Khảo sát một số đột biến gen liên quan đến điều trị đích trong ung thư đại trực tràng bằng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới (NGS)

Bài viết Khảo sát một số đột biến gen liên quan đến điều trị đích trong ung thư đại trực tràng bằng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới (NGS) trình bày khảo sát đồng thời các đột biến KRAS, NRAS và BRAF bằng kỹ thuật NGS và mối liên quan giữa các đột biến và một số đặc điểm lâm sàng.

TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 518 - THÁNG - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2022 KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐỘT BIẾN GEN LIÊN QUAN ĐẾN ĐIỀU TRỊ ĐÍCH TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI (NGS) Nguyễn Thị Huệ1, Nguyễn Xuân Hậu1,2, Triệu Tiến Sang3, Lương Thị Lan Anh1,2, Nguyễn Thị Minh Ngọc1,2, Lê Thị Minh Phương4, Lê Dương Minh Anh1, Bùi Thị Lành5, Phạm Quang Anh6, Đỗ Thị Huyền Trang1, Phạm Hùng Sơn1, Đào Thị Trang1, Vũ Thị Hà1, Vũ Thị Huyền1, Nguyễn Phú Cường7, Nguyễn Thị Trang1,2 TÓM TẮT 31 Đặt vấn đề: Đột biến KRAS, NRAS BRAF nguyên nhân gây đề kháng với thuốc điều trị nhắm đích kháng EGFR ung thư đại trực tràng (UTĐTT) Mục tiêu: Khảo sát đồng thời đột biến KRAS, NRAS BRAF kỹ thuật NGS mối liên quan đột biến số đặc điểm lâm sàng Đối tượng phương pháp: Nghiên cứu mô tả cắt ngang hồi cứu tiến cứu 58 bệnh nhân UTĐTT xét nghiệm đột biến KRAS, NRAS BRAF kỹ thuật NGS Kết quả: Tỉ lệ đột biến KRAS, NRAS BRAF 39,7%, 1,7% 8,6% Không bệnh nhân mang đột biến đồng thời hai ba gen Có mối liên quan có ý nghĩa thống kê đột biến gen vị trí ung thư Khơng có mối liên quan đột biến gen với giới, tuổi, kích thước khối u, mức độ Đại học Y Hà Nội Bệnh viện Đại học Y Hà Nội Học viện Quân Y Đại học Quốc gia Hà Nội Bệnh viện Bưu điện Đại học Y Thái Bình Bệnh viện Phụ sản Trung ương Chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Thị Trang Email: trangnguyen@hmu.edu.vn Ngày nhận bài: 10/8/2022 Ngày phản biện khoa học: 25/08/2022 Ngày duyệt bài: 10/09/2022 biệt hóa ung thư Kết luận: Cơng nghệ NGS giải trình tự đồng thời nhiều gen, mở tiền đề cho phát triển y học cá thể hóa chẩn đốn điều trị UTĐTT Từ khóa: Ung thư đại trực tràng, KRAS, NRAS, BRAF, điều trị đích, NGS SUMMARY INVESTIGATION OF GENE MUTATIONS RELATED TO ANTIEGFR TARGETED THERAPY IN COLORECTAL CANCER BY USING NEXT GENERATION SEQUENCING (NGS) TECHNIQUE Introduction: KRAS, NRAS, and BRAF mutations cause resistance to anti-EGFR targeted therapy in colorectal cancer (CRC) Objectives: Investigating the mutations of three genes KRAS, NRAS, and BRAF simultaneously in CRC by using NGS technology and correlation between these mutations and some clinical features Subjects and methods: A retrospective and prospective cross-sectional descriptive study on 58 CRC patients tested for KRAS, NRAS, and BRAF mutations by using the NGS technique Results: The mutation rate of KRAS, NRAS, and BRAF was 39.7%, 1.7%, and 8.6% respectively No patient had two or three gene mutations simultaneously There was a statistically significant correlation between gene mutations and tumor location There was no 223 HỘI NGHỊ KHOA HỌC HÌNH THÁI HỌC TỒN QUỐC LẦN THỨ XVIII NĂM 2022 statistically significant correlation between gene mutations and sex, age, or tumor size, or cancer differentiation grade Conclusions: The application of NGS technology helps to sequence multiple genes simultaneously, opening a premise for the development of personalized medicine in the diagnosis and treatment of colorectal cancer Keywords: Colorectal cancer, KRAS, NRAS, BRAF, targeted therapy, NGS I ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) bệnh ung thư phổ biến hai giới nguyên nhân gây tử vong ung thư đứng hàng thứ hai giới.1 Ở Việt Nam, tỷ lệ mắc chuẩn hóa theo tuổi bệnh UTĐTT 14,1 100.000 dân.2 Năm 2020, Việt Nam có khoảng 16.400 ca mắc 8.200 ca tử vong CRC.2 Do triệu chứng lâm sàng UTĐTT giai đoạn đầu không rõ ràng nên thực tế hầu hết bệnh nhân chẩn đoán giai đoạn muộn Đối với UTĐTT giai đoạn muộn, liệu pháp điều trị nhắm trúng đích với nhiều ưu điểm liều thấp độc hại giúp cải thiện đáng kể hiệu điều trị Hiện nay, thuốc điều trị ung thư nhắm trúng đích phổ biến kháng thể đơn dòng kháng EGFR Tuy nhiên, có tỉ lệ lớn bệnh nhân khơng đáp ứng với liệu pháp kháng EGFR Nhiều nghiên cứu đột biến gen KRAS, NRAS BRAF gây hoạt hóa q mức đường tín hiệu EGFR chế việc đề kháng với thuốc đích kháng EGFR.3,4 Do chi phí điều trị đích cao nên cần làm xét nghiệm đột biến KRAS, NRAS, BRAF trước lựa chọn phương pháp điều trị để tránh lãng phí tiền bạc thời gian bệnh nhân Ở Việt Nam, số tác giả nghiên cứu đột biến gen UTĐTT đề 224 cập đến hai ba gen Các nghiên cứu trước hầu hết sử dụng kỹ thuật PCR với độ nhạy thấp khả hạn chế phát số dạng đột biến định.5,6 Ngày nay, phát triển cơng nghệ Giải trình tự gen hệ (Next Generation Sequencing – NGS) mang lại nhìn tồn diện xét nghiệm di truyền với ưu điểm độ nhạy, độ xác, thơng lượng tốc độ cao Vì vậy, chúng tơi thực nghiên cứu với mục tiêu: “Khảo sát đồng thời đột biến ba gen KRAS, NRAS BRAF UTĐTT công nghệ NGS mối tương quan đột biến với số đặc điểm lâm sàng” II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 58 bệnh nhân chẩn đoán UTĐTT dựa triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng mô bệnh học Bệnh viện Đại học Y Hà Nội có kết xét nghiệm đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF trước điều trị đích từ 1/2020 đến 6/2022 2.2 Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu mô tả cắt ngang hồi cứu tiến cứu, phương pháp lấy mẫu thuận tiện Thời gian nghiên cứu: 8/2021 - 6/2022 Phân tích đột biến gen thực Trung tâm Di truyền lâm sàng Hệ gen (Bệnh viện Đại học Y Hà Nội) Đại học Quân Y công nghệ NGS hệ hai Kỹ thuật giải trình tự gen hệ thứ hai Tách chiết DNA: Tách gDNA từ mô FFPE hóa chất QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN Inc., Germany) ctDNA từ huyết tương hóa chất MagMAX CellFree DNA Isolation Kit (Applied Biosystems, USA) Kiểm tra nồng độ DNA TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 518 - THÁNG - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2022 sau tách chiết máy Qubit Fluorometer (Invitrogen, USA), yêu cầu nồng độ ≥ ng / µL Chuẩn bị thư viện: Các mẫu DNA đạt nồng độ yêu cầu tiến hành chuẩn bị thư viện DNA kit Ion Plus Fragment Library (Ion Torrent, Hoa Kỳ), sau làm giàu thư viện hệ thống Ion OneTouch (Ion Torrent, Hoa Kỳ) Giải trình tự: Thư viện DNA làm giàu tải vào Ion PI Chip v3 (Ion Torrent, Hoa Kỳ) sau giải trình tự tự động máy giải trình tự Ion Proton (Ion Torrent, Hoa Kỳ) Dữ liệu trình tự chuyển sang phân tích Ion Torrent Server (Ion Torrent, Hoa Kỳ) 2.3 Xử lý số liệu Số liệu sau thu thập nhập vào máy tính, làm số liệu, quản lý phân tích số liệu phần mềm thống kê tin học SPSS 20 2.4 Đạo đức nghiên cứu - Nghiên cứu tuân theo quy định Hội đồng Đạo đức Nghiên cứu Y sinh Trường Đại học Y Hà Nội - Chúng cam kết nghiên cứu tinh thần trung thực - Tất thông tin bệnh nhân giữ kín, dùng cho mục đích nghiên cứu III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Đặc điểm chung nhóm đối tượng nghiên cứu 58 bệnh nhân UTĐTT nghiên cứu, gồm 35 nam (60,34%) 23 nữ (39,66%) Tuổi thời điểm chẩn đoán dao động từ 26 đến 83 tuổi, tuổi trung bình 58,09 ± 14,419 Có 72,4% bệnh nhân từ 50 tuổi trở lên Bảng Vị trí ung thư nhóm bệnh nhân nghiên cứu Vị trí ung thư Số lượng Tỉ lệ Đại tràng phải 14 24,1% Đại tràng trái 19 32,8% Trực tràng 25 43,1% Tổng 58 100% Nhận xét: Ung thư trực tràng chiếm tỷ lệ cao nhất, 43,1%, đại tràng trái (32,8%) đại tràng phải (24,1%) 3.2 Kết khảo sát đồng thời đột biến gen KRAS, NRAS BRAF UTĐTT kỹ thuật NGS Bảng Tỉ lệ đột biến KRAS, NRAS BRAF UTĐTT Đột biến gen Số lượng Tỉ lệ KRAS 23 39,7% NRAS 1,7% BRAF 8,6% Đột biến hai 0% ba gen Tổng 29 50% Nhận xét: 50% bệnh nhân mang đột biến ba gen Tỷ lệ đột biến KRAS cao nhất, chiếm 39,7% Khơng có bệnh nhân có đồng thời hai ba đột biến gen Bảng Các dạng đột biến KRAS, NRAS BRAF Dạng đột Số Gen Tỉ lệ biến lượng G12A 5,2% G12C 1,7% G12D 13,8% G12S 3,4% KRAS G12V 6,9% G13D 5,2% Q61H 1,7% A146T 1,7% NRAS Q61R 1,7% BRAF V600E 8,6% 225 HỘI NGHỊ KHOA HỌC HÌNH THÁI HỌC TỒN QUỐC LẦN THỨ XVIII NĂM 2022 Nhận xét: KRAS có loại đột biến codon 12, 13, 61 146 Loại đột biến gen KRAS thường gặp G12D Gen NRAS có loại đột biến Q61R gen BRAF có loại đột biến V600E 3.3 Mối liên quan đột biến gen KRAS, NRAS BRAF số đặc điểm lâm sàng bệnh nhân UTĐTT Bảng Mối liên quan đột biến gen số đặc điểm lâm sàng Không đột Test kiểm Đột biến p biến định Nam 17 18 Giới 0,788 χ2 test Nữ 12 11 Tuổi Tuổi trung bình 60,76 55,41 0,16 T-test Đại tràng phải 11 Vị trí ung thư Đại tràng trái 11 0,049 χ2 test Trực tràng 15 10 < 1/4 Kích thước 1/4 -1/2 khối u (so với Fisher's Exact 0,452 chu vi đại trực Test 1/2-3/4 10 tràng) >= 3/4 12 11 Biệt hóa cao 2 Mức độ biệt Fisher's Exact Biệt hóa vừa 25 24 1,000 hóa ung thư Test Kém biệt hóa Nhận xét: p Có mối liên quan có ý nghĩa thống kê đột biến gen vị trí khối u p> 0,05 => Khơng có mối liên quan đột biến gen với giới tính, tuổi, kích thước khối u, mức độ biệt hóa ung thư IV BÀN LUẬN 4.1 Đặc điểm chung nhóm đối tượng nghiên cứu Giới tính tuổi hai yếu tố nguy ung thư nói chung ung thư đại trực tràng nói riêng Nhiều nghiên cứu tỷ lệ mắc bệnh UTĐTT nam giới cao nữ giới Theo Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế IARC, năm 2020, số ca mắc UTĐTT nam giới 1.065.960 ca, nữ giới 965.630 ca toàn giới.1 Nghiên cứu chúng tơi có phân bổ tương tự với số lượng 226 bệnh nhân nam cao khoảng 1,5 lần so với số lượng bệnh nhân nữ Nguy ung thư đại trực tràng tăng lên tuổi cao Nghiên cứu Bùi Ánh Tuyết Bệnh viện K năm 2018 cho thấy, tuổi trung bình chẩn đốn 54,5 tuổi, nhóm tuổi từ 50 đến 69 phổ biến nhất, chiếm 70,8% Độ tuổi gặp 30 tuổi, chiếm 4,6%.5 Nghiên cứu chúng tơi có kết tương tự Tuổi trung bình chẩn đốn 58,09 ± 14,419 tuổi, nhóm bệnh nhân từ 50 tuổi trở lên chiếm 72,4% Trong nghiên cứu này, ung thư trực tràng chiếm tỷ lệ cao nhất, sau ung thư đại TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 518 - THÁNG - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2022 tràng trái thấp đại tràng phải Có khác biệt tỉ lệ vị trí khối u nghiên cứu trước Điều phương pháp lấy mẫu khác nghiên cứu Tuy nhiên, vị trí khối u ảnh hưởng đến phương pháp phẫu thuật không ảnh hưởng đến định điều trị trúng đích 4.2 Các đột biến gen KRAS, NRAS BRAF bệnh nhân UTĐTT Trong ung thư đại trực tràng, KRAS gen nghiên cứu nhiều Tỷ lệ đột biến KRAS cao nhất, chiếm 40-60% Các đột biến gen BRAF NRAS gặp hơn.5–7 Nghiên cứu chúng tơi cho kết tương tự Tỷ lệ đột biến KRAS cao nhất, 39,7%, BRAF (8,6%) tỷ lệ đột biến NRAS thấp với 1,7% Đối với bệnh nhân mang đột biến ba gen khơng định liệu pháp nhắm trúng đích kháng EGFR, cần thay liệu pháp khác phù hợp Các đột biến gen KRAS, NRAS BRAF có tính loại trừ lẫn Trong nghiên cứu chúng tơi, khơng có bệnh nhân mang đột biến đồng thời hai ba gen kể Vì vậy, theo khuyến cáo Bộ Y tế, việc xét nghiệm đột biến gen NRAS BRAF tiến hành sau có kết xét nghiệm đột biến gen KRAS.8 Tuy nhiên, việc nhiều thời gian gây lãng phí tiền cho bệnh nhân Trong đó, với phát triển tiên tiến cơng nghệ NGS, dễ dàng khảo sát đồng thời nhiều gen số lượng lớn mẫu Do tỷ lệ đột biến cao nên gen KRAS có nhiều dạng đột biến nhất, dạng đột biến chủ yếu codon 12 13 Đột biến KRAS G12D xuất nhiều nhất, với tỷ lệ 13,8% Mỗi gen NRAS BRAF có loại đột biến NRAS Q61R BRAF V600E, dạng đột biến thường gặp nghiên cứu khác Theo hiểu biết chúng tơi, nay, chưa có nghiên cứu báo cáo mối liên quan tiến triển UTĐTT dạng đột biến KRAS, NRAS BRAF 4.3 Mối liên quan đột biến gen KRAS, NRAS BRAF với số đặc điểm lâm sàng bệnh nhân UTĐTT Sau kiểm định test thống kê kiểm định, chúng tơi tìm thấy thấy có mối liên quan có ý nghĩa thống kê đột biến KRAS, NRAS, BRAF vị trí khối u (p 0,05) Tỷ lệ đột biến gen ung thư trực tràng trực tràng trái cao so với đại tràng phải Điều nhiều mâu thuẫn nghiên cứu Lê Thái Khương cộng báo cáo mối liên quan đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF PIK3CA với vị trí khối u giai đoạn bệnh, đột biến gen thường gặp ung thư đại tràng phải.7 Nghiên cứu Bùi Ánh Tuyết cho thấy nguy đột biến KRAS ung thư trực tràng cao gấp 10 lần ung thư đại tràng.5 V KẾT LUẬN Các gen KRAS, NRAS BRAF có tỉ lệ đột biến cao bệnh nhân UTĐTT Xét nghiệm đột biến gen bắt buộc trước có định điều trị trúng đích Việc ứng dụng cơng nghệ NGS giúp giải trình tự đồng thời nhiều gen, mở tiền đề cho phát triển y học cá thể hóa chẩn đốn điều trị UTĐTT Tuy nhiên, cỡ mẫu nghiên cứu hạn chế nên số kết luận khơng có ý nghĩa thống kê Chúng đề xuất tiến hành nghiên cứu với cỡ mẫu lớn thời gian nghiên cứu dài để đánh giá 227 HỘI NGHỊ KHOA HỌC HÌNH THÁI HỌC TỒN QUỐC LẦN THỨ XVIII NĂM 2022 hiệu liệu pháp điều trị trúng đích bệnh nhân UTĐTT người Việt Nam TÀI LIỆU THAM KHẢO IARC Globocan 2020, Colorectal Cancer https://gco.iarc.fr/today/data/factsheets/cancer s/10_8_9-Colorectum-fact-sheet.pdf IARC Globocan 2020, Viet Nam https://gco.iarc.fr/today/data/factsheets/popula tions/704-viet-nam-fact-sheets.pdf Berg M, Soreide K EGFR and downstream genetic alterations in KRAS/BRAF and PI3K/AKT pathways in colorectal cancer: implications for targeted therapy Discov Med 2012;14(76):207-214 Van Cutsem E, Köhne CH, Láng I, et al Cetuximab plus irinotecan, fluorouracil, and leucovorin as first-line treatment for metastatic colorectal cancer: updated analysis of overall survival according to tumor KRAS and BRAF mutation status J Clin Oncol 2011;29(15):2011-2019 doi:10.1200/JCO.2010.33.5091 Bùi Ánh Tuyết Nghiên cứu số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng tình trạng đột biến gen KRAS ung thư đại trực tràng Bệnh viện K Luận án tiến sĩ Trường Đại học Y Hà Nội 2018 Nguyễn Kiến Dụ Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng đột biến gen KRAS, BRAF bệnh nhân ung thư đại trực tràng Luận án tiến sĩ Trường Đại học Y Hà Nội 2017 Lê Thái Khương, Nguyễn Đại Dương, Đỗ Đức Minh, Hoàng Anh Vũ Khảo sát đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF PIK3CA ung thư đại trực tràng kỹ thuật giải trình tự gen hệ Tạp chí Y Học TP Hồ Chí Minh 2021;25(6):191-197 Bộ Y tế Hướng dẫn chẩn đoán điều trị ung thư đại - trực tràng Quyết định số 2549/QĐBYT 19/04/2018 BIẾN ĐỔI NỒNG ĐỘ DNA PHÔI THAI TỰ DO Ở CÁC THAI PHỤ TUỔI THAI TỪ ĐẾN 15 TUẦN Vũ Thảo Hằng2, Đặng Tiến Trường2, Nguyễn Duy Bắc2, Nguyễn Xuân Kiên2 TÓM TẮT 32 Mục tiêu: Khảo sát tỷ lệ DNA phôi thai tự giai đoạn trước 10 tuần sở cho việc triển khai xét nghiệm sàng lọc trước sinh không xâm Bệnh viện Quân y 103 Học viện Quân y Chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Xuân Kiên Email: xuankiễn@yahoo.com Ngày nhận bài: 29/7/2022 Ngày phản biện khoa học: 16/08/2022 Ngày duyệt bài: 05/09/2022 228 lấn (NIPT) tuổi thai sớm Đối tượng phương pháp nghiên cứu: DNA tự tách từ huyết tương thai phụ mang thai nam có tuổi thai từ đến 15 tuần thai kỳ Định lượng DNA tự kỹ thuật Realtime PCR Xác định tỷ lệ nồng độ DNA phôi thai tự thai phụ tuổi thai đến 15 tuần Kết luận: Nồng độ tỷ lệ phần trăm DNA phôi thai tự huyết tương thai phụ từ đến 15 tuần có xu hướng tăng dần theo tuổi thai Từ khóa: cfDNA, NIPT tuổi thai  ... BRAF PIK3CA ung thư đại trực tràng kỹ thuật giải trình tự gen hệ Tạp chí Y Học TP Hồ Chí Minh 2021;25(6):191-197 Bộ Y tế Hướng dẫn chẩn đốn điều trị ung thư đại - trực tràng Quyết định số 2549/QĐBYT... đoạn bệnh, đột biến gen thư? ??ng gặp ung thư đại tràng phải.7 Nghiên cứu Bùi Ánh Tuyết cho thấy nguy đột biến KRAS ung thư trực tràng cao gấp 10 lần ung thư đại tràng. 5 V KẾT LUẬN Các gen KRAS,... có loại đột biến codon 12, 13, 61 146 Loại đột biến gen KRAS thư? ??ng gặp G12D Gen NRAS có loại đột biến Q61R gen BRAF có loại đột biến V600E 3.3 Mối liên quan đột biến gen KRAS, NRAS BRAF số đặc