Dựa vào cơ sở hình thái thực vật thì khó phân biệt được loài và chưa đủ cơ sở khoa học để định danh đúng loài đối với một số loài thực vật có hình thái giống nhau. Trong các tài liệu về cây thuốc, tên khoa học của cây Đinh lăng lá tròn được xác định dựa vào hình thái thực vật là Polyscias balfouriana (Andre) L.H.Bailey thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae). Mục tiêu nghiên cứu của đề tài nhằm phân tích đặc điểm hình thái, giải trình tự gen RBCL để xác định tên khoa học của cây Đinh lăng lá tròn. Mẫu lá Đinh lăng lá tròn được thu thập ở vườn dược liệu Trường đại học Tây đô.
Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 07 - 2019 XÁC ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA CÂY ĐINH LĂNG LÁ TRỊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN RBCL Đỗ Văn Mãi, Thiều Văn Đường, Vũ Thị Bình Trần Công Luận* Khoa Dược - Điều dưỡng, Trường Đại học Tây Đô (Email: dvmai@tdu.edu.vn) Ngày nhận: 03/9/2019 Ngày phản biện: 17/9/2019 Ngày duyệt đăng: 24/9/2019 TÓM TẮT Dựa vào sở hình thái thực vật khó phân biệt loài chưa đủ sở khoa học để định danh loài số loài thực vật có hình thái giống Trong tài liệu thuốc, tên khoa học Đinh lăng trịn xác định dựa vào hình thái thực vật Polyscias balfouriana (Andre) L.H.Bailey thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae) Mục tiêu nghiên cứu đề tài nhằm phân tích đặc điểm hình thái, giải trình tự gen RBCL để xác định tên khoa học Đinh lăng tròn Mẫu Đinh lăng tròn thu thập vườn dược liệu Trường đại học Tây đô Kết giải trình tự đoạn gen RBCL Đinh lăng trịn cho thấy có tương đồng trình tự gen loài P balfouriana (Andre) L.H.Bailey công bố ngân hàng liệu đến 99% Do đó, phương pháp giải trình tự gen ADN xác định tên khoa học Đinh lăng tròn Polyscias balfouriana (Andre) L.H.Bailey thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae) Kết giúp khẳng định tên khoa học Đinh lăng tròn định danh dựa sở phân loại theo hình thái thực vật trước Từ khóa: ADN, Đinh lăng trịn, Polyscias balfouriana, trình tự gen RBCL Trích dẫn: Đỗ Văn Mãi, Thiều Văn Đường, Vũ Thị Bình Trần Cơng Luận, 2019 Xác định tên khoa học Đinh lăng trịn phương pháp giải trình tự gen RBCL Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô 07: 148-156 *PGS TS Trần Công Luận - Trưởng Khoa Dược & Điều dưỡng, Trường Đại học Tây Đơ 148 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Đinh lăng thuộc chi Polyscias, giới có khoảng 150 lồi, chủ yếu phân bố châu Phi, châu Á nhiệt đới, New Guinea, Thái Bình Dương (trừ Australia New Zealand) Cây Đinh lăng có nguồn gốc Thái Bình Dương, lần đầu phát đảo Polynésie (Nguyễn Văn Đạt, Trần Thị Phương Anh, 2015).Theo điều tra Trung tâm Sâm Việt Nam tỉnh phía Nam, Đinh lăng có lồi: Polyscias fruticosa (L) Harm, Polyscias balfouriana Bailey, Polyscias filicifolia (Merr et Fourn ) Bailey, Polyscias guilfeyleivar lacinita Bailey, Polyscias guilfeylei (Cogh et March) Bailey), Polyscias scutellarie (N.L.Burn) Fosberg (Nguyễn Thượng Dong cs, 2007) Để xác định tên khoa Số 07 - 2019 học lồi cây, thơng qua phân tích đặc điểm hình thái, so sánh với khóa phân loại thực vật phân tích mã gen ADN so sánh với gen ADN gốc ngân hàng gen Để khẳng định xác tên khoa học Đinh lăng tròn, nghiên cứu thực qua phương pháp giải trình tự gen ADN lồi NGUN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu Mẫu non Đinh lăng tròn trồng vườn Dược liệu Trường Đại học Tây Đô thu thập để chiết phân tích ADN giải trình tự gen, so sánh với mẫu trình tự gen lồi thuộc chi Polyscias Hình Đinh lăng trịn Hóa chất ly trích DNA: CTAB Buffer (2% CTAB, 100 mM Tris pH 8.0, 20 mMEDTApH8.0,1.4MNaCl), βmercaptoethanol, Chloroform: Isoamylalcohol (24:1), Enzyme RNase, Isopropanol, ethanol (70%) Tất hóa chất sử dụng thí nghiệm có nguồn gốc từ cơng ty Merck, Đức Hóa chất PCR điện di: PCRMix (NEXpro, Korea), PCR 2X MasterMix, agarose tinh khiết, thuốc nhuộm GelRed, TAE 1X, Loading dye 6x, Ladder kb plus (Thermo Scientific, USA), TE, nước tinh (nước cất lần qua trùng 121oC 20phút) Thiết bị: Điện di ATTO CORPORATION AE 7344, máy điện di 149 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô gel Polyacrylamide ATTA Compact PAGE-Twin (ATTA, Nhật), máy PCR GeneAmp PCR System 2700 (Amplied Biosystems – Malaysia), máy đọc gel tia UV (BioBlockScientific, Pháp) 2.2 Phương pháp nghiên cứu * Phương pháp mô tả hình thái Quan sát mơ tả hình thái bên Đinh lăng Dựa vào phương pháp Nguyễn Nghĩa Thìn (2006) có cải tiến, phận mô tả bao gồm: thân, lá… * Tách chiết tổng số tinh ADN toàn phần tách từ tươi theo quy trình tách chiết phương pháp CTAB có cải tiến (Doyle and Doyle, 1990) Trước tiên cân 100 mg mẫu cho vào cối tiến hành nghiền mịn mL dung dịch CTAB 2X ủ 65oC 15 phút Cho mẫu nghiền CTAB vào tuýp cho thêm CTAB, chuẩn lên vạch 1,5 mL Trộn ly tâm 13000 vòng 10 phút Sau ly tâm xong, rút tuýp 1000 µL lớp dịch bên cho vào tuýp Sau thêm vào 10 µL β-mercaptoethanol/tp Tiến hành ủ nhiệt độ 65 o C 60 phút (mỗi 10 phút trộn mẫu lần) Tiếp theo cho thêm vào tuýp 500 µL chloroform, trộn đem ly tâm 13000 vòng 10 phút Hút 750 µL phần dung dịch bên cho vào tuýp mới, sau tiếp tục thêm vào 500 µL chloroform, trộn ly tâm 13000 vòng 10 phút Chuyển 550 µL dung dịch bên cho vào tuýp Số 07 - 2019 mới, sau thêm 500 µL chloroform vào tuýp ly tâm 13000 vòng 10 phút Rút 350 µL lớp dịch bên cho vào mới, sau thêm µL RNase vào tuýp, lắc ủ mẫu nhiệt độ 37 oC Sau ủ mẫu, tiếp tục thêm 300 µL CTAB 2X 500 µL chloroform vào tuýp Đem mẫu ly tâm 13000 vòng 10 phút Tiếp theo rút tuýp 400 µL lớp dịch bên cho vào tuýp mới, đồng thời thêm 400 µL isopropanol (tỉ lệ 1:1), trộn ủ lạnh nhiệt độ -20oC 30 phút Mẫu ly tâm 13000 vòng phút, tiến hành đổ bỏ cẩn thận phần dung dịch bên trên, giữ lại phần kết tủa lắng tụ bên Thêm 500 µL ethanol 70% vào tuýp ly tâm 13000 vòng phút để rửa mẫu, sau đổ bỏ phần cồn chừa lại kết tủa Thêm tiếp tục 500 µL ethanol 70% vào tuýp để rửa mẫu lần hai ly tâm 13000 vịng phút Sau đổ bỏ phần cồn chừa lại kết tủa Dùng micropipet hút phần cồn cịn sót lại để mẫu khô (phơi quạt trần) Cuối thêm vào tuýp 30 µL TE (pH = 8,0) để hòa tan ADN trữ lạnh nhiệt độ -20 oC * Khuếch đại ADN phản ứng PCR Đoạn trình tự AND khuếch đại sử dụng cặp mồi rbcLa-F: 5’ATGTCACCACAAACAGAGACTAA AGC-3’ (Levin et al., 2003) rbcLa-R: 5’-GTAAAATCAAGTCCACCRCG-3’ (Kress and Erickson, 2007) 150 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đơ Chu trình nhiệt cho phản ứng CPR: Thực 35 chu kỳ gia nhiệt, bao gồm phút 95 oC, 30 giây 95 oC, 30 giây 60 oC, 30 giây 72 oC, kéo dài chuỗi phút 72 oC sản phẩm trữ 10 oC 20 phút * Điện di ADN gel agarose ADN sau ly trích tinh kiểm tra cách điện di gel agarose 1% Sau điện di, gel nhuộm thuốc nhuộm redsafe (Biobasic, UK), ghi nhận kết * Điện di sản phẩm PCR giải trình Số 07 - 2019 * Phân tích số liệu so sánh trình tự ADN Trọng lượng phân tử tính tốn phần mềm Gel Analyzer Kết giải trình tự lưu trữ dạng FASTA phân tích phần mềm BioEdit phiên cập nhật 7.0.5 (Hall, 1999) Sau phương pháp BLAST hệ thống ngân hàng gene NCBI (National Center for Biotechnology Information) dùng cho việc nhận diện loài KẾT QUẢ tự * Đặc điểm hình thái Đinh lăng trịn Điện di sản phẩm PCR tinh chế kit Wizard SV Gel PCR Clean-up System (Promega) Dựa theo phương pháp Sanger (Sanger et al., 1977) Mỗi loại dideoxynucleotid đánh dấu chất huỳnh quang có màu khác Nhờ tất oligonucleotid chấm dứt dideoxynucleotid có màu ADN giải trình tự công ty Phù Sa Biochem (thành phố Vĩnh Long) máy đọc trình tự tự động Cây bụi cao, có mùi thơm Thân màu đồng lốm đốm điểm xám Lá kép thường mang phụ cuống dài, phụ đầu xuất có kích thước lớn phụ cịn lại; phiến trịn, hình tim gốc đầu tà, xanh đậm, khơng lơng, bìa có nhọn, khía tai bèo, viền mép có vân trắng; gân hình chân vịt, cuống phụ cm; cuống có đáy thành bẹ, ôm thân Chùm tụ tán mang tán to – 1,5 cm 151 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đơ Số 07 - 2019 Hình Hình thái Đinh lăng trịn Kết hình thái Đinh lăng trịn tương tự mơ tả tài liệu tham khảo (Phạm Hoàng Hộ, 2003) Mẫu tươi Đinh lăng chiết xuất, phân tách ADN, giải trình tự gen, so sánh với mẫu trình tự gen cơng bố lồi thuộc chi Polyscias cho kết sau: * Tách chiết ADN tổng số thực phản ứng nhân gen PCR ADN tổng số sau tách điện di gel agarose 1% cho vạch ADN rõ, băng điện di sạch, không lẫn ARN ADN tổng số sau thực phản ứng nhân gen với đoạn rbcL điện di so sánh với thang ladder chuẩn 1000 bp, cho thấy kích thước đoạn trình tự thu vào khoảng 600 bp Vạch sản phẩm băng điện di đậm, rõ nét, nguyên vẹn không bị đứt gãy nên đủ điều kiện để tiếp tục tinh để thực phản ứng giải trình tự 152 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đơ Hình Điện di AND tổng số Số 07 - 2019 Hình Điện di sản phẩm PCR * Trình tự đoạn gen rbcL Trình tự ADN sau giải trình tự thu gồm 545 bp (Hình 4) có 542 bp rõ, đưa vào để so sánh với trình tự cơng bố, tỷ lệ G-C 42 %, tỷ lệ A-T 58 % Công cụ NCBI/Blast sử dụng để so sánh với trình tự cơng bố ngân hàng gen giới (mã hiệu ngân hàng gen: KX783977.1) cho thấy trình tự gen thu tương đồng với trình tự lồi Polyscias balfouriana (Andre) L.H.Bailey cơng bố với số nucleotid tương đồng 541/542 (tương ứng tỷ lệ tương đồng 99%) 153 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đơ Số 07 - 2019 Hình So sánh trình tự đoạn gen rbcL mẫu nghiên cứu với trình tự lồi cơng bố giới Trong đó: Query trình tự mẫu nghiên cứu Sbjct trình tự lồi P balfouriana (Andre) L.H.Bailey cơng bố ngân hàng gen giới (mã hiệu ngân hàng gen: KX783977.1) (Elansary, et al, 2017) Kết giải trình tự gen so sánh trình tự gen Đinh lăng trịn với trình tự gen lồi P balfouriana (Andre) L.H Bailey sở tin cậy để khẳng định tên khoa học Đinh lăng tròn là: Polyscias balfouriana (Andre)L.H Bailey Họ Nhân sâm (Araliaceae) THẢO LUẬN Do loài thuộc chi Polyscias đặt tên khác trước không công bố rộng rãi nên lồi lại có nhiều tên khác Mặt khác vào đặc điểm thực vật để phân loại gặp số trở ngại số lồi có hình thái giống nhau, khó khăn phân biệt hai lồi khác nhau, đặc 154 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 07 - 2019 điểm loài khác khơng nhiều; trường hợp khác lồi sống điều kiện khác nhau, có thay đổi hình thái khẳng định định danh Đinh lăng trịn Phạm Hồng Hộ (2003) số tác giả trước Để góp phần hỗ trợ xác định tên khoa học loài đinh lăng trịn, ngồi phương pháp phân tích đặc điểm hình thái thực vật, chúng tơi sử dụng ADN mã vạch, tiến hành giám định ADN mẫu Đây phương pháp tiên tiến sử dụng thành cơng định danh lồi giới Đối với Đinh lăng tròn, lần phương pháp định danh qua giám định ADN sử dụng để giám định tên khoa học Sau chiết xuất, phân tách ADN giải trình tự gen mẫu Đinh lăng, cho kết trình tự gen So sánh trình tự đoạn gen RBCL với trình tự gen cơng bố loài P balfouriana (Andre) L.H.Bailey (Elansary et al, 2017) cho thấy có trùng khớp đến 99 % Do đó, nghiên cứu xác định tên lồi Polyscias ADN, phương pháp có độ tin cậy tính chọn lọc cao Doyle J.J., Doyle J.L., 1990 Isolation of Plant DNA from fresh tissue Focu, 12(6), 13 – 15 KẾT LUẬN Tóm lại, phương pháp ADN mã vạch kết hợp với đặc điểm hình thái cho thấy Đinh lăng tròn (thu thập trồng vườn Dược liệu Trường Đại học Tây Đơ, Thành Phố Cần Thơ) có tên khoa học Polyscias balfouriana (Andre) L.H.Bailey thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae) Kết giúp nhận định xác tên khoa học đối tượng nghiên cứu phương pháp ADN mã vạch Kết TÀI LIỆU THAM KHẢO Elansary H.O., Ashfaq M., Yessoufou K and Hebert P.D.N., 2017 Polyscias balfouriana voucher Hosam00272 ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit (rbcL) gene, partial cds; chloroplast GenBank: KX783977.1 Hall T.A., 1999 BioEdit: a userfriendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT Nucl Acids Symp Ser 41:95-98 Kress W.J, Erickson D.L, 2007 A two-locus global DNA barcode for land plants: the coding rbcLa gene complements the non-coding trnH-psbA spacer region PLoS One, 6:1-10 Levin R.A., Wagner W.L., Hoch P.C., Nepokroeff M, Pires J.C, Zimmer E.A, Sytsma K.J., 2003 Family-level relationships of Onagraceae based on chloroplast rbcLa and ndhF data American Journal of Botany, vol 90:107-115 Nguyễn Thượng Dong, Trần Công Luận Nguyễn Thị Thu Hương, 2007 Sâm Việt Nam số thuốc họ Nhân sâm NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội, tr 293 155 Tạp chí Nghiên cứu khoa học Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Nguyễn Văn Đạt, Trần Thị Phương Anh, 2015 Đặc điểm hình thái chi họ ngũ gia bì Việt Nam Hội nghị khoa học toàn quốc sinh thái tài nguyên sinh vật lần thứ 6, tr 6975 Nguyễn Nghĩa Thìn, 2006 Các phương pháp nghiên cứu thực vật NXB Giáo dục Số 07 - 2019 Phạm Hoàng Hộ, 2003 Cây cỏ Việt Nam, tập NXB Trẻ, Hà Nội Tr 516 – 518 10 Sanger S., Nicklen S., Coulson A.R, 1977 DNA sequencing with chainterminating inhibitors Proc Natl Acad Sci USA, 74 (12): 5463–5467 SCIENTIFIC NAME DETERMINATION OF POLYSCIAS BALFOURIANA (ANDRE) L.H.BAILEY BY USING DNA SEQUENCING Do Van Mai, Thieu Van Duong, Vu Thi Binh and Tran Cong Luan Faculty of Pharmacy and Nursery, Tay Do University (Email: dvmai@tdu.edu.vn) ABSTRACT Relying on plant morphology, it is difficult to classify species and It’s not sufficient scientific basis to identidy the right species which are very similar in morphology In previous documents of medicinal plants, the scientific name of “Dinh lang” has been determined, based on plant morphology, as Polyscias balfouriana (Andre) L.H.Bailey, belongs to the Araliace family The objectives of this study were to analyse the morphological characteristics, sequenced RAPD to determine the scientific name of “Dinh lang la tron” Plant samples were collected from the medicinal garden of Tay Do University The results obtained the genomic sequence of “Dinh lang la tron” plant which was similar to the genetic sequences of P balfouriana (Andre) L.H.Bailey published on data banks to 99% Thus by using method of DNA sequencing, the scientific name of “Dinh lang la tron” have identified as Polyscias balfouriana (Andre) L.H.Bailey, belongs to the Araliace family Our result confirmed the scientific name of “Dinh lang la tron” which was documented as identified by using plant morphology for plant classification Keywords: DNA, Polyscias balfouriana, sequencing RBCL 156 ... Để khẳng định xác tên khoa học Đinh lăng tròn, nghiên cứu thực qua phương pháp giải trình tự gen ADN lồi NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu Mẫu non Đinh lăng tròn trồng vườn... thành công định danh loài giới Đối với Đinh lăng tròn, lần phương pháp định danh qua giám định ADN sử dụng để giám định tên khoa học Sau chiết xuất, phân tách ADN giải trình tự gen mẫu Đinh lăng, ... trình tự lồi P balfouriana (Andre) L.H.Bailey công bố ngân hàng gen giới (mã hiệu ngân hàng gen: KX783977.1) (Elansary, et al, 2017) Kết giải trình tự gen so sánh trình tự gen Đinh lăng trịn với trình