình nguyện tham gia nghiên cứu định típ HLA phương pháp giải trình tự hệ kết hợp với phân tích sinh tin học phần mềm Assign Trusight HLA v2,0 Kết quả: Chúng định típ HLA lớp I lớp II 66 đối tương tham gia nghiên cứu phương pháp giải trình tự hệ thu thập phân bố kiều gen HLA phổ biến người Việt Nam Kết luận: Kỹ thuật giải trình tự hệ kỹ thuật định típ HLA xác, nhanh chóng, hiệu tiết kiệm chi phí Từ khóa: phức hợp kháng nguyên bạch cầu người (HLA), giải trình tự hệ mới, phản ứng PCR ABSTRACT HUMAN LEUKOCYTE ANTIGEN (HLA) TYPING BY NEXT GENERATION SEQUENCING Mai Phuong Thao, Le Gia Hoang Linh, Nguyen The Vinh, Hoang Anh Vu, Đo Đuc Minh * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol 23 ‐ No 3‐ 2019: 111‐116 Objectives: Human leukocyte antigen (HLA), a cell-surface protein complex, is responsible for the regulation of the immune system HLA typing is necessary step in stem cell and organ transplantation Next generation sequencing (NGS) is a modern tool that makes HLA typing fast, simple and becoming global trend Material - Methods: HLA complex from 66 objects participated in the study were sequenced by next generation sequencing Data later were analyzed with Assign Trusight HLA v2.0 software Results: HLA class I and II of 66 objects were typed and the distribution of common HLA variants in Kinh Vietnamese people were obtained Conclusion: HLA typing by NGS is accurate, fast and cost-saving Keywords: human leukocyte antigen (HLA), next generation sequencing (NGS), polymerase chain reaction (PCR) diện bề mặt hầu hết tế bào có nhân ĐẶT VẤN ĐỀ thể với mức độ biểu khác có Các gen mã hóa cho hệ thống phức hợp nhiệm vụ trình diện peptide nội bào kháng ngun bạch cầu người (HLA) chia tế bào thể bị nhiễm virus thành lớp chính, chủ yếu lớp I tế bào khiếm khuyết, bất thường cho tế (HLA‐A, HLA‐B HLA‐C) lớp II (HLA‐ bào lympho T CD8 thông qua thụ thể tế bào T DRB1 HLA‐DQB1) tham gia vào trình (TCR: T cell receptor) dẫn đến hiệu cuối tương tác mảnh ghép kí chủ HLA lớp I phá hủy tế bào (thường thông qua chế *Bộ môn Sinh lý học – Khoa Y – Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh **Trung tâm Y sinh học phân tử ‐ Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS.BS Đỗ Đức Minh ĐT: 0932999989 Email: ducminh@ump.edu.vn 111 Nghiên cứu Y học gây độc tế bào) Trong đó, HLA lớp II thường biểu giới hạn tế bào hoạt hóa miễn dịch, bao gồm tế bào B tế bào trình diện kháng nguyên khác (APC: antigen‐ presenting cells) với nhiệm vụ trình diện peptide ngoại lai từ tác nhân gây bệnh cho tế bào lympho T CD4 sau tế bào T hoạt hóa tế bào B sản sinh hàng loạt kháng thể trung hòa tác nhân gây bệnh Đến nay, 12.000 biến thể HLA lớp I 4.000 biến thể HLA lớp II ghi nhận số lượng dự kiến tăng dần tương lai, số này, số gen HLA có hàng trăm alen, chẳng hạn HLA‐B27 Tuy có vai trò quan trọng qúa trình cấy ghép kỹ thuật định típ HLA Việt Nam dùng phương pháp khuếch đại DNA chuỗi mồi đặc hiệu (SSP‐PCR: sequence‐ specific primer polymerase chain reaction SSO‐PCR: sequence‐specific oligonucleotide polymerase chain reaction) Hai kỹ thuật có nguyên lý tương tự phát minh vào khoảng 20 năm trước Trong phản ứng SSP‐ PCR, mồi (primer) thiết kế sẵn để nhận diện vùng đa hình locus HLA, típ HLA sau xác định cách điện di sản phẩm PCR thạch agarose, phương pháp cho độ phân giải HLA mức chữ số Phương pháp SSO‐PCR đại hơn, có độ phân giải cao đạt mức chữ số, dựa tảng thực phản ứng PCR mồi thiết kế sẵn, sau sản phẩm PCR khơng phân tích thạch agarose mà chuyển lên màng lai, phân tử đầu dò oligonucleotide có gắn chất thị lai với sản phẩm PCR sau típ HLA xác định dựa vào chất thị gắn đầu dò Các kỹ thuật định típ HLA nhiều nhược điểm: Độ phân giải thấp (2 ‐ chữ số); Tốn thời gian (một lần phản ứng SSO‐PCR xác định locus HLA); Không phát dễ nhầm lẫn trường hợp bệnh nhân mang alen HLA 112 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 23 * Số * 2019 hiếm, mới; Ngày có nhiều alen HLA phát hiện, kit cần cập nhật liên tục Trong đó, giới, việc định típ HLA dựa chủ yếu vào phương pháp xác định trình tự nucleotid phương pháp Sanger giải trình tự hệ (SBT: sequence based HLA typing) với độ phân giải chấp nhận lâm sàng chữ số, xem phương pháp xác đáng tin cậy tiêu chuẩn vàng việc xác định HLA trung tâm cấy ghép lớn(6) Có phương pháp giải trình tự để định típ HLA giải trình tự Sanger truyền thống giải trình tự hệ Có nhiều kỹ thuật giải trình tự hệ áp dụng để định típ HLA với độ xác sai lệch khác Theo thống kê Hội nghị giới lần thứ 16 HLA vào năm 2013, tảng giải trình tự hệ thống Illumina xem ưu việt việc định típ HLA với tỉ lệ sai sót vào khoảng 0,32%, tốt so sánh với tảng kỹ thuật khác 454 GS (Roche), Ion Torrent PGM Pacific Biosciences có tỉ lệ sai sót 1,2%, 1,71% 14,1%(1); vậy, chúng tơi định chọn tảng kỹ thuật Illumina để thực nghiên cứu Hiện Việt Nam, cơng trình nghiên cứu HLA đại đa số dừng mức độ phân giải thấp sử dụng phương pháp SSO‐PCR(2,8) Do đó, thơng qua nghiên cứu này, muốn tiến hành nghiên cứu áp dụng quy trình xác định phức hợp HLA phương pháp giải trình tự nhằm khắc phục nhược điểm phương pháp PCR truyền thống ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Chúng tơi tiến hành định típ HLA locus A, B, C, DRB1 DQB1 cho 66 đối tượng tình nguyện tham gia nghiên cứu Tất đối tượng tham gia nghiên cứu người Kinh chưa cấy ghép tế bào gốc Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 23 * Số * 2019 tạo máu trước Phương pháp nghiên cứu Tách chiết Genomic DNA Máu toàn phần đối tượng tham gia nghiên cứu thu nhận lưu trữ ống chống đông EDTA DNA từ mẫu máu tách chiết kit QIAamp DNA Kit (Qiagen, Mỹ), theo hướng dẫn sử dụng nhà sản xuất Tạo thư viện cho giải trình tự hệ mới: bước thực kit HLA Trusight (Illumina, Mỹ) theo hướng dẫn nhà sản xuất Tạo amplicon HLA phản ứng long‐ range PCR với mồi theo điều kiện nhà cung cấp Tinh sản phẩm PCR; Đồng amplicon HLA; Phân đoạn sản phẩm PCR thành đoạn DNA có chiều dài từ 300 ‐ 500bp; Hợp mẫu tinh sản phẩm sau phản ứng phân cắt; PCR khuếch đại mẫu gắn adapter vùng nhận diện (index) cho mẫu; Tinh sản phẩm PCR; Hợp thư viện cuối cùng; Kiểm tra lại thư viện đạt chuẩn Qubit pha loãng tới nồng độ phù hợp để chạy máy Phương pháp giải trình tự gen phức hợp HLA máy giải trình tự hệ MiniSeq Nạp mẫu thư viện tiến hành chạy với chip MiniSeq Mid Output Reagent (300‐cycles) (Illumina, Mỹ) theo hướng dẫn nhà sản xuất Khai báo thơng số cần thiết để máy nhận diện mẫu giải trình tự Tiến hành chạy máy 20 ‐ 24 Phương pháp phân tích kết giải trình tự gen phức hợp HLA máy giải trình tự hệ MiniSeq Nhập file kết từ máy giải trình tự MiniSeq Nghiên cứu Y học Phần mềm HLA Trusight (Illumina, Mỹ) tự động so sánh kết giải trình tự thu với trình tự chuẩn từ ngân hàng liệu IMGT/HLA phiên 3.23.0.1 cập nhật ngày 19.01.2016 Phần mềm xuất kết định típ HLA cho mẫu tương ứng Phương pháp so sánh, thống kê, xử lý số liệu Số liệu sau thu nhận phân tích, đánh giá phần mềm Excel 2010 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Tạo thư viện cho giải trình tự hệ Phản ứng long range PCR Phản ứng long range PCR với mồi quy trình thực theo điều kiện nhà sản xuất, sản phẩm PCR sau tinh điện di thạch agarose 0.8% cho kết phù hợp với kết dự kiến ban đầu kích thước đoạn DNA khuếch đại locus HLA, cụ thể sau: A: 4,1 kb B: 2,8 kb C: 4,2 kb DPA1: 10,3 kb DPB1: 9,7 kb DQA1: 7.3 kb DRB: 4.6 kb DQB1: 7.1 kb Hình 1: Kết điện di sản phẩm long range PCR Kiểm tra mẫu Bioanalyzer thấy phân bố kích thước DNA Sau bước hợp thư viện, sản phẩm cho thấy có độ phân bố đoạn DNA phù hợp 113 Nghiên cứu Y học với khuyến cáo nhà sản xuất Nồng độ sản phẩm cuối đo máy Qbit dựa vào để pha lỗng mẫu xuống nồng độ Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 23 * Số * 2019 DNA cuối đạt trước chạy máy giải trình tự theo khuyến cáo nhà sản xuất 1,5 – 1,8 pM Hình 2: Phân bố kích thước DNA mẫu phương pháp đo Bioanalyzer Chạy máy giải trình tự MiniSeq 66 mẫu tiến hành giải trình tự locus HLA lần chạy giải trình tự Mật độ tạo cụm (cluster density) flow cell lần chạy là: 216 k/mm2, 218 k/mm2, 215 k/mm2 Các thông số lần chạy máy đạt mức cho phép với Q30 score > 80%, độ sâu trung bình đạt mức xấp xỉ 250X độ sâu tối thiểu đạt mức 150X Hình 4: Độ sâu trung bình locus HLA Dưới thông số tổng hợp lần chạy máy Hình 5: Chỉ số Q30 locus HLA Sử dụng phần mềm HLA Assign Trusight để phân tích kết Hình 3: Độ sâu tối thiểu locus HLA 114 Kết phân bố tần suất alen HLA tóm tắt bảng sau Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 23 * Số * 2019 Bảng 1: Tần suất alell HLA lớp dân số nghiên cứu (N=66) A Tần suất (%) 01:01:01 0,8 02:01:01 3,0 02:03:01 8,3 02:03:02 0,8 02:06:01 3,8 02:07:01 9,1 03:02:01 0,8 11:01:01 23,5 11:02:01 1,5 24:02:01 15,2 24:03:01 0,8 24:07:01 3,0 24:10:01 0,8 24:20 1,5 26:01:01 3,0 29:01:01 8,3 30:01:01 0,8 31:01:02 0,8 32:01:01 0,8 33:01:01 0,8 33:03:01 9,8 34:01:01 1,5 68:01:02 0,8 74:02:01 0,8 Alell Alell B Tần suất (%) 07:02:01 07:05:01 08:01:01 13:01:01 13:02:01 15:01:01 15:02:01 15:11:01 15:12 15:25:01 15:27:01 15:35 18:01:01 18:02 27:06 35:01:01 35:03:01 35:05:01 37:01:01 38:02:01 39:01:01 40:01:02 40:06:01 44:03:02 46:01:01 48:01:01 51:01:01 51:02:01 52:01:01 54:01:01 55:02:01 55:18 56:01:01 56:04 57:01:01 58:01:01 0,8 6,8 0,8 3,8 1,5 1,5 12,1 0,8 1,5 6.8 0,8 0,8 1,5 0,8 1,5 1,5 0,8 3,0 0,8 6.8 0,8 7,6 3,0 1,5 9,8 0,8 3,0 0,8 0,8 1,5 3,0 0,8 2,3 1,5 0,8 7,6 C Alell Tần suất (%) 01:02:01 03:02:02 03:03:01 03:04:01 03:17 04:01:01 04:03:01 04:82 06:02:01 07:01:01 07:02:01 07:04:01 07:06 08:01:01 08:03:01 12:02:02 14:02:01 15:02:01 15:05:02 14,5 7,6 4,6 8,4 0,8 5,3 9,9 0,8 2,3 0,8 18,3 1,5 0,8 13,0 0,8 0,8 2,3 0,8 6,9 DRB1 Tần suất (%) 8.3 0.8 0.8 8.3 1.5 Alell 02:01:01 02:02:01 03:01:01 03:02:01 03:02:02 Alell 07:01:01 08:03:01 08:03:02 09:01:02 10:01:01 11:01:01 11:06:01 11:129 12:02:01 13:01:01 13:02:01 13:12:01 14:04:01 14:05:01 14:18 14:54:01 15:01:01 15:02:01 16:02:01 DRB1 Tần suất (%) 3,8 0,8 5,3 12,1 8,3 1,5 2,3 0,8 22,7 0,8 0,8 2,3 0,8 0,8 0,8 0,8 2,3 8,3 5,3 Alell 03:03:02 03:03:05 04:01:01 04:02:01 05:01:01 05:01:03 05:01:12 05:02:01 05:02:02 05:03:01 05:03:02 05:03:11 05:18 06:01:01 06:02:01 06:03:01 06:09:01 DQB1 Tần suất (%) 11,4 0,8 6,1 1,5 9,8 0,8 0,8 12,1 1,5 2,3 0,8 0,8 1,5 7,6 0,8 0,8 0,8 BÀN LUẬN Các kết nghiên cứu Việt Nam trước khảo sát tần suất alen HLA tiến hành phương pháp SSO‐PCR cho độ phân giải chữ số Kết nhóm nghiên cứu cho thấy mức độ tương đồng allel HLA lưu hành dân số người Kinh Việt Nam như: A*11:01, A*24:02, A*33:03; B*15:02, B*46:01, B*38:02; C*01:02, C*07:02, C*08:01; DRB1*12:02, DRB1*09:01; DRB1*15:02, DQB1*03:01, DQB1*03:03, DQB1*05:01(2,8) Như dự đốn ban đầu nhóm nghiên cứu, thực định típ HLA với độ phân giải cao phương pháp giải trình tự hệ mới, đạt ưu điểm sau so với phương pháp SSO‐PCR cũ: Bảng 2: Tần suất alell HLA lớp dân số nghiên cứu (N=66) Alell 03:01:01 04:01:01 04:03:01 04:05:01 04:06:01 Nghiên cứu Y học DQB1 Tần suất (%) 7.6 2.3 27.3 2.3 0.8 Độ phân giải cao: nghiên cứu trước Hoa cs(2), thấy độ phân giải dừng mức allel DQB1*05:01, DQB1*05:02, DQB1*05:03 nghiên cứu chúng tôi, độ phân giải định rõ 05:01:01, 05:01:03, 05:01:12, 05:02:01, 05:02:02, 05:03:01, 05:03:02, 05:03:11; Phát số allel chưa mô tả: A*24:20, A*31:01:01, A*31:01:02, A*32:01:01, 115 Nghiên cứu Y học A*33:01:01, B*07:02:01, B*15:11:01, B*15:12, B*15:35, B*37:01:01, B*40:06:01, B*55:18, C*03:17, C*07:06, C*03:04:01, C*08:03:01, C*07:02:01, C*08:01:01, DRB1*11:06:01, DRB1*13:12:01, DRB1*14:18, DRB1*14:54:01, DQB1*02:02:01, DQB1*03:03:02, DQB1*03:03:05, DQB1*06:09:01; Do đặc điểm dân số tương đồng đối tượng dân số Châu Á nên tần suất lưu hành allel phổ biến có nét tương tự Có thể thấy dân số Châu Á allel phổ biến A*24:02, A*11:01; C*01:02, C*07:02; DRB1*09:01; DQB1*03:01, DQB1*03:03(3,4,5,7) Tuy nhiên, so sánh allel có tính đa hình cao HLA‐B HLA‐DRB1, ta thấy chủng tộc người Kinh Việt Nam có nhiều nét tương đồng với dân số lân cận người Thái người Hán Trung Quốc, người Hàn Quốc lại có nhiều nét tương đồng với người Nhật Bản hơn(3,4,5,7) Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 23 * Số * 2019 Bên cạnh đó, chúng tơi xác định số biến thể HLA chưa tìm thấy trước nghiên cứu HLA quần thể người Việt Nam A*24:20; B*07:02, B*55:18; C*03:17… TÀI LIỆU THAM KHẢO KẾT LUẬN Định típ HLA độ phân giải cao phương pháp giải trình tự gen xu hướng tiếp cận định típ HLA phục vụ cho cấy ghép người Quy trình định típ HLA phương pháp giải trình tự ổn định, có tính lặp lại cao chuyển giao Thông qua nghiên cứu này, xác định tần suất alell HLA lớp I II phổ biến lưu hành đối tượng tham gia nghiên cứu, làm tiền đề cho việc xây dựng ngân hàng tế bào gốc tuỷ xương sau 116 De Santis D, Dinauer D, Duke J et al (2013) 16IHIW HLA typing by NGS: Workshop review Int J Immunogenet, 40(1):72–76 Hoa BK, Hang NTL, Kashiwase K et al (2008) HLA‐A, ‐B, ‐C, ‐ DRB1 and ‐DQB1 alleles and haplotypes in the Kinh population in Vietnam Tissue Antigens, 71(2):127–134 Ikeda N, Kojima H, Nishikawa M et al (2015) Determination of HLA‐A, ‐C, ‐B, ‐DRB1 allele and haplotype frequency in Japanese population based on family study Tissue Antigens, 85(4):252–259 Lee KW, Oh DH, Lee C, Yang SY (2005) Allelic and haplotypic diversity of HLA‐A, ‐B, ‐C, ‐DRB1, and ‐DQB1 genes in the Korean population Tissue Antigens, 65(5):437–447 Nakkam N, Konyoung P, Kanjanawart S, Saksit N, Kongpan T, Khaeso K, Khunarkornsiri U, Dornsena A, Tassaneeyakul W, Tassaneeyakul W (2018) HLA Pharmacogenetic Markers of Drug Hypersensitivity in a Thai Population Front Genet, doi: 10.3389/fgene.2018.00277 Saber W, Opie S, Rizzo JD, Zhang M‐J, Horowitz MM, Schriber J (2012) Outcomes after matched unrelated donor versus identical sibling hematopoietic cell transplantation in adults with acute myelogenous leukemia Blood, 119(17): 3908–3916 Shen Y, Cao D, Li Y et al (2014) Distribution of HLA‐A, ‐B, and ‐ C Alleles and HLA/KIR Combinations in Han Population in China J Immunol Res, doi: 10.1155/2014/565296 Vu‐Trieu A, Djoulah S, Tran‐Thi C, Ngyuyen‐Thanh T et al (1997) HLA‐DR and ‐DQB1 DNA polymorphisms in a Vietnamese Kinh population from Hanoi Eur J Immunogenetics Off J Br Soc Histocompat Immunogenetics, 24(5):345–356 Ngày nhận báo: 08/11/2018 Ngày phản biện nhận xét báo: 04/12/2018 Ngày báo đăng: 10/03/2019 ... xác định HLA trung tâm cấy ghép lớn(6) Có phương pháp giải trình tự để định típ HLA giải trình tự Sanger truyền thống giải trình tự hệ Có nhiều kỹ thuật giải trình tự hệ áp dụng để định típ HLA... máy nhận diện mẫu giải trình tự Tiến hành chạy máy 20 ‐ 24 Phương pháp phân tích kết giải trình tự gen phức hợp HLA máy giải trình tự hệ MiniSeq Nhập file kết từ máy giải trình tự MiniSeq Nghiên... quy trình xác định phức hợp HLA phương pháp giải trình tự nhằm khắc phục nhược điểm phương pháp PCR truyền thống ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Chúng tơi tiến hành định típ