Phát hiện đột biến gen KRAS trong ung thư đại trực tràng bằng kỹ thuật COLD‐PCR và giải trình tự DNA

Nghiên cứu này được thực hiện nhằm mô tả đột biến trên codon 12 và 13 của gen KRAS, giúp quyết định chỉ định kháng thể đơn dòng cho bệnh nhân. Nghiên cứu thực hiện từ tháng 01/2011 đến tháng 05/2013, 173 bệnh nhân ung thư đại trực tràng được khảo sát đột biến codon 12 và 13 của gen KRAS tại Trung tâm Y Sinh học Phân tử - Đại học Y Dược TPHCM.

Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN KRAS TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC  TRÀNG BẰNG KỸ THUẬT COLD‐PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ DNA  Hồng Anh Vũ*, Hứa Thị Ngọc Hà**  TĨM TẮT  Giới  thiệu:  Tăng biểu hiện của thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu mơ thường gặp trong ung thư đại trực  tràng (UTĐTT) và là đích điều trị của kháng thể đơn dòng. Tuy nhiên, sự kháng thuốc xảy ra khi có đột biến gen  KRAS trong tế bào ung thư. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm mơ tả đột biến trên codon 12 và 13 của gen  KRAS, giúp quyết định chỉ định kháng thể đơn dòng cho bệnh nhân.  Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Từ tháng 01/2011 đến tháng 05/2013, 173 bệnh nhân UTĐTT  được khảo sát đột biến codon 12 và 13 của gen KRAS tại Trung tâm Y Sinh học Phân tử – Đại học Y Dược  TPHCM.  Chúng  tơi  sử  dụng  kỹ  thuật  COLD‐PCR  (co‐amplification  at  lower  denaturation  temperature  polymerase chain reaction) để khuếch đại exon 2 của gen KRAS từ bệnh phẩm là mơ vùi nến. Sau đó, đột biến  của gen KRAS được xác định bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA.  Kết quả: 62 trường hợp có đột biến của gen KRAS (35,8%), trong đó 4 trường hợp mang đột biến ở cả hai  codon  12  và  13.  Có  tất  cả  7  dạng  đột  biến  được  phát  hiện,  bao  gồm  5  dạng  đột  biến  ở  codon  12  (Gly12Asp,  Gly12Val, Gly12Ser, Gly12Ala và Gly12Cys) và 2 dạng đột biến ở codon 13 (Gly13Asp và Gly13Ser).  Kết luận: Đột biến codon 12 và 13 của gen KRAS thường gặp trên bệnh nhân Việt Nam bị UTĐTT. Kết  hợp kỹ thuật COLD‐PCR và giải trình tự chuỗi DNA phù hợp cho khảo sát các đột biến này từ bệnh phẩm giải  phẫu bệnh.  Từ khóa: ung thư đại trực tràng, đột biến gen KRAS, giải trình tự chuỗi DNA, COLD‐PCR  ABSTRACT  DETECTION OF KRAS MUTATIONS IN COLORACTAL CANCER USING COLD‐PCR   AND DNA SEQUENCING  Hoang Anh Vu, Hua Thi Ngoc Ha  * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ Supplement of No 3 ‐ 2013: 51 ‐ 55  Background:  Commonly  over‐expressed  in  colorectal  cancer,  EGFR  is  an  ideal  target  for  monoclonal  antibody  therapy.  However,  drug‐resistance  was  observed  in  patients  whose  tumor  cells  harbored  KRAS  mutations. We conduct this study to describe KRAS mutations at codons 12 and 13 for selecting patients suitable  for monoclonal antibody indication.  Materials  and  methods:  From  January  2011  to  May  2013,  173  patients  with  colorectal  cancer  were  analyzed for KRAS mutations at Center for Molecular Biomedicine – University of Medicine and Pharmacy, Ho  Chi Minh City. COLD‐PCR (co‐amplification at lower denaturation temperature polymerase chain reaction) was  used to amplify KRAS exon 2 from paraffin‐embedded tissue samples. Mutations were identified by direct DNA  sequencing.  Results: KRAS mutations were detected in 62 patients  (35.8%)  including  4  patients  who  carried  double  mutations  at  both  codons  12  and  13.  In  total,  7  types  of  mutations  were  found,  of  which  5  were  at  codon  12  * Bộ mơn Giải Phẫu Bệnh, Đại học Y Dược TPHCM    ** Trung tâm Y sinh học Phân tử, Đại học Y Dược TPHCM  Tác giả liên lạc: TS. Hồng Anh Vũ  ĐT: 0122 299 3537  Email: hoangvuxinh@yahoo.com  50 Chun Đề Giải Phẫu Bệnh   Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013  Nghiên cứu Y học (Gly12Asp, Gly12Val, Gly12Ser, Gly12Ala and Gly12Cys) and 2 at codon 13 (Gly13Asp and Gly13Ser).  Conclusion: High frequency of KRAS mutations were found in Vietnamese patients with colorectal cancer.  COLD‐PCR  in  combination  with  direct  DNA  sequencing  is  suitable  for  detecting  KRAS  mutations  from  pathological samples.  Keywords: colorectal cancer, KRAS gene mutation, DNA sequencing, COLD‐PCR  chất  truyền  tin  hạ  nguồn  của  EGFR,  KRAS  có  ĐẶT VẤN ĐỀ  vai  trò  quan  trọng  trong  việc  khởi  phát  và  tiến  Rối loạn các thụ thể tyrosine kinase, trong đó  triển  của  một  số  ung  thư  như  carcinơm  tuyến  có  thụ  thể  yếu  tố  tăng  trưởng  biểu  mô  (EGFR:  của đại tràng, phổi và tụy. Khi đột biến xảy ra sẽ  epidermal  growth  factor  receptor),  thường  gặp  làm  mất  hoạt  tính  ATPase  và  giữ  phân  tử  trong  ung  thư  ở  người,  trở  thành  những  đích  protein KRAS ở trạng thái gắn ATP liên tục, dẫn  nhắm phân tử hiệu quả trong điều trị. Hoạt tính  đến hậu quả là các phân tử truyền tin hạ nguồn  tyrosine  kinase  của  EGFR  đóng  vai  trò  quan  ln hoạt động để  duy  trì  tín  hiệu  tăng  sinh  tế  trọng trong sự điều khiển sự tăng sinh và sống  bào(13).  còn  của  tế  bào,  thơng  qua  q  trình  tự  Tại Việt Nam, kháng thể đơn dòng đã được  phosphoryl hóa thụ thể EGFR hoặc thơng qua 2  chỉ  định  cho  UTĐTT  giai  đoạn  tiến  xa.  Nghiên  con đường truyền tín hiệu trung gian hạ nguồn  cứu này được tiến hành nhằm xác định tần suất  là  con  đường  PIK3CA/AKT/mTOR  và  đột biến tại codon 12 và 13 của gen KRAS ở bệnh  RAS/RAF/MAPK(4).  Sự  hoạt  hóa  của  protein  nhân  UTĐTT  bằng  kỹ  thuật  COLD‐PCR  (co‐ EGFR khởi động cho các dòng thác tín hiệu nội  amplification  at  lower  denaturation  bào, có liên quan đến một số con đường truyền  temperature)  kết  hợp  với  giải  trình  tự  DNA,  tin  để  gây  ra  những  đáp  ứng  tế  bào  vô  cùng  giúp  quyết  định  lựa  chọn  kháng  thể  đơn  dòng  quan trọng bao gồm tăng sinh tế bào, biệt hóa tế  cho  bệnh  nhân  một  cách  phù  hợp.  Kỹ  thuật  bào,  sự  di  động  và  sinh  tồn  của  tế  bào.  Trong  COLD‐PCR  cho  phép  khuếch  đại  ưu  thế  dòng  ung  thư  đại  trực  tràng  (UTĐTT),  protein  EGFR  alen mang đột biến, giúp cải thiện độ nhạy của  thường  biểu  hiện  quá  mức  trên  bề  mặt  tế  bào,  kỹ  thuật  giải  trình  tự  chuỗi  DNA(10).  Trong  kỹ  được  coi  là  nguồn  gốc  khởi  phát  các  tín  hiệu  thuật này, sau khoảng 10 chu kỳ luân nhiệt đầu  tăng  sinh  tế  bào  quá  độ  trong  khối  u.  Ức  chế  tiên với kỹ thuật PCR chuẩn, người ta sử dụng  hoạt tính tyrosine kinase của EGFR là một chiến  nhiệt độ biến tính thấp trong khoảng 80 – 900C  lược  điều  trị  thích  hợp,  đã  được  nghiên  cứu  chỉ đủ cho các mạch đơi dị hợp tử có mang đột  nhiều  trong  UTĐTT.  Tuy  nhiên  kháng  thể  đơn  biến  trong  sản  phẩm  PCR  duỗi  ra  để  được  ưu  dòng  ức  chế  đặc  hiệu  sự  hoạt  hóa  EGFR  như  tiên khuếch đại. Với những điều kiện tối ưu hóa,  cetuximab hay panitumumab được chứng minh  COLD‐PCR  có  thể  giúp  cho  giải  trình  tự  DNA  chỉ có hiệu quả trong điều trị UTĐTT giai đoạn  đạt độ nhạy T c.38G>A c.34G>T c.35G>C c.34G>A c.37G>A Gly12Val Gly13Asp Gly12Cys Gly12Val Gly12Ser Gly13Ser Tỷ lệ (n = 173) 10,9 18 10,4 15 8,6 2,3 2,3 1,7 1,7 Cần chú ý rằng tình trạng khơng đột biến ở  codon 12 và 13 của gen KRAS chưa đủ đảm bảo  cho  bệnh  nhân  có  đáp  ứng  với  cetuximab  hoặc  panitumumab. Các yếu tố kháng thuốc khác bao  gồm  đột  biến  codon  61  và  146  của  gen  KRAS,  đột biến codon 12, 13 và 61 của gen NRAS, đột  53 Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 biến  codon  600  của  gen  BRAF,  đột  biến  exon  9  và  20  của  gen  PIK3CA(3,14,15)  nên  được  khảo  sát  trong các nghiên cứu tiếp theo.  10 11   KẾT LUẬN  Đột  biến  gen  KRAS  thường  gặp  trong  UTĐTT  ở  bệnh  nhân  Việt  Nam.  Phát  hiện  đột  biến  gen  KRAS  bằng  kỹ  thuật  COLD‐PCR  kết  hợp giải trình tự chuỗi DNA nên được thực hiện  cho bệnh nhân muốn được được trị bằng kháng  thể đơn dòng cetuximab.  12 13 14 TÀI LIỆU THAM KHẢO  Allegra  CJ,  Jessup  JM,  Somerfield  MR,  Hamilton  SR,  Hammond  EH,  Hayes  DF,  et  al  (2009).  American  Society  of  Clinical  Oncology  provisional  clinical  opinion:  testing  for  KRAS  gene  mutations  in  patients  with  metastatic  colorectal  carcinoma to predict response to anti‐epidermal growth factor  receptor  monoclonal  antibody  therapy.  J  Clin  Oncol;  27(12):2091‐6.  Amado  RG,  Wolf  M,  Peeters  M,  Van  Cutsem  E,  Siena  S,  Freeman  DJ,  et  al  (2008).  Wild‐type  KRAS  is  required  for  panitumumab  efficacy  in  patients  with  metastatic  colorectal  cancer. J Clin Oncol.;26(10):1626‐34.  Benvenuti  S,  Sartore‐Bianchi  A,  Di  Nicolantonio  F,  Zanon  C,  Moroni M, Veronese S, et al (2007). Oncogenic activation of the  RAS/RAF  signaling  pathway  impairs  the  response  of  metastatic  colorectal  cancers  to  anti‐epidermal  growth  factor  receptor antibody therapies. Cancer Res;67(6):2643‐8.  Ciardiello  F,  Tortora  G  (2008).  EGFR  antagonists  in  cancer  treatment. N Engl J Med;358(11):1160‐74.  Di Fiore F, Blanchard F, Charbonnier F, Le Pessot F, Lamy A,  Galais  MP,  et  al  (2007).  Clinical  relevance  of  KRAS  mutation  15 16 17 18 detection in metastatic colorectal cancer treated by Cetuximab  plus chemotherapy. Br J Cancer;96(8):1166‐9.  Domagala  P,  Hybiak  J,  Sulzyc‐Bielicka  V,  Cybulski  C,  Rys  J,  Domagala  W  (2012).  KRAS  mutation  testing  in  colorectal  cancer as an example of the pathologistʹs role in personalized  targeted  therapy:  a  practical  approach.  Pol  J  Pathol;63(3):145‐ 64.  Edkins S, OʹMeara S, Parker A, Stevens C, Reis M, Jones S, et  al.  (2006)  Recurrent  KRAS  codon  146  mutations  in  human  colorectal cancer. Cancer Biol Ther;5(8):928‐32.  Karapetis CS, Khambata‐Ford S, Jonker DJ, OʹCallaghan CJ, Tu  D, Tebbutt NC, et al (2008). K‐ras mutations and benefit from  cetuximab  in  advanced  colorectal  cancer.  N  Engl  J  Med;359(17):1757‐65.  Kristensen  LS,  Kjeldsen  TE,  Hager  H,  Hansen  LL  (2012).  Competitive  amplification  of  differentially  melting  amplicons  (CADMA)  improves  KRAS  hotspot  mutation  testing  in  colorectal cancer. BMC Cancer.12:548.  Li J, Wang L, Mamon H, Kulke MH, Berbeco R, Makrigiorgos  GM  (2008).  Replacing  PCR  with  COLD‐PCR  enriches  variant  DNA sequences and redefines the sensitivity of genetic testing.  Nat Med;14(5):579‐84.  Lievre A, Bachet JB, Boige V, Cayre A, Le Corre D, Buc E, et al  (2008). KRAS mutations as an independent prognostic factor in  patients  with  advanced  colorectal  cancer  treated  with  cetuximab. J Clin Oncol;26(3):374‐9.  Oliveira  C,  Westra  JL,  Arango  D,  Ollikainen  M,  Domingo  E,  Ferreira A, et al (2004). Distinct patterns of KRAS mutations in  colorectal  carcinomas  according  to  germline  mismatch  repair  defects  and  hMLH1  methylation  status.  Hum  Mol  Genet;13(19):2303‐11.  Roberts  PJ,  Der  CJ  (2007).  Targeting  the  Raf‐MEK‐ERK  mitogen‐activated protein kinase cascade for the treatment of  cancer. Oncogene;26(22):3291‐310.  Sartore‐Bianchi  A,  Martini  M,  Molinari  F,  Veronese  S,  Nichelatti  M,  Artale  S,  et  al  (2009).  PIK3CA  mutations  in  colorectal  cancer  are  associated  with  clinical  resistance  to  EGFR‐targeted monoclonal antibodies. Cancer Res;69(5):1851‐ 7.  Sullivan KM, Kozuch PS (2011). Impact of KRAS Mutations on  Management  of  Colorectal  Carcinoma.  Patholog  Res  Int:219309.  Van  Cutsem  E,  Nordlinger  B,  Cervantes  A  (2010).  Advanced  colorectal  cancer:  ESMO  Clinical  Practice  Guidelines  for  treatment. Ann Oncol;21 Suppl 5:v93‐7.  Van Cutsem EJ, Oliveira J, Kataja VV (2005). ESMO Minimum  Clinical  Recommendations  for  diagnosis,  treatment  and  follow‐up of advanced colorectal cancer. Ann Oncol;16 Suppl  1:i18‐9.  Zuo Z, Chen SS, Chandra PK, Galbincea JM, Soape M, Doan S,  et al (2009). Application of COLD‐PCR for improved detection  of KRAS mutations in clinical samples. Mod Pathol.;22(8):1023‐ 31.    Ngày nhận bài báo      Ngày phản biện nhận xét bài báo:  Ngày bài báo được đăng:     08‐06‐2013  20‐06‐2013  15–07‐2013      54 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh   ... Đột biến gen KRAS KRAS đột biến đóng  vai  trò  quan  trọng  cả  trong hình thành ung thư cũng như sự đề kháng  với  điều  trị.  Trong ung thư đại trực tràng,   sự  hiện diện của đột biến gen KRAS là một yếu tố ... bào  ung thư.   Tiếp  đó,  kỹ thuật COLD‐PCR được  dùng  để  khuếch đại exon 2 có chứa codon 12 và 13. Đây  là  kỹ thuật được  phát minh  bởi  Li  và cộng  sự,  giúp phát hiện được đột biến gen bằng giải trình ... nhân  Việt  Nam.  Phát hiện đột biến gen KRAS bằng kỹ thuật COLD‐PCR kết  hợp giải trình tự chuỗi DNA nên được thực hiện cho bệnh nhân muốn được được trị bằng kháng  thể đơn dòng cetuximab.