GIÁ TRỊ của PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH tự GEN THẾ hệ mới PHÁT HIỆN LỆCH bội NHIỄM sắc THỂ THAI BẰNG DNA THAI tự DO TRONG máu mẹ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ HOÀNG HẢI YẾN GIÁ TRỊ CỦA PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI PHÁT HIỆN LỆCH BỘI NHIỄM SẮC THỂ THAI BẰNG DNA THAI TỰ DO TRONG MÁU MẸ LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ HOÀNG HẢI YẾN GIÁ TRỊ CỦA PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI PHÁT HIỆN LỆCH BỘI NHIỄM SẮC THỂ THAI BẰNG DNA THAI TỰ DO TRONG MÁU MẸ Chuyên ngành : Hóa sinh Mã số : 62720112 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS.TS TẠ THÀNH VĂN PGS.TS NGUYỄN DUY ÁNH HÀ NỘI - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi Hồng Hải Yến, nghiên cứu sinh khóa 34, Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Hóa sinh Y học, xin cam đoan: Đây luận án thân trực tiếp thực hướng dẫn GS.TS Tạ Thành Văn PGS.TS Nguyễn Duy Ánh Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày 31 tháng 07 năm 2019 Người viết cam đoan Hoàng Hải Yến DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AF Amniotic fluid AFP Alfa feto-protein BoBs BACs-on-Beads BP Base pair cffDNA Cell free fetal DNA CMA Chromosomal microarray-based analysis CSS Chromosome-selective sequencing CV Chrionic villus DNA Deoxyribonucleic acid DTBS Dị tật bẩm sinh FISH Fluorescent in situ hybridization NGS Next generation sequencing NIPS Noninvasive prenatal testing SNPs Single nucleotide polymorphisms NST Nhiễm sắc thể PAPP-A Pregnancy - associated plasma protein A PGD Preimplantation Genetic Diagnosis PN BoBs Prenatal-BoBs uE3 Unconjugated Estriol - Estriol không liên hợp βhCG Beta human chronic gonadotropin MPS Massively parallel sequencing MPSS Massively parallel shotgun sequencing NCVs Normalized chromosome values MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN .3 1.1 Bất thường nhiễm sắc thể thai nhi 1.1.1 Tần suất xuất 1.1.2 Hậu bất thường nhiễm sắc thể 1.1.3 Các dạng lệch bội nhiễm thể thường gặp sàng lọc chẩn đoán trước sinh 1.2 Tổng quan số phương pháp sàng lọc, chẩn đoán trước sinh phát bất thường NST 11 1.2.1 Các phương chẩn đoán trước sinh 11 1.2.2 Các phương pháp sàng lọc truyền thống .15 1.3 Tổng quan DNA thai tự máu mẹ 20 1.3.1 Lịch sử phát DNA tự máu mẹ 20 1.3.2 Nguồn gốc DNA huyết tương 21 1.3.3 Nguồn gốc đặc điểm DNA thai tự (cffDNA) huyết tương mẹ 22 1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến nồng độ cffDNA 23 1.3.5 Các phương pháp tiếp cận tin sinh học ước tính nồng độ cffDNA 23 1.3.6 Ứng dụng lâm sàng cffDNA huyết tương mẹ .25 1.4 Giải trình tự gen hệ (Next-Generation Sequencing- NGS) xét nghiệm NIPS 28 1.4.1 Nguyên lý 28 1.4.2 Một số hệ thống máy giải trình tự hệ phổ biến giới 29 1.4.3 Ứng dụng phương pháp giải trình tự hệ sàng lọc trước sinh không xâm lấn .30 1.4.4 Nghiên cứu NIPS phương pháp NGS phân tích cffDNA Việt Nam 44 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45 2.1 Đối tượng nghiên cứu 45 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn 45 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 45 2.2 Phương pháp nghiên cứu .46 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu .46 2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu .46 2.2.3 Quy trình nghiên cứu .47 2.3 Phương tiện nghiên cứu 50 2.3.1 Máy móc dụng cụ .50 2.3.2 Hóa chất 50 2.4 Các biến số nghiên cứu .51 2.4.1 Biến số thai phụ .51 2.4.2 Kết xét nghiệm sàng lọc truyền thống: siêu âm hình thái, combined test, triple test .52 2.4.3 Kêt giải trình tự 52 2.4.4 Kết xét nghiệm chẩn đoán: karyotype 52 2.4.5 Theo dõi lâm sàng thai theo dõi sau sinh: sau sinh tháng 52 2.5 Các tiêu chuẩn đánh giá nghiên cứu 53 2.5.1 Đánh giá chất lượng giải trình tự 53 2.5.2 Kết phân tích NST từ tế bào ối .55 2.5.3 Theo dõi sau sinh 55 2.6 Sơ đồ nghiên cứu (Sơ đồ 2.1): 56 2.7 Địa điểm thời gian nghiên cứu .57 2.8 Phương pháp tính tốn xử lý số liệu .57 2.9 Đạo đức nghiên cứu đề tài 58 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 59 3.1 Một số đặc điểm đối tượng nghiên cứu 59 3.1.1 Phân bố tuổi thai phụ nghiên cứu .59 3.1.2 Phân bố nghề nghiệp địa dư .60 3.1.3 Phân bố theo địa dư .60 3.1.4 Đặc điểm cân nặng, số khối lượng thể thai phụ 61 3.1.5 Tuổi thai thai phụ thời điểm làm xét nghiệm NIPS 61 3.1.6 Đặc điểm sàng lọc trước sinh truyền thống thai phụ 62 3.2 Ứng dụng phương pháp giải trình tự gen hệ phát lệch bội NST 21, 18, 13, X, Y DNA thai tự (cffDNA) huyết tương mẹ 65 3.2.1 Kết tách chiết DNA tự (cfDNA) chuẩn bị thư viện 65 3.2.2 Kết chất lượng giải trình tự 67 3.2.3 Kết giải trình tự 69 3.3 Xác định tỷ lệ lệch bội NST 21, 18, 13, X, Y phương pháp giải trình tự gen hệ phân tích DNA thai tự máu mẹ .74 3.3.1 Tỷ lệ thai phụ dương tính với lệch bội NST 74 3.3.2 Kết NIPS dương tính liên quan đến yếu tố nguy .75 3.4 Đánh giá giá trị phương pháp giải trình tự gen hệ phát lệch bội NST thai DNA thai tự huyết tương mẹ 77 3.4.1 Kết phân tích NST từ tế bào ni cấy ối mẫu có NIPS dương tính 77 3.4.2 Kết chẩn đốn lệch bội NST 80 3.4.3 Các trường hợp kết NIPS không phù hợp với kết chẩn đốn xác định ni cấy dịch ối 82 3.4.4 Giá trị cffDNA xét nghiệm NIPS 83 3.4.5 Giá trị NIPS sàng lọc lệch bội 89 Chương 4: BÀN LUẬN 91 4.1 Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu 91 4.2 Ứng dụng phương pháp giải trình tự gen hệ phát lệch bội NST 21, 18, 13 NST giới tính DNA thai tự huyết tương mẹ .95 4.2.1 Kết tách huyết tương, tách chiết cffDNA chuẩn bị thư viện 95 4.2.2 Kết chất lượng giải trình tự 99 4.2.3 Kết giải trình tự chung 103 4.3 Xác định tỷ lệ lệch bội NST 21, 18, 13, X, Y phương pháp giải trình tự gen hệ sử dụng DNA thai tự máu mẹ 111 4.3.1 Tỷ lệ lệch bội NST thai 111 4.3.2 Kết NIPS dương tính lệch bội NST 21, 18, 13, giới tính liên quan đến yếu tố nguy 112 4.4 Đánh giá giá trị phương pháp giải trình tự gen hệ phát lệch bội NST thai DNA thai tự huyết tương mẹ 116 4.4.1 Chẩn đoán thai lệch bội NST phương pháp di truyền tế bào phân tích NST mẫu có kết NIPS dương tính 117 4.4.2.Kết chẩn đốn trường hợp NIPS dương tính trường hợp đặc biệt 120 4.4.3 Giá trị cffDNA xét nghiệm NIPS 125 4.4.4 Giá trị NIPS sàng lọc lệch bội NST 21, 18, 13 NST giới tính.134 KẾT LUẬN 136 KIẾN NGHỊ 137 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Tỷ lệ phát tỷ lệ dương tính giả trisomy 21 15 Bảng 1.2 Các thử nghiệm lâm sàng NIPS 37 Bảng 1.3 Kết phát trisomy 21 theo tuổi mẹ nguy cơ* 39 Bảng 1.4 Kết xét nghiệm phát trisomy 18, 13* 39 Bảng 1.5 Kết sàng lọc trisomy 21, 18, 13 quần thể dân số chung nguy cao 42 Bảng 2.1 Giá trị z-score lệch bội NST 13, 18, 21 54 Bảng 2.2 Giá trị z-score lệch bội NST giới tính nam 54 Bảng 2.3 Giá trị z-score lệch bội NST giới tính nữ .54 Bảng 2.4 Đánh giá kết xét nghiệm NIPS 57 Bảng 3.1 Đặc điểm tuổi thai phụ nghiên cứu 59 Bảng 3.2 Đặc điểm cân nặng, số khối lượng thể thai phụ 61 Bảng 3.3 Tuổi thai thời điểm làm xét nghiệm NIPS 61 Bảng 3.4 Đặc điểm sàng lọc trước sinh truyền thống thai phụ 62 Bảng 3.5 Kết siêu âm bất thường thai phụ 62 Bảng 3.6 Đặc điểm độ dày da gáy thai nhi 63 Bảng 3.7 Kết sàng lọc huyết truyền thống .64 Bảng 3.8 Kết sàng lọc huyết nguy cao trisomy 21 64 Bảng 3.9 Kết sàng lọc huyết nguy cao trisomy 18 65 Bảng 3.10 Nồng độ DNA tự thư viện 65 Bảng 3.11 Kết chất lượng thư viện ISP 67 Bảng 3.12 Chất lượng gióng cột đoạn đọc với trình tự hg19 68 Bảng 3.13 Tỷ lệ cffDNA