Nghiên cứu này được thực hiện nhằm mô tả đột biến trên codon 12 và 13 của gen KRAS, giúp quyết định chỉ định kháng thể đơn dòng cho bệnh nhân. Nghiên cứu thực hiện từ tháng 01/2011 đến tháng 05/2013, 173 bệnh nhân ung thư đại trực tràng được khảo sát đột biến codon 12 và 13 của gen KRAS tại Trung tâm Y Sinh học Phân tử - Đại học Y Dược TPHCM.
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN KRAS TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG BẰNG KỸ THUẬT COLD‐PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ DNA Hồng Anh Vũ*, Hứa Thị Ngọc Hà** TĨM TẮT Giới thiệu: Tăng biểu hiện của thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu mơ thường gặp trong ung thư đại trực tràng (UTĐTT) và là đích điều trị của kháng thể đơn dòng. Tuy nhiên, sự kháng thuốc xảy ra khi có đột biến gen KRAS trong tế bào ung thư. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm mơ tả đột biến trên codon 12 và 13 của gen KRAS, giúp quyết định chỉ định kháng thể đơn dòng cho bệnh nhân. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Từ tháng 01/2011 đến tháng 05/2013, 173 bệnh nhân UTĐTT được khảo sát đột biến codon 12 và 13 của gen KRAS tại Trung tâm Y Sinh học Phân tử – Đại học Y Dược TPHCM. Chúng tơi sử dụng kỹ thuật COLD‐PCR (co‐amplification at lower denaturation temperature polymerase chain reaction) để khuếch đại exon 2 của gen KRAS từ bệnh phẩm là mơ vùi nến. Sau đó, đột biến của gen KRAS được xác định bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA. Kết quả: 62 trường hợp có đột biến của gen KRAS (35,8%), trong đó 4 trường hợp mang đột biến ở cả hai codon 12 và 13. Có tất cả 7 dạng đột biến được phát hiện, bao gồm 5 dạng đột biến ở codon 12 (Gly12Asp, Gly12Val, Gly12Ser, Gly12Ala và Gly12Cys) và 2 dạng đột biến ở codon 13 (Gly13Asp và Gly13Ser). Kết luận: Đột biến codon 12 và 13 của gen KRAS thường gặp trên bệnh nhân Việt Nam bị UTĐTT. Kết hợp kỹ thuật COLD‐PCR và giải trình tự chuỗi DNA phù hợp cho khảo sát các đột biến này từ bệnh phẩm giải phẫu bệnh. Từ khóa: ung thư đại trực tràng, đột biến gen KRAS, giải trình tự chuỗi DNA, COLD‐PCR ABSTRACT DETECTION OF KRAS MUTATIONS IN COLORACTAL CANCER USING COLD‐PCR AND DNA SEQUENCING Hoang Anh Vu, Hua Thi Ngoc Ha * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ Supplement of No 3 ‐ 2013: 51 ‐ 55 Background: Commonly over‐expressed in colorectal cancer, EGFR is an ideal target for monoclonal antibody therapy. However, drug‐resistance was observed in patients whose tumor cells harbored KRAS mutations. We conduct this study to describe KRAS mutations at codons 12 and 13 for selecting patients suitable for monoclonal antibody indication. Materials and methods: From January 2011 to May 2013, 173 patients with colorectal cancer were analyzed for KRAS mutations at Center for Molecular Biomedicine – University of Medicine and Pharmacy, Ho Chi Minh City. COLD‐PCR (co‐amplification at lower denaturation temperature polymerase chain reaction) was used to amplify KRAS exon 2 from paraffin‐embedded tissue samples. Mutations were identified by direct DNA sequencing. Results: KRAS mutations were detected in 62 patients (35.8%) including 4 patients who carried double mutations at both codons 12 and 13. In total, 7 types of mutations were found, of which 5 were at codon 12 * Bộ mơn Giải Phẫu Bệnh, Đại học Y Dược TPHCM ** Trung tâm Y sinh học Phân tử, Đại học Y Dược TPHCM Tác giả liên lạc: TS. Hồng Anh Vũ ĐT: 0122 299 3537 Email: hoangvuxinh@yahoo.com 50 Chun Đề Giải Phẫu Bệnh Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 Nghiên cứu Y học (Gly12Asp, Gly12Val, Gly12Ser, Gly12Ala and Gly12Cys) and 2 at codon 13 (Gly13Asp and Gly13Ser). Conclusion: High frequency of KRAS mutations were found in Vietnamese patients with colorectal cancer. COLD‐PCR in combination with direct DNA sequencing is suitable for detecting KRAS mutations from pathological samples. Keywords: colorectal cancer, KRAS gene mutation, DNA sequencing, COLD‐PCR chất truyền tin hạ nguồn của EGFR, KRAS có ĐẶT VẤN ĐỀ vai trò quan trọng trong việc khởi phát và tiến Rối loạn các thụ thể tyrosine kinase, trong đó triển của một số ung thư như carcinơm tuyến có thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu mô (EGFR: của đại tràng, phổi và tụy. Khi đột biến xảy ra sẽ epidermal growth factor receptor), thường gặp làm mất hoạt tính ATPase và giữ phân tử trong ung thư ở người, trở thành những đích protein KRAS ở trạng thái gắn ATP liên tục, dẫn nhắm phân tử hiệu quả trong điều trị. Hoạt tính đến hậu quả là các phân tử truyền tin hạ nguồn tyrosine kinase của EGFR đóng vai trò quan ln hoạt động để duy trì tín hiệu tăng sinh tế trọng trong sự điều khiển sự tăng sinh và sống bào(13). còn của tế bào, thơng qua q trình tự Tại Việt Nam, kháng thể đơn dòng đã được phosphoryl hóa thụ thể EGFR hoặc thơng qua 2 chỉ định cho UTĐTT giai đoạn tiến xa. Nghiên con đường truyền tín hiệu trung gian hạ nguồn cứu này được tiến hành nhằm xác định tần suất là con đường PIK3CA/AKT/mTOR và đột biến tại codon 12 và 13 của gen KRAS ở bệnh RAS/RAF/MAPK(4). Sự hoạt hóa của protein nhân UTĐTT bằng kỹ thuật COLD‐PCR (co‐ EGFR khởi động cho các dòng thác tín hiệu nội amplification at lower denaturation bào, có liên quan đến một số con đường truyền temperature) kết hợp với giải trình tự DNA, tin để gây ra những đáp ứng tế bào vô cùng giúp quyết định lựa chọn kháng thể đơn dòng quan trọng bao gồm tăng sinh tế bào, biệt hóa tế cho bệnh nhân một cách phù hợp. Kỹ thuật bào, sự di động và sinh tồn của tế bào. Trong COLD‐PCR cho phép khuếch đại ưu thế dòng ung thư đại trực tràng (UTĐTT), protein EGFR alen mang đột biến, giúp cải thiện độ nhạy của thường biểu hiện quá mức trên bề mặt tế bào, kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA(10). Trong kỹ được coi là nguồn gốc khởi phát các tín hiệu thuật này, sau khoảng 10 chu kỳ luân nhiệt đầu tăng sinh tế bào quá độ trong khối u. Ức chế tiên với kỹ thuật PCR chuẩn, người ta sử dụng hoạt tính tyrosine kinase của EGFR là một chiến nhiệt độ biến tính thấp trong khoảng 80 – 900C lược điều trị thích hợp, đã được nghiên cứu chỉ đủ cho các mạch đơi dị hợp tử có mang đột nhiều trong UTĐTT. Tuy nhiên kháng thể đơn biến trong sản phẩm PCR duỗi ra để được ưu dòng ức chế đặc hiệu sự hoạt hóa EGFR như tiên khuếch đại. Với những điều kiện tối ưu hóa, cetuximab hay panitumumab được chứng minh COLD‐PCR có thể giúp cho giải trình tự DNA chỉ có hiệu quả trong điều trị UTĐTT giai đoạn đạt độ nhạy T c.38G>A c.34G>T c.35G>C c.34G>A c.37G>A Gly12Val Gly13Asp Gly12Cys Gly12Val Gly12Ser Gly13Ser Tỷ lệ (n = 173) 10,9 18 10,4 15 8,6 2,3 2,3 1,7 1,7 Cần chú ý rằng tình trạng khơng đột biến ở codon 12 và 13 của gen KRAS chưa đủ đảm bảo cho bệnh nhân có đáp ứng với cetuximab hoặc panitumumab. Các yếu tố kháng thuốc khác bao gồm đột biến codon 61 và 146 của gen KRAS, đột biến codon 12, 13 và 61 của gen NRAS, đột 53 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 biến codon 600 của gen BRAF, đột biến exon 9 và 20 của gen PIK3CA(3,14,15) nên được khảo sát trong các nghiên cứu tiếp theo. 10 11 KẾT LUẬN Đột biến gen KRAS thường gặp trong UTĐTT ở bệnh nhân Việt Nam. Phát hiện đột biến gen KRAS bằng kỹ thuật COLD‐PCR kết hợp giải trình tự chuỗi DNA nên được thực hiện cho bệnh nhân muốn được được trị bằng kháng thể đơn dòng cetuximab. 12 13 14 TÀI LIỆU THAM KHẢO Allegra CJ, Jessup JM, Somerfield MR, Hamilton SR, Hammond EH, Hayes DF, et al (2009). American Society of Clinical Oncology provisional clinical opinion: testing for KRAS gene mutations in patients with metastatic colorectal carcinoma to predict response to anti‐epidermal growth factor receptor monoclonal antibody therapy. J Clin Oncol; 27(12):2091‐6. Amado RG, Wolf M, Peeters M, Van Cutsem E, Siena S, Freeman DJ, et al (2008). Wild‐type KRAS is required for panitumumab efficacy in patients with metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol.;26(10):1626‐34. Benvenuti S, Sartore‐Bianchi A, Di Nicolantonio F, Zanon C, Moroni M, Veronese S, et al (2007). Oncogenic activation of the RAS/RAF signaling pathway impairs the response of metastatic colorectal cancers to anti‐epidermal growth factor receptor antibody therapies. Cancer Res;67(6):2643‐8. Ciardiello F, Tortora G (2008). EGFR antagonists in cancer treatment. N Engl J Med;358(11):1160‐74. Di Fiore F, Blanchard F, Charbonnier F, Le Pessot F, Lamy A, Galais MP, et al (2007). Clinical relevance of KRAS mutation 15 16 17 18 detection in metastatic colorectal cancer treated by Cetuximab plus chemotherapy. Br J Cancer;96(8):1166‐9. Domagala P, Hybiak J, Sulzyc‐Bielicka V, Cybulski C, Rys J, Domagala W (2012). KRAS mutation testing in colorectal cancer as an example of the pathologistʹs role in personalized targeted therapy: a practical approach. Pol J Pathol;63(3):145‐ 64. Edkins S, OʹMeara S, Parker A, Stevens C, Reis M, Jones S, et al. (2006) Recurrent KRAS codon 146 mutations in human colorectal cancer. Cancer Biol Ther;5(8):928‐32. Karapetis CS, Khambata‐Ford S, Jonker DJ, OʹCallaghan CJ, Tu D, Tebbutt NC, et al (2008). K‐ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer. N Engl J Med;359(17):1757‐65. Kristensen LS, Kjeldsen TE, Hager H, Hansen LL (2012). Competitive amplification of differentially melting amplicons (CADMA) improves KRAS hotspot mutation testing in colorectal cancer. BMC Cancer.12:548. Li J, Wang L, Mamon H, Kulke MH, Berbeco R, Makrigiorgos GM (2008). Replacing PCR with COLD‐PCR enriches variant DNA sequences and redefines the sensitivity of genetic testing. Nat Med;14(5):579‐84. Lievre A, Bachet JB, Boige V, Cayre A, Le Corre D, Buc E, et al (2008). KRAS mutations as an independent prognostic factor in patients with advanced colorectal cancer treated with cetuximab. J Clin Oncol;26(3):374‐9. Oliveira C, Westra JL, Arango D, Ollikainen M, Domingo E, Ferreira A, et al (2004). Distinct patterns of KRAS mutations in colorectal carcinomas according to germline mismatch repair defects and hMLH1 methylation status. Hum Mol Genet;13(19):2303‐11. Roberts PJ, Der CJ (2007). Targeting the Raf‐MEK‐ERK mitogen‐activated protein kinase cascade for the treatment of cancer. Oncogene;26(22):3291‐310. Sartore‐Bianchi A, Martini M, Molinari F, Veronese S, Nichelatti M, Artale S, et al (2009). PIK3CA mutations in colorectal cancer are associated with clinical resistance to EGFR‐targeted monoclonal antibodies. Cancer Res;69(5):1851‐ 7. Sullivan KM, Kozuch PS (2011). Impact of KRAS Mutations on Management of Colorectal Carcinoma. Patholog Res Int:219309. Van Cutsem E, Nordlinger B, Cervantes A (2010). Advanced colorectal cancer: ESMO Clinical Practice Guidelines for treatment. Ann Oncol;21 Suppl 5:v93‐7. Van Cutsem EJ, Oliveira J, Kataja VV (2005). ESMO Minimum Clinical Recommendations for diagnosis, treatment and follow‐up of advanced colorectal cancer. Ann Oncol;16 Suppl 1:i18‐9. Zuo Z, Chen SS, Chandra PK, Galbincea JM, Soape M, Doan S, et al (2009). Application of COLD‐PCR for improved detection of KRAS mutations in clinical samples. Mod Pathol.;22(8):1023‐ 31. Ngày nhận bài báo Ngày phản biện nhận xét bài báo: Ngày bài báo được đăng: 08‐06‐2013 20‐06‐2013 15–07‐2013 54 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh ... Đột biến gen KRAS KRAS đột biến đóng vai trò quan trọng cả trong hình thành ung thư cũng như sự đề kháng với điều trị. Trong ung thư đại trực tràng, sự hiện diện của đột biến gen KRAS là một yếu tố ... bào ung thư. Tiếp đó, kỹ thuật COLD‐PCR được dùng để khuếch đại exon 2 có chứa codon 12 và 13. Đây là kỹ thuật được phát minh bởi Li và cộng sự, giúp phát hiện được đột biến gen bằng giải trình ... nhân Việt Nam. Phát hiện đột biến gen KRAS bằng kỹ thuật COLD‐PCR kết hợp giải trình tự chuỗi DNA nên được thực hiện cho bệnh nhân muốn được được trị bằng kháng thể đơn dòng cetuximab.