Nghiên cứu giá trị của phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới phát hiện lệch bội nhiễm sắc thể thai bằng DNA thai tự do trong máu mẹ (FULL TEXT)

ĐẶT VẤN ĐỀ Bất thường nhiễm sắc thể (NST) thai xảy ra khoảng 1/150 trẻ sinh sống, là một trong số những nguyên nhân hàng đầu gây nên tử vong và bệnh tật cho trẻ sơ sinh trên toàn thế giới [1],[2]. Chiếm khoảng 83,0% của những bất thường này là do trisomy 21, 18, 13 và lệch bội NST giới tính gây ra hội chứng Down, Edwards, Patau, Turner... [3]. Các phương pháp sàng lọc trước sinh truyền thống phát hiện lệch bội NST bao gồm siêu âm hình thái và phân tích huyết thanh thai phụ trong thai kỳ 1 và thai kỳ 2. Tỷ lệ phát hiện trisomy 21 với ngưỡng lớn hơn 1/250 dao động từ 50% đến 95% với tỷ lệ dương tính giả khoảng 5,0% tùy thuộc vào phương pháp sàng lọc được sử dụng [4]. Để chẩn đoán xác định thì các thai phụ có nguy cơ cao bất thường NST sẽ được thực hiện các thủ thuật xâm lấn như lấy mẫu gai rau hoặc hút dịch ối để khảo sát số lượng NST bằng các kỹ thuật Karyotype, QF-PCR, FISH, Prenatal BoBs, MLPA. Các thủ thuật xâm lấn này có thể gây mất thai với tỷ lệ là 0,11 - 0,22% [5]. Do đó, rất cần có những phương pháp sàng lọc với tỷ lệ dương tính giả thấp đồng thời tỷ lệ phát hiện cao hơn, thai phụ không cần chịu thủ thuật xâm lấn, tránh được nguy cơ ảnh hưởng đến thai phụ và thai nhi [6]. Gần đây, xét nghiệm phân tích DNA thai tự do (cell free fetal DNA - cffDNA) sàng lọc lệch bội NST sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (Next Generation Sequencing - NGS) đã được chứng minh là phương pháp sàng lọc trước sinh hiệu quả so với các phương pháp sàng lọc trước sinh truyền thống với tỷ lệ phát hiện trisomy 21 là 99,2% và tỷ lệ dương tính giả là 0,09%, tỷ lệ phát hiện trisomy 18 là 96,3% và tỷ lệ dương tính giả là 0,13%, tỷ lệ phát hiện trisomy 13 là 91,0% và tỷ lệ dương tính giả là 0,13% [7],[8],[9]. Với mong muốn tìm hiểu rõ hơn về giá trị của phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới, giúp thầy thuốc lâm sàng có thêm một phương pháp sàng lọc lệch bội NST thai, đề tài “Nghiên cứu giá trị của phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới phát hiện lệch bội nhiễm sắc thể thai bằng DNA thai tự do trong máu mẹ” được tiến hành với 2 mục tiêu: 1. Ứng dụng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới phát hiện lệch bội NST 21, 18, 13, X, Y bằng DNA thai tự do trong máu mẹ. 2. Xác định tỷ lệ lệch bội NST 21, 18, 13, X, Y và bước đầu đánh giá giá trị của phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới sử dụng DNA thai tự do trong máu mẹ.

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ ‘ HOÀNG HẢI YẾN NGHIÊN CỨU GIÁ TRỊ CỦA PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI PHÁT HIỆN LỆCH BỘI NHIỄM SẮC THỂ THAI BẰNG DNA THAI TỰ DO TRONG MÁU MẸ LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2020 MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC BIỂU ĐỒ DANH MỤC SƠ ĐỒ DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Bất thường nhiễm sắc thể (NST) thai xảy khoảng 1/150 trẻ sinh sống, số nguyên nhân hàng đầu gây nên tử vong bệnh tật cho trẻ sơ sinh toàn giới [1],[2] Chiếm khoảng 83,0% bất thường trisomy 21, 18, 13 lệch bội NST giới tính gây hội chứng Down, Edwards, Patau, Turner [3] Các phương pháp sàng lọc trước sinh truyền thống phát lệch bội NST bao gồm siêu âm hình thái phân tích huyết thai phụ thai kỳ thai kỳ Tỷ lệ phát trisomy 21 với ngưỡng lớn 1/250 dao động từ 50% đến 95% với tỷ lệ dương tính giả khoảng 5,0% tùy thuộc vào phương pháp sàng lọc sử dụng [4] Để chẩn đốn xác định thai phụ có nguy cao bất thường NST thực thủ thuật xâm lấn lấy mẫu gai rau hút dịch ối để khảo sát số lượng NST kỹ thuật Karyotype, QF-PCR, FISH, Prenatal BoBs, MLPA Các thủ thuật xâm lấn gây thai với tỷ lệ 0,11 - 0,22% [5] Do đó, cần có phương pháp sàng lọc với tỷ lệ dương tính giả thấp đồng thời tỷ lệ phát cao hơn, thai phụ không cần chịu thủ thuật xâm lấn, tránh nguy ảnh hưởng đến thai phụ thai nhi [6] Gần đây, xét nghiệm phân tích DNA thai tự (cell free fetal DNA cffDNA) sàng lọc lệch bội NST sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen hệ (Next Generation Sequencing - NGS) chứng minh phương pháp sàng lọc trước sinh hiệu so với phương pháp sàng lọc trước sinh truyền thống với tỷ lệ phát trisomy 21 99,2% tỷ lệ dương tính giả 0,09%, tỷ lệ phát trisomy 18 96,3% tỷ lệ dương tính giả 0,13%, tỷ lệ phát trisomy 13 91,0% tỷ lệ dương tính giả 0,13% [7],[8],[9] Với mong muốn tìm hiểu rõ giá trị phương pháp giải trình tự gen hệ mới, giúp thầy thuốc lâm sàng có thêm phương pháp sàng lọc lệch bội NST thai, đề tài “Nghiên cứu giá trị phương pháp giải trình tự gen hệ phát lệch bội nhiễm sắc thể thai DNA thai tự máu mẹ” tiến hành với mục tiêu: Ứng dụng phương pháp giải trình tự gen hệ phát lệch bội NST 21, 18, 13, X, Y DNA thai tự máu mẹ Xác định tỷ lệ lệch bội NST 21, 18, 13, X, Y bước đầu đánh giá giá trị phương pháp giải trình tự gen hệ sử dụng DNA thai tự máu mẹ Chương TỔNG QUAN 1.1 Bất thường nhiễm sắc thể thai 1.1.1 Tần suất xuất Các nhiễm sắc thể (NST) bị bất thường số lượng cấu trúc Các biến đổi thấy sinh mắc phải q trình ác tính hố tế bào khối u kết biến cố xảy phân bào giảm nhiễm phân bào nguyên nhiễm Sự bất thường xảy nhiều NST Bất thường NST phổ biến trisomy 21, 18, 13 lệch bội NST giới tính [10] Nghiên cứu 34.910 trẻ sinh sống đến 13 tuổi Đan Mạch cho thấy bất thường NST chiếm khoảng 15,0% dị tật bẩm sinh chẩn đoán trước tuổi 25,0% tử vong chu sinh dị tật bẩm sinh, tần suất bất thường NST 1/118 hay 8,45/10.000 trẻ sinh sống [11] Nghiên cứu cộng đồng nước Châu Âu năm 2004 cho thấy khoảng 1/4 trường hợp tử vong sớm trẻ sơ sinh dị tật bẩm sinh, 18,0% bất thường NST Trong nghiên cứu 10.323 trường hợp bất thường NST bao gồm trường hợp sinh sống trước tuổi, thai chết tuổi thai 20 tuần đình thai nghén dị tật bẩm sinh từ năm 2000 2006 Kết phát 7.335 trường hợp trisomy 21, 18 13, trisomy 21 chiếm tỷ lệ 53,0% với tần suất xuất 23/10.000, trisomy 18 chiếm tỷ lệ 13,0% với tần suất 5,9/10.000, trisomy 13 chiếm tỷ lệ 5% với tần suất 2,3/10.000, trisomy NST giới tính 473 ca chiếm tỷ lệ 5% với tần suất 2/10.000 778 ca monosomy X chiếm tỷ lệ 8,0% với tần suất 3,3/10.000 Chỉ có 1.737 ca bất thường NST gặp chiếm tỷ lệ 17,0% với tần suất 7,4/10.000 bao gồm thể tam bội, trisomy NST khác, chuyển đoạn NST không cân bằng, đoạn nhân đoạn (Hình 1.1) [3] Hình 1.1 Tỉ lệ bất thường NST chẩn đoán trẻ < tuổi (Nguồn: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3330224) Tại Trung Quốc, năm có khoảng 16 triệu trẻ sinh, dị tật bẩm sinh chiếm khoảng 4,0 - 6,0% Bất thường NST chiếm tỷ lệ 1/160 trẻ sinh sống Mỹ 1/60 Trung Quốc [10],[12] Thống kê Tổng cục dân số cho thấy, năm Việt Nam có khoảng gần 1,5 triệu trẻ em sinh ra, tỷ lệ dị tật bẩm sinh chiếm khoảng 1,5 - 2,0% trẻ sinh sống Đáng lưu ý năm có khoảng 1.400 - 1.800 trẻ mắc trisomy 21, khoảng 200 - 250 trẻ mắc trisomy 18 Theo báo cáo Phùng Như Toàn (2003) từ kết nuôi cấy từ dịch ối phát 24/213 ca bất thường NST chiếm 11,2% [13] Hoàng Thị Ngọc Lan cộng (2004) phát 7/40 ca bất thường số lượng NST chiếm tỷ lệ 17,5% [14], Trần Danh Cường (2005) phát 11/95 ca bất thường NST chiếm tỷ lệ 11,6%, trisomy 21 chiếm 50,79% [15] 1.1.2 Hậu bất thường nhiễm sắc thể Bất thường NST ảnh hưởng đến 7,5% tất trường hợp thụ thai, chiếm 50,0% trường hợp sảy thai tự nhiên ba tháng đầu chết trước sinh [16] Tần suất bất thường NST thường gặp từ 1/150 - 1/200 trẻ sinh sống Khoảng 3,0 - 4,0% tất ca sinh sống có liên quan đến đa dị tật bẩm sinh, chậm phát triển tâm thần rối loạn di truyền, tỷ lệ tăng gấp trẻ - tuổi, với rối loạn di truyền xuất chậm chẩn đoán muộn Điều tra quần thể trưởng thành khỏe mạnh cho thấy tần số bất thường NST thấp [16] Do đó, việc phát triển phương pháp sàng lọc, chẩn đoán trước sinh thực cần thiết 1.1.3 Các bất thường NST thai thường gặp sàng lọc chẩn đoán trước sinh 1.1.3.1 Hội chứng Down hay NST 21 (trisomy 21) Hội chứng Down (47,XX,+21; 47,XY,+21) bất thường bẩm sinh thường gặp bất thường NST, chiếm khoảng 1/700 trẻ sinh sống, tỷ lệ bệnh theo giới nam/2 nữ Theo Zoltán Papp 95,0% hội chứng Down đột biến số lượng NST 21 dạng thuần; 4,0% chuyển đoạn; 1,0% thể khảm [17] Hình 1.2 Trẻ mắc hội chứng Down (Trisomy 21) (Nguồn: Khoa sơ sinh, Bệnh viện Phụ sản Hà Nội) Hội chứng Down có tỷ lệ tử vong cao, khoảng 20,0% trẻ mắc hội chứng Down sinh chết trước tuổi, 44,0% số trẻ lại sống tới tuổi 60 Trẻ mắc hội chứng Down với dấu hiệu điển hình: trán thấp, mắt xếch, gáy rộng dẹt, sống mũi tẹt, mơi trề, nếp ngang đơn độc lòng bàn tay, đốm trắng nhỏ mống mắt , dị tật tim chiếm 46,0%, bất thường ống tiêu hoá chiếm 7,0%, 10,0% mắc động kinh tuổi 50 Người mắc hội chứng Down kèm theo chậm phát triển trí tuệ cách trầm trọng ảnh hưởng lớn đến khả hồ nhập cộng đồng Các gia đình có người mắc hội chứng Down có gánh nặng lớn tâm lý tài chính, gánh nặng cho phục vụ chăm sóc y tế xã hội [17] 1.1.3.2 Hội chứng Edwards hay NST 18 (trisomy 18) 10 Hội chứng Edwards (47,XX,+18; 47,XY,+18) lần nhóm nhà di truyền học người Anh đứng đầu Edwards mô tả đầy đủ năm 1960 [18] Bệnh xuất với tần suất 1:5.000 trẻ sinh sống Đây hội chứng bất thường NST đứng thứ sau hội chứng Down Hình 1.3 Trẻ mắc hội chứng Edwards (Nguồn: Khoa sơ sinh, Bệnh viện Phụ sản Hà Nội) Trẻ mắc hội chứng Edwards có mặt bất thường (đầu nhỏ, khe mắt hẹp ngắn, hàm lỗ miệng bé, cằm nhỏ, vành tai bị biến dạng, tai vị trí thấp), tật chi xếp lộn xộn xương bàn, bất thường khớp ngón Ι (bàn tay co quắp), bất thường bàn chân (lòng bàn chân dày) khe hở mơi [18] Do có nhiều dị tật nhiều quan, nên trẻ mắc hội chứng Edwards thường tử vong sớm Khoảng 60,0% trường hợp tử vong trước tháng, 30,0% tử vong trước tháng, 1/10 trẻ mắc bệnh sống đến tuổi [18] 1.1.3.3 Hội chứng Patau hay NST 13 (trisomy 13) Hội chứng Patau (47,XX,+13; 47,XY,+13) lần Patau cộng mô tả năm 1960 Bệnh gặp với tần suất 1:5.000 đến 1:100.000 trẻ sống Tỷ lệ bệnh gặp nữ nhiều nam Các trẻ mắc hội chứng Patau có trọng lượng sinh thấp mức trung bình khoảng 900g thường sinh thiếu tháng Các dấu hiệu lâm sàng bên hội chứng điển hình thường đặc trưng Thành phần Thể tích Platinum HiFi 48µL Library Amplification Primers 2,5µL DNA tự 9,5µL Tổng 60µL - Đưa vào máy PCR chạy theo chu trình nhiệt: 72℃/20 phút; 95℃/5 phút; 10 chu kỳ 95℃/15 giây, 62℃/15 giây, 70℃/1 phút; sau 70℃/5 phút giữ 4℃ - Tinh sản phẩm 108µL AMPure - Đo nồng độ DNA thư viện tự sau tinh Bảo quản DNA tự thư viện nhiệt độ từ -30 oC đến -10oC 2.4.4 Kiểm tra chất lượng DNA thư viện Thực theo quy trình máy LabChip GX Touch 24 cho phép kiểm tra kích thước thư viện (DNA tự gắn barcode adaptor) nồng độ thư viện (có thể phát nồng độ thấp) trước tiến hành bước khuếch đại làm giàu hệ thống Ion Chef Các bước tiến hành theo quy trình nhà sản xuất Kết điện di phân tích phần mềm Labchip Kích thước DNA tự huyết tương phân bố khoảng 140180bp, kích thước đoạn adaptor P1 barcode khoảng 80bp, kích thước thư viện có đỉnh đơn 220 - 260bp nồng độ thường khoảng 1.000 - 10.000pM Thư viện gắn mã vạch pha loãng xuống 55pM Mỗi chip giải trình tự tối đa 14 mẫu/lần, tổ hợp hỗn hợp thư viện đồng 14 mẫu để có hỗn hợp thư viện ≥ 25µL 2.5 Chuẩn bị mẫu giải trình tự giải trình tự 2.5.1 Chuẩn bị mẫu giải trình tự (Ion Chef) Mẫu DNA thư viện tự sau pha loãng đạt nồng độ 55pM làm giàu lần hệ thống tự động Ion Chef sử dụng kít Ion PI Hi-Q Chef Mẫu DNA thư viện tự làm giàu nạp tự động vào Ion PI Chip V3 Các bước thao tác tự động hệ thống Ion Chef Phản ứng emulsion PCR (ePCR) có hạt Ion Sphere Particle (ISP) Trong điều kiện tối ưu, giọt dầu môi trường ePCR chứa hạt ISP đoạn DNA tự thư viện thành phần phản ứng PCR Hạt ISP sau làm giàu tinh hạt từ đặc hiệu với Biotin có gắn đầu gắn barcode Bước nạp dung dịch chứa hạt ISP làm giàu vào Ion PI Chip V3 Các bước chuẩn bị máy Ion chef thực sau: - 40 phút trước chạy, mở hóa chất Ion PI Hi-Q Chef để ấm tới nhiệt độ phòng - Tạo lịch trình chạy trình duyệt web Ion Torrent - Bổ sung 25µL thư viện vào ống mẫu giá hóa chất Hi-Q Chef Cartridge - Lắp đồ nhựa tiêu hao vào máy Ion Chef - Đưa Ion PI Chip V3 vào máy - Đảm bảo thông tin truy cập Ion Chef xác - Chọn thời gian để quy trình hồn thành bắt đầu chu trình chạy 2.5.2 Giải trình tự máy Proton - Trước khởi động thiết bị 40 phút, đưa hóa chất sử dụng tới nhiệt độ phòng Đảm bảo máy có sẵn chip qua sử dụng để khởi động máy Khởi động máy - Rửa máy dung dịch Chlorite nước Khởi động máy Proton với NaOH Wash Khi nồng độ pH Wash đạt, chuẩn bị ống dung dịch dNTPs (Deoxyribonucleoside triphosphates) Khởi động chu trình rửa đường chất lỏng với chip sử dụng - Khi bước hoàn thành, đưa chip từ Ion Chef hoàn thành vào máy Ion Torrent Khi hệ thống xác nhận chip thơng tin quy trình chạy, tiến hành chu trình giải trình tự Bảo quản chip lại hộp kín oC 20 phút trước thực chu trình chạy thứ 2, để chip nhiệt độ phòng - Dữ liệu giải trình tự chuyển trực tiếp vào thư mục DNA máy chủ hệ thống Ion Torrent (Ion Torrent Server) Dữ liệu phân tích tự động máy chủ - 12 2.5.3 Phân tích kết giải trình tự Sau trình giải trình tự, liệu chuyển sang hệ thống Ion Torrent Server Dữ liệu thơ ban đầu gồm đoạn đọc có kích thước khác Dữ liệu mẫu nhận biết thơng qua trình tự barcode Tiếp theo, đoạn đọc cắt (trimming) dần từ đầu 3’ (nhằm loại bỏ trình tự barcode), sau lọc (filtering) giữ lại đoạn đọc có kích thước < 167 bp Tồn trình tự đoạn đọc lại gióng hàng so sánh với trình tự chuẩn gen người (hg19) sử dụng TMAP (Torrent Mapping Alignment Program) Tiếp theo, đoạn đọc giữ lại đoạn đọc xuất vị trí gen gọi unique reads (URs) Các đoạn đọc không tương đồng tương đồng nhiều vị trí gen lọc bỏ Phụ lục QUY TRÌNH LẤY MẪU ỐI Thực theo QTKT-CĐTS, Bệnh viện Phụ sản Hà Nội CHUẨN BỊ Người thực - Bác sỹ chuyên khoa điều dưỡng (y tá) Phương tiện - Máy siêu âm với đầu dò chuyên dụng - Dung dịch sát khuẩn da (cồn povidine 10%), bơm tiêm 5mL, dây nối có khóa chạc, bơng, băng dính phẫu thuật - Găng tay, áo, mũ, trang phẫu thuật - Bộ dụng cụ can thiệp vô trùng: kẹp, cốc kim loại, khay đậu, xe đẩy có mặt bàn đựng dụng cụ - Kim chọc hút chuyên dụng (BBrawn G27) Người bệnh - Người bệnh giải thích kỹ thủ thuật để phối hợp với thầy thuốc - Người bệnh khám tiền mê trước thực thủ thuật - Hướng dẫn tiểu không để bàng quang căng - Cho người bệnh nằm, sát trùng da, sau phủ khăn phủ vơ khuẩn có lỗ Phiếu xét nghiệm - Hồ sơ bệnh án điều trị nội trú - Có biên hội chẩn định thực thủ thuật thông qua CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH - Giải thích cho người bệnh - Xem xét định, chống định - Tiến hành phòng thủ thuật: lần kiểm tra thơng tin người bệnh: đối khớp bệnh nhân nằm giường với hồ sơ bệnh án thông tin ống lấy mẫu - Thủ thuật viên rửa tay, đeo trang, đeo găng, áo phẫu thuật vô khuẩn - Y tá (điều dưỡng) sát khuẩn rộng vị trí chọc kim - Bác sĩ xuyên kim vào buồng ối hướng dẫn siêu âm - Y tá (điều dưỡng) nối dây nối có khóa chạc với đốc kim dùng bơm tiêm rút khoảng 10mL dịch ối Mẫu dịch bảo quản chuyển đến phòng xét nghiệm - Kết thúc thủ thuật, băng ép nhẹ vùng chọc - Người bệnh theo dõi phòng lưu - Phụ lục QUY TRÌNH NI CẤY DỊCH ỐI LÀM NST ĐỒ Thực theo QTKT-DTTB-02, Bệnh viện Phụ sản Hà Nội Nuôi cấy tế bào ối: - 10mL dịch ối vào ống Falcon vơ trùng (quy trình lấy mẫu ối) - Ly tâm 800vòng/phút x 10 phút - Loại bỏ dịch nổi, giữ lại phần lắng cặn khoảng 0,5mL có chứa tế bào ối - Bổ sung 4mL dung dịch Amniomax vào ống, trộn đều, chuyển vào chai nuôi cấy - Nuôi cấy tế bào tủ ấm 37oC với 5% CO2 vòng 10 – 15 ngày Thu hoạch tế bào ối Sau nuôi cấy 10 – 15 ngày, kiểm tra kính hiển vi soi ngược thấy hình ảnh nhiều tế bào phân chia: - Dừng trình phân bào kỳ 0,1mL Colcemid Để tủ ấm 37o C với 5% CO2 vòng - Làm bong tế bào khỏi thành bình ni cấy 3mL Trypsin 0,25% để tủ ấm phút - Ly tâm 1800vòng/phút x 10 phút loại bỏ dịch nổi, lấy 0,5mL phần lắng cặn chứa tế bào - Sốc nhược trương phá vỡ màng tế bào dung dịch KCl 0,75M Lúc NST bung khỏi màng tế bào, ly tâm lấy phần lắng cặn - Cố định làm mẫu dung dịch Carnoy (Acid acetic:Methanol = 1:3) lần - Ly tâm 1800 vòng/phút x 10 phút, lấy khoảng 0,5 - 1mL phần lắng cặn có chứa cụm NST nhân tế bào - Nhỏ dịch thu lên lam kính - Nhuộm tiêu theo phương pháp nhuộm băng G Nhuộm tiêu Các tế bào ối sau thu hoạch nhuộm phương pháp nhuộm băng G để đánh giá bất thường số lượng cấu trúc NST Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất: Dụng cụ: cốc thủy tinh loại 100mL để đựng hóa chất thuốc nhuộm cốc mỏ thủy tinh loại 500mL đựng nước rửa tiêu Hóa chất: Dung dịch Trypsin 0,01% (0,01g: 100mL nước muối 0,9%) Các dung dịch đệm: KH2PO4 9,1g + nước cất vừa đủ 1000mL Na2HPO4 11,9g + nước cất vừa đủ 1000mL Dung dịch Giemsa 5%: Dung dịch KH2PO4 (đã pha trên): 47,5 mL Dung dịch Na2HPO4 (đã pha trên): 47,5 mL Dung dịch Giemsa: mL Các bước tiến hành (thực điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm) Nhúng tiêu qua dung dịch NaCl 9‰ (100mL) khoảng - giây Đặt tiêu vào cốc chứa dung dịch Trypsin (100mL) pha khoảng - 10 phút Rửa tiêu lặp lại lần cốc đựng dung dịch NaCl 9‰ Tiêu nhuộm thuốc nhuộm Giemsa 5% khoảng 10 - 15 phút Tất tiêu nhuộm xong rửa cách nhúng qua cốc nước rửa vòi nước chảy nhẹ để loại bỏ cặn thuốc nhuộm thừa Để tiêu khô tự nhiên nhiệt độ phòng thí nghiệm * Đánh giá - Phân tích kính hiển vi với độ phóng đại x 1000 lần có chức chụp ảnh kết nối với hệ thống máy tính có phần mềm phân tích NST - Các cụm NST đủ tiêu chuẩn phân tích cụm có NST phân tán tốt, khơng chồng lên nhau, bào tương, kích thước NST khơng dài không ngắn quá, băng rõ - Các cụm NST phân tích số lượng cấu trúc: + Về số lượng: cụm 45, 46 hay 47 NST + Về cấu trúc NST: bình thường đột biến (chuyển đoạn, nhân đoạn, đoạn ) - Mỗi mẫu phân tích 30 cụm NST kỳ giữa, trường hợp khảm phân tích 100 cụm NST Phụ lục PHIẾU THÔNG TIN BỆNH NHÂN I II Thai phụ Mã số: Họ tên: Năm sinh: Địa chỉ: Điện thoại: Nghề nghiệp: Cân nặng (kg): Chiều cao (cm): Tiền sử nội khoa: Tiền sử mang thai bất thường: Loại bất thường: Ngày lấy mẫu: Thai nhi Ngày siêu âm: Tuổi thai: CRL (chiều dài đầu mông): NT (độ mờ da gáy): Kết xét nghiệm: Sàng lọc kết hợp thai kỳ (CFTS): Triple test: III Gia đình - Gia đình bên chồng, bên vợ có bị sảy thai, thai chết lưu thai bất thường không? - Gia đình bên chồng, bên vợ có mắc sinh mắc bệnh tật di truyền không? Đặc biệt bệnh: Down, chậm phát triển trí tuệ… BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ HOÀNG HẢI YẾN NGHIÊN CỨU GIÁ TRỊ CỦA PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI PHÁT HIỆN LỆCH BỘI NHIỄM SẮC THỂ THAI BẰNG DNA THAI TỰ DO TRONG MÁU MẸ Chuyên ngành : Hóa sinh Mã số : 62720112 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Tạ Thành Văn PGS.TS Nguyễn Duy Ánh HÀ NỘI - 2020 LỜI CẢM ƠN Với tất lòng kính trọng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy: GS.TS Tạ Thành Văn - Hiệu trưởng, Trưởng Bộ mơn Hóa sinh Trường Đại học Y Hà Nội, người Thầy ln tận tình bảo, truyền đạt kiến thức ý kiến quý báu, hướng dẫn động viên tơi suốt q trình học tập nghiên cứu để tơi hồn thành luận án PSG.TS Nguyễn Duy Ánh - Giám đốc Bệnh viện Phụ sản Hà Nội, Phó trưởng Bộ mơn Phụ Sản Trường Đại học Y Hà Nội, người Thầy hết lòng hướng dẫn, dạy, động viên, giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập nghiên cứu để tơi hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới: Thầy, Cô Chủ tịch Hội đồng, Thầy, Cơ Hội đồng chấm luận án có nhiều ý kiến q báu giúp tơi hồn thiện Luận án Đảng ủy, Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau đại học, Bộ mơn Hóa sinh Trường Đại học Y Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho tơi để tơi hồn thành luận án Đảng ủy, Ban Giám đốc, Phòng Kế hoạch tổng hợp, Trung tâm Đào tạo, Trung tâm Sàng lọc, Chẩn đoán trước sinh sơ sinh Bệnh viện Phụ Sản Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ q trình nghiên cứu hồn thành luận án Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: Các Thầy, Cô, anh, chị Bộ môn Hóa sinh, Trường Đại học Y Hà Nội ln giúp đỡ, tạo điều kiện cho tơi q trình nghiên cứu Các anh, chị, bạn đồng nghiệp Trung tâm Sàng lọc, Chẩn đoán trước sinh sơ sinh, Bệnh viện Phụ Sản Hà Nội hỗ trợ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp ủng hộ, động viên giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Ban Giám đốc, anh, chị, bạn Công ty CP Thiết bị SISC Việt Nam giúp đỡ, tạo điều kiện hỗ trợ phần kinh phí q trình thực nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tất thai phụ tham gia nghiên cứu để tơi hồn thành luận án tiếp thêm động lực cho để tiếp tục phấn đấu chuyên môn nghiên cứu khoa học Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ tôi, người sinh thành, nuôi dưỡng, yêu thương tạo điều kiện cho suốt trình học tập; chồng hai gái người thân gia đình ln động viên, giúp đỡ bên suốt q trình học tập nghiên cứu để tơi hoàn thành luận án Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2020 Hoàng Hải Yến LỜI CAM ĐOAN Tơi Hồng Hải Yến, nghiên cứu sinh khóa 34, Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Hóa sinh Y học, xin cam đoan: Đây luận án thân trực tiếp thực hướng dẫn Thầy: GS.TS Tạ Thành Văn PGS.TS Nguyễn Duy Ánh Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2020 Người viết cam đoan Hoàng Hải Yến DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh ACMG The American College of Medical Genetics and Genomics ACOG American College of Obstetricians and Gynecologists AF Amniotic fluid AMA Advanced Maternal Age AQ Aligment Quality bp Base Pair cffDNA Cell Free Fetal DNA CFTS Combined First Trimester Screening CNV Copy Number Variation CSS Chromosome Selective Sequencing CPM CV CVS DANSR DN DNA DTBS GC GRCh37 HG ISP ISPD ISUOG MPSS Confined Placental Mosaicism Coefficient of Variation Chorionic Villus Sampling Digital Analysis of Selected Regions Data Noise Deoxyribo Nucleic Acid Guanine Cytosine Genome Reference Consortium human Human Genome Ion Sphere Particle International Society for Prenatal Diagnosis The International Society of Ultrasound in Obstetrics & Gynecology Massively Parallel Shotgun Sequencing Tiếng Việt Hiệp hội gen di truyền y học Hoa Kỳ Hội Thai phụ khoa Hoa Kỳ Dịch ối Tuổi thai phụ cao (≥ 35 tuổi) Chất lượng khớp Cặp base DNA thai tự Sàng lọc kết hợp thai kỳ Biến thể số lượng Giải trình tự nhiễm sắc thể chọn lọc (mục tiêu) Khảm giới hạn rau thai Điểm biến thiên Lấy mẫu gai rau Phân tích số vùng chọn lọ Dữ liệu nhiễu Acid nucleic Dị tật bẩm sinh Hệ gen người Hiệp hội Chẩn đoán trước sinh quốc tế Hội Siêu âm thai phụ khoa Thế giới Giải trình tự đồng thời số lượng NGS NIPS NSGC NST NT PCR PPR SCA SMFM SNPs TFM TMAP URs Next Generation Sequencing Noninvasive Prenatal Screening National Society of Genetic Counselors Chromosome Nuchal Translucency Polymerase Chain Reaction Posteriori Risk Sex Chromosome Aneuploidy Society for Maternal-Fetal Medicine Single Nucleotide Polymorphisms True Fetal Mosaicism Torrent Mapping Alignment Program Unique Reads lớn ngẫu nhiên Giải trình tự gen hệ Sàng lọc trước sinh không xâm lấn Hội quốc gia tư vấn di truyền Nhiễm sắc thể Độ mờ da gáy Phản ứng chuỗi trùng hợp Nguy sau xét nghiệm Lệch bội NST giới tính Hội Y học thai phụ thai Đa hình đơn nucleotide Khảm thai thực Thuật tốn TMAP Trình tự ... bội NST thai, đề tài Nghiên cứu giá trị phương pháp giải trình tự gen hệ phát lệch bội nhiễm sắc thể thai DNA thai tự máu mẹ tiến hành với mục tiêu: Ứng dụng phương pháp giải trình tự gen hệ. .. gen hệ phát lệch bội NST 21, 18, 13, X, Y DNA thai tự máu mẹ Xác định tỷ lệ lệch bội NST 21, 18, 13, X, Y bước đầu đánh giá giá trị phương pháp giải trình tự gen hệ sử dụng DNA thai tự máu mẹ 7... nồng độ cffDNA khả lệch bội NST thai 1.4.1 Nguyên lý giải trình tự hệ Phương pháp giải trình tự gen hệ hoạt động dựa nguyên lý tổng hợp tương tự giải trình tự DNA theo phương pháp Sanger, DNA polymerase