GIÁ TRỊ của PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH tự GEN THẾ hệ mới PHÁT HIỆN LỆCH bội NHIỄM sắc THỂ THAI BẰNG DNA THAI tự DO TRONG máu mẹ

NIPS bằng phương pháp giải trình tự thế hệ mới Next GenerationSequencing - NGS [10], giúp các nhà nghiên cứu có thể sàng lọc sớm thaitrên nhiều phương diện khác nhau, điển hình như: xác

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

HOÀNG HẢI YẾN

GIÁ TRỊ CỦA PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI

PHÁT HIỆN LỆCH BỘI NHIỄM SẮC THỂ THAI BẰNG DNA THAI TỰ DO TRONG MÁU MẸ

TIỂU LUẬN TỔNG QUAN

HÀ NỘI - 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

HOÀNG HẢI YẾN

GIÁ TRỊ CỦA PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI

PHÁT HIỆN LỆCH BỘI NHIỄM SẮC THỂ THAI BẰNG DNA THAI TỰ DO TRONG MÁU MẸ

Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Huy Thịnh

Cho đề tài:

Nghiên cứu giá trị của phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới phát hiện lệch bội nhiễm sắc thể thai

bằng DNA thai tự do trong máu mẹ

Chuyên ngành : Hóa sinh

TIỂU LUẬN TỔNG QUAN

HÀ NỘI - 2017

AFP : Alpha fetoprotein

CffDNA : cell free fetal DNA

CFTS : Combined first trimester screeningCPM : Confined Placental Mosaicism

MPS : Massively parallel sequencing

NGS : Next Generation Sequencing

NIPS : Noninvasive prenatal screening

MỞ ĐẦU 1

TỔNG QUAN 3

1 Nhiễm sắc thể 3

1.1 Khái niệm: 3

1.2 Các bất thường NST thường gặp 3

1.3 Các loại lệch bội NST thường gặp trong sàng lọc trước sinh 5

1.3.1 Hội chứng Down 6

1.3.2 Hội chứng Patau 8

1.3.3 Hội chứng Edwards 9

1.3.4 Hội chứng Turner 11

1.3.5 Hội chứng Klinefelter 12

1.3.6 Hội chứng Jacobs 14

1.3.7 Hội chứng trisomy X 15

2 Các phương pháp sàng lọc trước sinh truyền thống lệch bội NST 16

2.1 Sàng lọc trước sinh lệch bội NST 16

2.2 Các phương pháp sàng lọc trước sinh truyền thống 16

2.2.1 Tính toán nguy cơ cho bệnh nhân 16

2.2.2 Tuổi mẹ và tuổi thai 17

2.2.3 Ảnh hưởng của lần có thai trước đó 20

2.2.4 Siêu âm hình thái 20

2.2.5 Sàng lọc trước sinh bằng xét nghiệm hóa sinh 21

2.3 Các phương pháp chẩn đoán trước sinh phát hiện bất thường NST 28

2.3.1 NST đồ - Karyotype 28

2.3.2 Kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang 29

2.3.3 Kỹ thuật MLPA 29

2.3.4 Kỹ thuật CGH 29

2.3.5 Kỹ thuật Array CGH 29

2.3.6 Kỹ thuật QF-PCR 29

3.1 Các công nghệ giải trình tự NGS hiện nay 32

3.2 Công nghệ giải trình tự thế hệ mới phát hiện lệch bội NST thai 36

4 Sàng lọc trước sinh bằng DNA thai tự do 39

4.1 Lịch sử phát hiện DNA thai tự do trong máu mẹ 39

4.2 Đặc điểm cffDNA trong máu mẹ 40

4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nồng độ cffDNA 41

4.3.1 Các yếu tố từ thai nhi 41

4.3.2 Các yếu tố từ mẹ 41

4.4 Các phương pháp tiếp cận tin sinh học để ước tính tỷ lệ cffDNA 42

4.4.1 Phương pháp dựa trên NST Y 43

4.4.2 Phương pháp dựa trên kiểu gen của cha mẹ và dữ liệu giải trình tự huyết tương mẹ 44

4.4.3 Phương pháp dựa trên dữ liệu giải trình tự high-depth DNA trong huyết tương mẹ 44

4.4.4 Phương pháp dựa trên dữ liệu giải trình tự shallow-depth DNA trong huyết tương mẹ kết hợp với kiểu gen của mẹ 45

4.4.5 Phương pháp dựa trên dữ liệu giải trình tự shallow-depth DNA huyết tương mẹ 46

4.4.6 Phương pháp dựa trên kích thước cfDNA 46

4.5 Sàng lọc trước sinh lệch bội NST sử dụng cffDNA 47

4.5.1 Điểm z-score và lý do xác định lệch bội NST thai 49

4.5.2 NIPS tiếp cận toàn bộ hệ gen 50

4.5.3 NIPS tiếp cận một số NST mục tiêu 51

4.5.4 Sàng lọc lệch bội NST 52

5 Các nghiên cứu NIPS trên thế giới và tại Việt Nam 54

5.1 Các nghiên cứu NIPS trên thế giới 54

5.2 Nghiên cứu NIPS tại Việt Nam 63

KẾT LUẬN 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Bảng 1: Tỷ lệ lệch bội NST thường gặp 6Bảng 2: Mô tả mối liên quan nguy cơ trisomy theo tuổi mẹ 17Bảng 3: Ước tính nguy cơ trisomy 21 (1/số đưa ra trong bảng) trong mối liên

quan giữa tuổi mẹ và tuổi thai 18Bảng 4: Ước tính nguy cơ trisomy 18, 13 (1/số đưa ra trong bảng) trong mối

liên quan giữa tuổi mẹ và tuổi thai 19Bảng 5 Các marker được sử dụng trong sàng lọc huyết thanh mẹ 24Bảng 6: Tỷ lệ phát hiện và tỷ lệ dương tính giả trong sàng lọc trước sinh

trisomy 21 26Bảng 7: Tỷ lệ phát hiện và tỷ lệ dương tính giả của sàng lọc trước sinh

trisomy 21 27Bảng 8: Tỷ lệ phát hiện và tỷ lệ dương tính giả lệch bội NST thai sử dụng

cffDNA 53

Hình 1: Karyotype của một người nam bình thường (nhuộm băng G) 4

Hình 2: Tỉ lệ bất thường các NST được chẩn đoán khi trẻ <1 tuổi 6

Hình 3: Trẻ có biểu hiện mặt DS và bàn tay rãnh khỉ 7

Hình 4: Karyotype 47,XY,+21 7

Hình 5: Trẻ mắc trisomy 13 9

Hình 6: Karyotype 47,XX,+13 9

Hình 7: Trẻ mắc hội chứng Edwards 10

Hình 8: Karyotype 47,XX,+18 10

Hình 9: Trẻ mắc hội chứngTurner và karyotype 45,X 11

Hình 10: Trẻ mắc TS biểu hiện cổ màng 11

Hình 11: Hội chứng Klinefelter và Karyotype 47,XXY 13

Hình 12: Karyotype 47,XYY 15

Hình 13: Karyotype 47,XXX 16

Hình 14: Giải trình tự trên hệ thống Illumina 33

Hình 15: Giải trình tự trên hệ thống Ion Torrent 36

Hình 16: Sơ đồ tổng quát các bước giải trình tự cffDNA bằng NGS 37

Hình 17: DNA thai tự do trong huyết tương mẹ 40

Hình 18 Các phương pháp tiếp cận để xác định tỷ lệ cffDNA 43

Hình 19: Hai phương pháp sàng lọc lệch bội NST sử dụng cffDNA 49

MỞ ĐẦU

Dị tật bẩm sinh và rối loạn di truyền chiếm khoảng 3 – 5% trong tổng sốphụ nữ mang thai trên toàn thế giới [1] Bất thường nhiễm sắc thể (NST)chiếm tỷ lệ 1:150 trẻ sinh sống [2], là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong vàbệnh tật cho trẻ sơ sinh [3] Chiếm khoảng 85% của những bất thường này là

do lệch bội NST 21, 18, 13 và NST giới tính gây ra hội chứng Down,Edwards, Patau, Turner , còn lại là một số bất thường về cấu trúc và vi mấtđoạn NST hiếm gặp khác [4]

Cho đến nay, trên thế giới vẫn chưa có biện pháp nào phòng ngừa tìnhtrạng thai mắc các hội chứng do bất thường NST Chính vì vậy, việc phát hiệnsớm bất thường NST bằng sàng lọc, chẩn đoán trước sinh và tư vấn di truyền

là việc làm hết sức cần thiết nhằm giảm tỷ lệ sinh con bất thường NST Cácphương pháp sàng lọc trước sinh không xâm lấn cho bất thường lệch bội NSTbao gồm siêu âm hình thái và phân tích huyết thanh từ máu mẹ trong thai kỳ 1

và thai kỳ 2 Tuy nhiên, tỷ lệ phát hiện lệch bội dao động từ 30-94% tùy thuộcvào phương pháp sàng lọc được sử dụng [5] Để chẩn đoán xác định thì cácthai phụ có nguy cơ cao sẽ được thực hiện các thủ thuật xâm lấn như sinh thiếtgai rau hoặc chọc hút dịch ối để khảo sát số lượng NST bằng các kỹ thuậtKaryotype, QF-PCR, FISH, MLPA và Prenatal BoBs Các thủ thuật xâm lấnnày có thể gây mất thai với tỷ lệ là 0.11% đối với thủ thuật chọc hút dịch ối và0.22% đối với sinh thiết rau thai [6] Do đó, rất cần có những phương phápsàng lọc với tỷ lệ dương tính giả thấp đồng thời tỷ lệ phát hiện cao hơn, thaiphụ không cần chịu thủ thuật xâm lấn, tránh được nguy cơ ảnh hưởng đến thaiphụ và thai nhi [7]

Việc phát hiện DNA thai tự do (cffDNA) có nguồn gốc từ rau thai lưuhành trong máu mẹ vào năm 1997 [8],[9] đã mở ra khả năng thực hiện xétnghiệm sàng lọc trước sinh không xâm lấn (Noninvasive prenatal screening -

NIPS) bằng phương pháp giải trình tự thế hệ mới (Next GenerationSequencing - NGS) [10], giúp các nhà nghiên cứu có thể sàng lọc sớm thaitrên nhiều phương diện khác nhau, điển hình như: xác định sớm giới tính thaigiúp tiên lượng khả năng mắc các bệnh do NST liên kết với giới tính; nguy cơmắc các bệnh di truyền của thai trong những gia đình có nguy cơ cao, khảosát yếu tố RhesusD, xác định nguy cơ tiền sản giật, trong đó nổi bật là ứngdụng phân tích cffDNA trong sàng lọc sớm lệch bội NST [11],[12] Đây đượcxem là một phát hiện mang tính bước ngoặt, do việc lấy mẫu và phân tíchcffDNA không đòi hỏi tính can thiệp sâu, giảm thiểu nguy cơ cũng như cácbiến chứng trên thai phụ và thai nhi Hơn nữa, sàng lọc trước sinh không xâmlấn có tỷ lệ phát hiện trisomy 21 gây hội chứng Down trên 99% với tỷ lệdương tính giả thấp dưới 1% [13]

Trong phần tổng quan này, chúng tôi sẽ trình bày về các phương phápsàng lọc lệch bội NST truyền thống và giá trị của cffDNA trong sàng lọctrước sinh không xâm lấn bằng phương pháp giải trình tự thế hệ mới

Ở người bình thường, mỗi tế bào lưỡng bội (2n) mang 46 NST chiathành 23 cặp giống nhau gọi là cặp NST tương đồng với mỗi cặp có 1 NSTnhận từ bố và 1 NST nhận từ mẹ, trong đó gồm 22 cặp NST thường có mặt ở

cả người nam và người nữ, 1 cặp NST giới tính khác nhau ở hai giới, ở ngườinam cặp NST giới tính gồm 2 chiếc khác nhau ký hiệu là XY và ở người nữgồm 2 chiếc giống nhau được ký hiệu là XX

Tinh trùng và trứng được hình thành qua quá trình giảm phân có bộNST đơn bội (n) với 23 NST trong đó mỗi cặp NST tương đồng chỉ còn lại 1trong 2

Các bất thường về số lượng hoặc cấu trúc của NST thường gây ranhững hậu quả nghiêm trọng như sảy thai, dị tật bẩm sinh, ung thư…

1.2 Các bất thường NST thường gặp

Các NST có thể bị bất thường về số lượng hoặc cấu trúc Các biến đổinày có thể thấy ngay khi sinh hoặc sau này do mắc phải trong quá trình áctính hoá của các tế bào u và là kết quả của các biến cố xảy ra trong phân bàogiảm nhiễm hoặc trong phân bào nguyên nhiễm Sự bất thường này có thể xảy

ra ở một hay trên nhiều NST Các bất thường được gọi là đồng nhất khi tất cảcác tế bào quan sát đều mang nó, và gọi là bất thường khảm khi chỉ một số tếbào có bất thường này

Các thuật ngữ mô tả bất thường NST:

- Karyotype (NST đồ): 46 NST trong bộ NST của người ở kỳ giữa củanguyên phân (giai đoạn NST co ngắn lại tối đa) được chụp ảnh và sắp xếp lại.Căn cứ theo kích thước các băng hiện trên NST, 22 cặp NST thường được sắptheo thứ tự từ lớn tới nhỏ và đánh số từ 1đến 22 Cặp NST giới tính được sắpxếp riêng Karyotype được dùng để mô tả đặc điểm bộ NST của một cá thể(Hình 1)

Hình 1: Karyotype của một người nam bình thường (nhuộm băng G)

- Lưỡng bội (2n): Bộ NST có trong các tế bào sinh dưỡng và sinh dụcchưa giảm phân, ở người 2n = 46

- Đơn bội (n): Bộ NST có trong các giao tử sau giảm phân, ở người n = 23

- Thể tam nhiễm (trisomy, thể tam nhiễm): Tăng thêm 1 NST của 1 cặpNST nào đó, thay vì có 2 NST tương đồng thì có tới 3 NST tương đồng Ví dụnhư trường hợp thể tam nhiễm 21 gây hội chứng Down

- Thể đơn nhiễm (monosomy, thể đơn nhiễm): Thiếu 1 NST của 1 cặpNST nào đó, thay vì có 2 NST tương đồng thì chỉ còn lại 1 NST Ví dụ nhưtrường hợp thể đơn nhiễm X gây hội chứng Turner

Hậu quả các bất thường NST

- Các bất thường NST gây sảy thai ngẫu nhiên: Ước tính khoảng 50%trường hợp sảy thai ngẫu nhiên do nguyên nhân bất thường NST

- Gây ra các dị tật bẩm sinh: Mặc dầu các loại bất thường NST rất đadạng nhưng tất cả các trường hợp bất thường NST đều có những biểu hiệnchung như sau:

1.3 Các loại lệch bội NST thường gặp trong sàng lọc trước sinh

Các bất thường NST là nguyên nhân của 50% các trường hợp sảy thai

tự nhiên trong 3 tháng đầu thai kỳ và là nguyên nhân của 7% tử vong sơ sinh

và khoảng 0,6% trẻ lúc sinh phát hiện có bất thường NST Tuy nhiên, chiếmđến 85% các trường hợp bất thường về NST là lệch bội NST 21, 18, 13, X và

Y gây ra hội chứng Down, Edwards, Patau, Turner, Klinefelter… Ngoài racòn có thể gặp một số hội chứng mất đoạn nhỏ NST như hội chứng Digeorge,Cri du Chat, Prader-Willi/ Angelman, Williams- Beuren, 1p36 [4]

Trong một nghiên cứu phân tích tỷ lệ bất thường NST tại Châu Âu trên10.323 thai phụ từ năm 2000-2006 cho thấy: Hội chứng Down chiếm tỷ lệ caonhất là 53%, tiếp đến là hội chứng Edwards là 13%, hội chứng Patau chiếm5%, hội chứng Turner 8%, bất thường NST giới tính XXX, XXY, XYY chiếm4%, còn lại là các bất thường hiếm gặp khác (Hình 2) [4]

Hình 2: Tỉ lệ bất thường các NST được chẩn đoán khi trẻ <1 tuổi

Hội chứng Down là lệch bội NST thường gặp nhất chiếm tỷ lệ 1:800 trẻsinh sống Trẻ mắc trisomy 18 và 13 vẫn có thể sống sót khi sinh, tuy nhiên tỷ

lệ thấp hơn đáng kể Tỷ lệ lệch bội NST giới tính ít phổ biến hơn lệch bộiNST thường Bảng 1 mô tả tỷ lệ lệch bội một số NST thường gặp [14]:

1.3.1 Hội chứng Down (Down Syndrome – DS)

Hội chứng Down là một bất thường chủ yếu gây ra do thừa 1 NST số 21trong bộ NST, người bệnh có tới 47 NST do có 3 NST 21 (còn gọi là thể tamnhiễm 21, trisomy 21) [15] Sự bất thường này gây ra do rối loạn hoạt độngphân ly của cặp NST 21 trong quá trình phân chia tế bào (hình 4) [16] Tuynhiên, cũng có một tỷ lệ nhỏ người mắc DS do đột biến cấu trúc liên quan đếnNST 21 [17] hoặc thể khảm (là cơ thể có mặt hai dòng tế bào khác nhau, ví dụ

cơ thể vừa có dòng tế bào bình thường 46 NST và dòng tế bào bất thường 47NST do có 3 NST 21) [18].

DS là hội chứng hay gặp nhất với tần suất 1/700-1/800 trẻ sinh sống[19], với tỷ lệ nam: nữ là 1,2-1,5:1 Tần suất sinh con mắc DS tăng theo tuổimẹ: nguy cơ 1/2000 khi mẹ 20 tuổi và tăng lên 1/100 khi mẹ ở tuổi 40 [20].Bệnh được Seguin lần đầu mô tả năm 1846 với những đặc điểm hình thái vớitên bệnh “Furfurraceous Idiocy” Đến năm 1866, John Langdon Down mô tảmột số bệnh nhân chậm phát triển tâm thần với những dấu hiệu hình thái đặctrưng vào năm 1959, Leujeune và Turpin chứng minh được là do bộ NST có

47 NST, thêm 1 NST 21 [21],[22]

Hình 3: Trẻ có biểu hiện mặt DS và bàn tay rãnh khỉ Hình 4: Karyotype 47,XY,+21

Trẻ mắc DS có khuôn mặt khá điển hình với mắt xếch, có nếp quạt ở góctrong của mắt, gáy phẳng, cổ ngắn, tai nhỏ, lưỡi dày và thè ra, 50% trẻ này córãnh khỉ trong lòng bàn tay, bàn tay ngắn, các ngón tay ngắn, các ngón tayngắn (hình 3), đôi khi không có đốt giữa của ngón tay út, khoảng cách giữangón chân cái và ngón chân thứ 2 giãn rộng, lùn Trẻ mắc DS có biểu hiệngiảm trương lực cơ và ngái ngủ, tăng mức độ duỗi của các khớp Phần da saugáy giãn, mũi nhỏ và tẹt, trong quý 1 của thai kỳ đây là hai dấu hiệu được sửdụng để đánh giá nguy cơ mắc DS của thai nhi Trẻ mắc DS chậm phát triểntâm thần – vận động, khoảng 1/6 trẻ có biểu hiện rối loạn nhân cách như tăngđộng, giảm tập trung người mắc DS có chỉ số IQ trung bình khoảng 40-45,

tương đương với trẻ bình thường 5 tuổi Khoảng 60% trẻ mắc DS có một hoặcmột số dị tật bẩm sinh Khoảng 40-45% số trẻ bị dị tật tim bẩm sinh, 10% dị tậtđường tiêu hóa Khả năng xảy ra các khiếm khuyết của ống nhĩ thất ở trẻ Downcao gấp 400 lần hơn và tật trít hẹp tá tràng cao gấp 300 lần hơn so với quần thểbình thường Những dị tật này nếu được phát hiện trong siêu âm thai nhi cũng

là một gợi ý cho khả năng thai nhi mắc DS Ngoài ra trẻ mắc DS cũng có thể bịnhững dị tật khác như tật tinh hoàn ẩn, dị dạng đường tiết niệu, đục thủy tinhthể bẩm sinh và khe hở môi hàm Trong quá trình phát triển trẻ DS có nguy cơ

bị bệnh bạch cầu cao gấp 15-20 lần hơn trẻ bình thường, dễ mắc các bệnhnhiễm khuẩn đặc biệt nhiễm khuẩn hô hấp [19],[23],[24],[25]

1.3.2 Hội chứng Patau [26],[27],[28],[29],[30],[31]

Hội chứng Patau là một bất thường NST chủ yếu gây ra do thừa 1 NST

số 13 trong bộ NST, người bệnh sẽ có tới 47 NST do có 3 NST 13 (còn gọi làthể tam nhiễm 13, trisomy 13) (hình 6)

Hội chứng Patau được mô tả lần đầu tiên bởi Bartholin vào năm 1657,nhưng hầu như không được nhận dạng cho đến khi Patau và cộng sự phát hiện ranguyên nhân là có 3 NST 13 vào năm 1960 Vì vậy, hội chứng này còn được gọi

là hội chứng Patau Tần suất khoảng 1/10.000 trẻ được sinh sống Sự gia tăngtuổi mẹ khi mang thai cũng làm tăng nguy cơ trisomy 13 Trên 95% trường hợpthai trisomy 13 bị sảy ngẫu nhiên trong thai kỳ Hội chứng này được thấy ở nữnhiều hơn so với nam, tuy nhiên sự chênh lệch này không nhiều

Hình 5: Trẻ mắc trisomy 13 Hình 6: Karyotype 47,XX,+13

Các trẻ mắc hội chứng Patau có nhiều biểu hiện dị dạng trên vùng mặt,tật khe hở môi hoặc hàm, các khe hở thường ở cả 2 phía (hình 5), mắt nhỏ,thừa ngón sau trục (thừa ngón út) 90% có dị tật tim ngoài ra còn có thể cónhững dị dạng khác như thận đa nang, thận ứ nước, tử cung hai sừng

Do có quá nhiều dị tật nặng nề, nên cơ hội sống của trẻ trisomy 13 rấtthấp, thời gian sống sót trung bình là 7 ngày, 90% bệnh nhân chết trongnăm đầu sau sinh, trong đó 40% là chết chu sinh

Những trẻ sống sót đều chậm phát triển tâm thần nặng, thường độngkinh, kém phát triển thể chất Chỉ có một trường hợp duy nhất sống đến 33tuổi được thông báo Trong số những trẻ còn sống sau sinh được nghiên cứu,thời gian trung bình phải điều trị trong khoa hồi sức cấp cứu là 10,8 ngày;dùng máy thở là 13,3 ngày, 23% phải phẫu thuật trong giai đoạn sơ sinh

1.3.3 Hội chứng Edwards [26],[27],[30],[31]

Hội chứng Edwards là một bất thường NST chủ yếu gây ra do thừa 1NST số 18 trong bộ NST, người bệnh sẽ có tới 47 NST do có 3 NST 18 (còngọi là thể tam nhiễm 18, trisomy 18) (hình 8)

Lần đầu tiên được một nhóm các nhà di truyền học người Anh đứng đầu

là Edwards mô tả đầy đủ năm 1960 Hội chứng Edwards là loại bất thườngsốlượng NST được gặp phổ biến vào hàng thứ hai sau DS với tần số mắc bệnhtrên tổng số trẻ sinh sống khoảng 1/5000

Hình 7: Trẻ mắc hội chứng Edwards Hình 8: Karyotype 47,XX,+18

Trẻ trisomy 18 có trọng lượng sơ sinh thấp Các biểu hiện lâm sàng ở hộichứng này cũng đa dạng như ở hội chứng Patau Khuôn mặt điển hình với khe

mi mắt hẹp, gáy nhô, cằm nhỏ, tai nhỏ, vành tai vểnh ra ngoài, miệng nhỏ, há

ra khó khăn (hình 7) Xương ức ngắn Bàn tay điển hình với các ngón tay đèlên các ngón khác khi nắm lại Bàn chân võng hoặc bị khoèo nặng Khoảng90% mắc các dị tật bẩm sinh nghiêm trọng thường là khuyết tật của vách liênthất, ngoài ra còn có các bất thường khác của cơ quan nội tạng như rò khí-thực quản, thoát vị cơ hoành, thận hình yên ngựa hay thận đa nang, không cóthể chai v.v… Các trường hợp khảm có biểu hiện nhẹ hơn

Những đứa trẻ mắc hội chứng trisomy 18 thường yếu và ít có khả năngsống sót, thường phải hồi sức ngay sau khi sinh và có những lúc ngưng thởtrong giai đoạn sơ sinh Trẻ bú yếu, có thể phải nuôi dưỡng qua ống thôngmũi-dạ dày Tuy nhiên, ngay cả khi được chăm sóc tối ưu, trẻ cũng rất kémphát triển Khoảng 50% trẻ chết trong tuần lễ đầu tiên sau sinh, 90% trườnghợp chết trong năm đầu của đời sống Hiếm cơ trường hợp sống quá 1 năm

và đều có biểu hiện chậm phát triển nặng nề về tâm thần và vận động TheoBaty và cộng sự, trung bình một trẻ trisomy 18 còn sống sau sinh có thời gianđiều trị tại hồi sức cấp cứu là 16.3 ngày; dùng máy thở là 10.1 ngày; 13% cóphẫu thuật giai đoạn sơ sinh

1.3.4 Hội chứng Turner (Turner Syndrome - TS) [32],[33],[34]

Hội chứng Turner (TS) là một bất thường chủ yếu gây ra do chỉ có 1NST giới tính X do đó người bệnh chỉ có 45 thay vì 46 NST như người bìnhthường (Hình 9)

Hội chứng Turner được Ullrich đã mô tả đầu tiên năm 1930 Đến năm

1938, Turner bổ sung thêm nhiều biểu hiện ở người trưởng thành Năm 1959,Ford xác định bộ NST của những bệnh nhân này là 45,X Nguồn gốc NST X

trong hội chứng Turner 45,X Theo một nghiên cứu thì 75% NST X có nguồngốc là từ mẹ Tần số xuất hiện hội chứng này là 1/5000 trong số trẻ gái sinhsống Khoảng 97% trường hợp thai mắc TS đã bị sảy thai ngẫu nhiên và ướctính có khoảng 15% trường hợp sảy thai ngẫu nhiên liên quan đến hội chứngnày, chỉ một số nhỏ sống đến khi sinh.

Hình 9: Trẻ mắc hội chứng Turner và karyotype 45,X Hình 10: Trẻ mắc TS biểu hiện cổ màng

Bất thường NST ở những người mắc hội chứng Turner khá đa dạng, chỉ

có khoảng 50% bệnh nhân có bộ NST với 1 NST X Khoảng 50% ở dạngkhảm hoặc là 46,XX/45,X hoặc 1 NST X bình thường và 1 NST X bất thườnghình nhẫn hoặc NST đều nhánh dài của X, một số trường hợp khảm dướidạng 45,X/46,XY Sự đa dạng này giải thích sự khác biệt rất lớn trong biểuhiện kiểu hình của những người mắc hội chứng này

Hầu hết các thai nhi mắc TS đều bị phù nghiêm trọng từ trong tử cunggây tình trạng phù thai, biểu hiện này có thể được phát hiện ở thai kỳ 2 bằngsiêu âm Sau sinh trẻ mắc TS có thể quan sát thấy tình trạng phù ở bàn tay,bàn chân và vùng cổ với biểu hiện cổ màng (hình 10), đây cũng là các dấuhiệu gợi ý chẩn đoán TS ở trẻ sơ sinh

Ở tuổi thiếu niên, lùn là biểu hiện nổi bật Ở tuổi trưởng thành nếu khôngđược điều trị người nữ mắc TS có biểu hiện điển hình với lỗ tai thấp, cổ rộng

và có “màng”, đường chân tóc nằm thấp, ngực rộng và có hình khiên, nhi hóa

về giới tính và loạn sản buồng trứng, vô sinh.

Các dị tật bẩm sinh của các cơ quan nội tạng thường gặp gồm hẹp độngmạch chủ (khoảng 15%), dị tật của thận (khoảng 40%), tình trạng thiểu nănggiáp chiếm tỷ lệ khoảng 20% ở người trưởng thành

Ở những trường hợp khảm 45,X/46,XY có tăng nguy cơ bị u nguyên bàosinh dục và đôi khi có kiểu hình của người nam bình thường nhưng cũng cóthể có biểu hiện giới tính không rõ hoặc có biểu hiện như TS điển hình Ngườimắc TS có trí tuệ bình thường

Người mắc TS thường có tuổi thọ bình thường, trừ những trường hợp có dịtật nặng chết ở thời kỳ mới sinh Các bệnh nhân loại này thường vô sinh, tuynhiên có trường hợp có thai sinh con, gặp ở trạng thái khảm

1.3.5 Hội chứng Klinefelter (47,XXY) [35],[36],[37]

Hội chứng Klinefelter (Klinefelter Syndrome-KS) là một bất thường chủyếu gây ra do có 3 NST giới tính XXY thay vì chỉ có XY hoặc XX (chiếm80% trường hợp) trong đó có 50% trường hợp có NST X thừa xuất phát từ mẹ(hình 11) Số còn lại có thể được gặp dưới dạng khảm 47,XXY/46,XY(khoảng 15% trường hợp) và một số trường hợp có trên 2 NST giới tính Xnhư 48, XXXY và 49, XXXXY

Năm 1942, Klinefelter và cộng sự đã mô tả hội chứng này Năm 1959,Jacob và Strong chứng minh rằng karyotype của người bệnh này là 47,XXY.Hội chứng được gặp với tần số 1/1000 trẻ sơ sinh nam và thường gặp trongcác trường hợp người mẹ lớn tuổi, trung bình là 32.3 tuổi Mặc dù kiểu hìnhtương đối nhẹ nhưng người ta ước tính có tối thiểu 50% số thai mangkaryotype 47,XXY bị sảy ngẫu nhiên

Hình 11: Hội chứng Klinefelter và Karyotype 47,XXY

Trẻ sơ sinh mắc KS có biểu hiện như trẻ bình thường, do đó rất khó đểchẩn đoán trong giai đoạn này cũng như giai đoạn trước dậy thì Người nammắc hội chứng này có xu hướng cao trên trung bình, tay và chân tay dàikhông cân đối với cơ thể (hình 11)

Ở giai đoạn dậy thì: trong nhiều trường hợp người cao, chân tay dài,nhưng cũng có trường hợp hình thái nam bình thường Một triệu chứngthường thấy là tinh hoàn không phát triển, mào tinh hoàn nhiều khi lớn hơntinh hoàn, khoảng 35-50% trường hợp có vú to (hình 11) và tăng nguy cơ bịung thư vú Giới tính nam kém phát triển, không râu, ít lông mu, dương vật

bé, tình dục giảm Tăng bài tiết FSH, bài tiết 17-cetosteroid bình thường hoặcgiảm Bởi vậy, chẩn đoán hội chứng này thường ở giai đoạn dậy thì và trưởngthành Theo Simpson, hội chứng Klinefelter thường là vô sinh do vô tinh vàthiểu tinh nặng [36] Tuy nhiên Krausz và Forti (2000) thấy ở một số ít bệnhnhân Klinefelter thể khảm tinh hoàn vẫn có thể sinh tinh nên vẫn có khả năngsinh sản nhưng thường là thiểu tinh nặng

Mặc dù người nam mắc KS thường không bị chậm phát triển trí tuệnhưng cũng có thể có biểu hiện nhẹ khó khăn trong học tập

1.3.6 Hội chứng Jacobs (47,XYY)

Hội chứng 47,XYY (Hội chứng Jacobs) được Evans và cộng sự pháthiện năm 1977 khi phân tích định loại NST ở các bé trai sơ sinh Tần số người

47,XYY trong quần thể là 1/1000 nam giới [38].

Trong số nam giới có karyotype 47,XYY (hình 12), một số có khả năngsinh sản, tỷ lệ bệnh này nhiều hơn trong quần thể vô sinh nam Có trường hợpdương vật nhỏ, tinh hoàn lạc chỗ và lỗ đái lệch thấp Trên lâm sàng ngườibệnh có dáng vóc cao, xét nghiệm tinh dịch vô tinh hoặc thiểu tinh nặng Trênmẫu sinh thiết, mô học tinh hoàn thấy tế bào dòng tinh thiểu sản và hầu nhưkhông trưởng thành, ngoài ra còn xơ hóa ống sinh tinh Cơ chế bệnh sinh hầuhết do sự không phân ly của NST Y xảy ra trong phân bào giảm nhiễm lần thứhai ở bố Theo Speed (1989), khả năng sinh sản của những người 47,XYYkhác nhau đáng kể, từ số lượng tinh trùng bình thường đến vô tinh Nhiềunam giới 47,XYY vẫn sinh con bình thường, tuy nhiên chưa có nghiên cứu hệthống về con của những người này Về mặt lý thuyết, 50% tinh trùng sẽ bìnhthường Benet và Martin (1988) nghiên cứu NST của 75 tinh trùng từ ngườinam 47,XYY thấy tất cả những tinh trùng này đều có một NST giới tính Tácgiả cho rằng NST giới tính thêm vào đã bị đào thải trong quá trình sinh tinh[39] Nghiên cứu của Gonzalez-Merino (2007) trên hai bệnh nhân karyotype47,XYY có thiểu tinh nặng cho thấy tỷ lệ tinh trùng lệch bội NST là 37 - 38%,với khoảng một nửa bất thường là do lệch bội NST giới tính [40]

Tâm thần: nhiều trường hợp có tính nết thất thường, thiếu tự chủ, dễ bịkích động, hung hăng, phạm tội trộm cướp, giết người, vì vậy tần số hộichứng 47,XYY ở các trung tâm giam giữ tội phạm có thể đến 2/100

Hình 12: Karyotype 47,XYY 1.3.7 Hội chứng trisomy X (47,XXX) [41],[42]

Được Jacobs mô tả đầu tiên vào năm 1959 Hội chứng trisomy X xuất hiệnvới tần số chung là khoảng 1:1000 trẻ sơ sinh gái Thường gặp 47,XXX (hình13), có thể khảm 46,XX/47,XXX Những biểu hiện bên ngoài rất khó phân biệtngười bệnh với những người bình thường do không có những biến đổi rõ ràng vềhình thái cũng như tâm thần và thể lực Tuy nhiên, một số người bệnh cũng cómột số bất thường về chức năng sinh sản ở phụ nữ như vô kinh thứ phát, rối loạnkinh nguyệt, mãn kinh sớm, tỷ lệ mắc bệnh tâm thần phân liệt cao Những phụ

nữ trisomy X vẫn có khả năng sinh đẻ bình thường song nguy cơ bất thườngNST ở con cái cao hơn những người khác

Các bất thường NST trên thường không thể điều trị khỏi, chính là gánhnặng cho gia đình và xã hội Biện pháp phòng ngừa tích cực nhất là sàng lọcdựa trên tuổi mẹ, siêu âm, các marker sinh hóa… và chẩn đoán trước sinhbằng các xét nghiệm di truyền

Hình 13: Karyotype 47,XXX

2 Các phương pháp sàng lọc trước sinh truyền thống lệch bội NST

2.1 Sàng lọc trước sinh lệch bội NST

- Lệch bội NST là nguyên nhân chính gây tử vong chu sinh và tàn tật ởtrẻ em Do đó, việc sàng lọc và chẩn đoán trước sinh phát hiện sớm cácbất thường này là việc làm hết sức cần thiết nhằm giảm tỷ lệ sinh conbất thường NST

- Sàng lọc trước sinh lệch bội NST là việc sử dụng các kỹ thuật trongthời gian mang thai để phát hiện nguy cơ dị tật bẩm sinh

2.2 Các phương pháp sàng lọc trước sinh truyền thống

Các phương pháp sàng lọc truyền thống nguy cơ cao bất thường NST làsàng lọc dựa vào tuổi mẹ, siêu âm, xét nghiệm huyết thanh mẹ thai kỳ 1 và 2như double test và triple test…

2.2.1 Tính toán nguy cơ cho bệnh nhân

Mỗi thai phụ đều có nguy cơ thai nhi bị bất thường NST Trách nhiệm củacác nhà lâm sàng là đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến nguy cơ của thai bằngcách sử dụng các phương pháp chính xác nhất giúp cho gia đình thai phụ đưa raquyết định đúng đắn trước khi thực hiện các xét nghiệm xâm lấn Để tính toánnguy cơ cho thai phụ, cần phải tính nguy cơ mắc bệnh (phụ thuộc vào tuổi mẹ và

tuổi thai) kết hợp với một số kết quả của siêu âm và xét nghiệm huyết thanh mẹtrong quá trình mang thai, từ đó tính toán được nguy cơ thực sự của thai nhi,nguy cơ này sẽ trở thành nguy cơ mắc bệnh cho lần xét nghiệm sàng lọc kế tiếp.Quá trình này được gọi là sàng lọc nối tiếp (sequential screening) [43] Trongtính toán nguy cơ cho thai phụ thường sử dụng phần mềm FMF (UK) trong sànglọc thai kỳ 1 và phần mềm Prisca (Immulite), T21 (Gamma) và Life cycle(Perkin Elmer) trong thai kỳ 2.

2.2.2 Tuổi mẹ và tuổi thai

Việc sàng lọc cho các đối tượng có nguy cơ cao lệch bội NST trong thai

kỳ bắt đầu với tuổi mẹ Ước tính rủi ro liên quan đến tuổi mẹ của trisomy 21 khisinh dựa vào nhiều khảo sát trên thai phụ mang thai trisomy 21 Nguy cơ bấtthường NST tăng theo tuổi mẹ (bảng 2), khi tuổi của mẹ tăng, nguy cơ sinhcon hội chứng Down tăng từ 1/1000 ở 30 tuổi đến1/400 ở tuổi 35 và 1/100 ởtuổi 40 [44] Trong khi tuổi của người cha không ảnh hưởng đến nguy cơ lệchbội NST Lý thuyết lâm sàng này phù hợp với các nghiên cứu chứng minhrằng hơn 90% thai nhi mắc trisomy 21 xuất phát từ không phân ly nhiễm sắcthể 21 trong giảm phân tạo trứng ở mẹ, thông thường là trong giai đoạn giảmphân I Ngoài ra, thai bất thường NST có nguy cơ tử vong trong tử cung caohơn so với thai bình thường, nguy cơ sẽ giảm theo tuần thai (bảng 3)

Bảng 2: Mô tả mối liên quan nguy cơ trisomy theo tuổi mẹ

Tuổi mẹ Trisomy 21 Trisomy 18 Trisomy 13

Bảng 3: Ước tính nguy cơ trisomy 21 (1/số đưa ra trong bảng) trong mối

liên quan giữa tuổi mẹ và tuổi thai

Tuổi thai (tuần)

Dựa và xét nghiệm hóa sinh từ huyết thanh mẹ và siêu âm hình thái thai nhi

ở các giai đoạn khác nhau của thai kỳ sẽ tính được nguy cơ bất thường NST chothai nhi khi kết hợp với tuổi mẹ và tuổi thai Ước tính như vậy được so sánh vớitần suất mắc trisomy 21 khi sinh với tần suất mắc trisomy 21 thai nhi từ xétnghiệm chẩn đoán bằng chọc hút dịch ối và sinh thiết gai rau trong thai kỳ 1 vàthai kỳ 2 (bảng 3) [45]

Nguy cơ trisomy 18, 13 tăng theo tuổi mẹ và giảm theo tuổi thai, tỷ lệthai chết trong tử cung giữa 12 và 40 tuần khoảng 80% (bảng 4) Hội chứngTurner liên quan tới mất một NST X, do vậy bộ NST sẽ là 45,X, không nhưtrisomy, hội chứng này không liên quan tới tuổi mẹ Tỷ lệ mắc khoảng 1:1500tại thời điểm thai 12 tuần, 1:3000 tại 20 tuần và 1:4000 tại 40 tuần Đối với

hội chứng bất thường NST giới tính khác (47,XXX, 47,XXY và 47,XYY),không có sự liên quan với tuổi mẹ và tỷ lệ chung thai chết trong tử cungkhông cao hơn thai có bộ NST bình thường (1:500), không giảm theo tuổithai Thai đa bội chiếm khoảng 2%, tỷ lệ thai chết trong tử cung cao do đó rấthiếm khi quan sát được trên trẻ sinh sống Tần suất gặp tại thời điểm 12 và 20tuần vào khoảng 1:2000 và 1:250000 [46].

Bảng 4: Ước tính nguy cơ trisomy 18, 13 (1/số đưa ra trong bảng) trong

mối liên quan giữa tuổi mẹ và tuổi thai.

Tuổi thai (tuần)

2.2.3 Ảnh hưởng của lần có thai trước đó

Nguy cơ mang thai trisomy trên những phụ nữ mang thai mắc trisomy

của lần mang thai trước đó có tỷ lệ cao hơn nguy cơ theo tuổi mẹ Một nghiêncứu trên 2054 thai phụ có tiền sử mang thai trisomy 21, nguy cơ tái mắc cholần mang thai sau là 0.75%, cao hơn nguy cơ theo tuổi mẹ ở cùng thời điểmmang thai Do vậy, một phụ nữ 35 tuổi có tiền sử mang thai trisomy 21 cónguy cơ tăng từ 1:249 (0.40%) đến 1:87 (1.15%) tại 12 tuần thai, và trên phụ

nữ 25 tuổi nguy cơ tăng từ 1:946 (0.106%) đến 1:117 (0.856%) Nghiên cứu

trên 750 thai phụ có tiền sử mang thai trisomy 18, nguy cơ tái mắc cho lầnmang thai sau là 0.75%, cao hơn nguy cơ theo tuổi mẹ và tuổi thai liên quantới nguy cơ trisomy 18; nguy cơ trisomy 21 những phụ nữ này không tăngthêm Do vậy, nguy cơ tái mắc là đặc hiệu cho bất thường NST [6].

2.2.4 Siêu âm hình thái

Trong chẩn đoán trước sinh, siêu âm được sử dụng lần đầu tiên vàonhững năm 1972 Sau đó, siêu âm ngày càng được sử dụng rộng rãi và đã trởthành một phương tiện chẩn đoán quan trọng và không thể thiếu trong chươngtrình chăm sóc trước sinh Đây là phương pháp không xâm phạm thai, tươngđối an toàn nên được xem là một trong những công cụ chủ yếu để sàng lọc vàphát hiện các dị tật của thai

Siêu âm đo độ mờ da gáy (NT) là phương pháp đo chiều dày từ mặtngoài da gáy tới xương trên đốt sống cổ [47] Khi có bất thường NST, mộtlượng chất lỏng bất thường trong khoảng trống sau gáy này của thai nhi xuấthiện, do đó làm tăng NT [48] Các nghiên cứu cho thấy rằng 80% thai nhisinh ra với chứng thiếu máu đều có NT tăng cao Siêu âm đo NT cũng hữuích cho việc phát hiện các bất thường NST như hội chứng Down [49] Xácsuất sảy thai tăng từ 1,6% đối với các đối với NT từ 3,0 đến 3,5 mm và lênđến 20% với NT ≥6,5 mm [50] Khoảng 80% thai trisomy 21 liên quan vớităng NT (≥ 3mm) Tỷ lệ phát hiện hội chứng Down khi sử dụng NT là 70-71%, với tỷ lệ dương tính giả 3.5-5% [51] Siêu âm đo NT đã được cải thiệntrong những năm gần đây, cho phép giảm tỷ lệ dương tính giả Tỷ lệ phát hiệnđược cải thiện khi sàng lọc NT kết hợp với một số chỉ tiêu khác như tuổi mẹ

và chỉ số hóa sinh FβhCG và PAPP-A huyết thanh mẹ của thai tuần 11-14.Điều này cho phép các bác sĩ xác định nguy cơ của thai phụ mắc các hộichứng Down, Edwards, Patau Thai phụ có kết quả sàng lọc nguy cơ cao đượcchỉ định các thủ thuật xâm lấn như sinh thiết gai rau hoặc chọc hút dịch ối

nhằm chẩn đoán xác định và các thai phụ nguy cơ thấp được theo dõi tiếptrong thai kỳ thứ 2.

Việc phân tích sự có mặt của xương mũi thai nhi bằng siêu âm cũng được

sử dụng trong thai kỳ 1 nhằm tăng tỷ lệ phát hiện hội chứng Down, từ 11-14tuần thai, 60-70% thai trisomy 21 không thể siêu âm được xương mũi và dưới1% trường hợp có số lượng NST bình thường không siêu âm được xương mũi[52] Nghiên cứu cho thấy sàng lọc trisomy 21 vào tuần 11-14 bằng cách phốihợp siêu âm xương mũi, đo NT và phân tích free β-hCG/PAPP-A trong huyếtthanh mẹ tăng tỷ lệ phát hiện lên đến 97%, dương tính giả 5%, hoặc tỷ lệ pháthiện 95% đối với tỷ lệ dương tính giả là 2% [53]

2.2.5 Sàng lọc trước sinh bằng xét nghiệm hóa sinh

Sàng lọc hội chứng Down bằng huyết thanh mẹ được chỉ định cho tất

cả các thai phụ, đây là xét nghiệm không xâm lấn nhằm phân tích các dấu ấn(marker) trong huyết thanh mẹ để xác định nguy cơ trisomy 21 [54] Tuynhiên sàng lọc bằng huyết thanh mẹ chỉ đánh giá nguy cơ, không đưa ra chẩnđoán xác định Do vậy thai phụ cần phải thực hiện thủ thuật xâm lấn như sinhthiết gai rau hoặc chọc hút dịch ối để phân tích bộ NST thai nhi nhằm chẩnđoán xác định thai lệch bội NST

Các dấu ấn trong huyết thanh mẹ để sàng lọc bất thường NST thai làPAPP-A (prenancy Associated plasma protein - A), β-hCG (free β–humanchorionic gonadotropin), AFP (α-fetoprotein), uE3 (unconjugated estriol) vàinhibin A (bảng 5) [54]

βhCG

βhCG là một thành phần trong cấu trúc của hormon hCG (humanchorionic gonadotropin) hCG đầu tiên được các tế bào lá nuôi của trứng saukhi đã được thụ tinh tiết ra sau đó sẽ do rau thai bài tiết hCG có mặt trong

huyết thanh của mẹ vào khoảng 6 đến 8 ngày sau khi trứng được thụ tinh vàđạt tới nồng độ cao nhất sau từ 50 đến 80 ngày tính từ kỳ kinh cuối hCGđược cấu thành từ hai tiểu đơn vị là α (alpha) và β (beta) Nếu thai nhi mắchội chứng Down, nồng độ của tiểu đơn vị βhCG gia tăng đáng kể trong thai

kỳ 1 và thai kỳ 2

PAPP-A

PAPP-A (Pregnancy Associated Plasma Protein A) là một loạiglycoprotein do rau thai bài tiết Trong thai kỳ bình thường, nồng độ PAPP-Atăng dần trong suốt thai kỳ Trong thai kỳ 1, nếu thai nhi mắc hội chứngDown sẽ thấy nồng độ PAPP-A trong máu mẹ giảm, trong khi đó ở thai kỳ 2nồng độ PAPP-A vẫn giữ ở mức bình thường hoặc chỉ hơi giảm, do đó PAPP-

A chỉ được dùng trong thai kỳ 1 để sàng lọc thai nhi mắc hội chứng Down.Hơn nữa, mức PAPP-A thấp trong thai kỳ 1 dự báo thai nhẹ cân hay thai lưu.Trường hợp PAPP-A cao hơn bình thường là một dấu hiệu dự báo thai to

AFP (alpha fetoprotein)

Thai đang trong giai đoạn phát triển trong máu có 2 loại protein chính làalbumin và alpha fetoprotein (AFP) Vì người trưởng thành chỉ có albumintrong máu, nên xét nghiệm AFP được sử dụng để xác định gián tiếp lượngAFP trong máu thai nhi Trong thai kỳ bình thường, chỉ có một lượng nhỏAFP trong dịch ối có thể qua bánh rau để đi vào máu mẹ Tuy nhiên, khi cóbất thường ống thần kinh, do một phần ống thần kinh phôi thai không đượcđóng kín nên AFP sẽ thoát vào dịch ối Các bất thường ống thần kinh bao gồmthai vô não (do ống thần kinh phần đầu không đóng được) và tật hở khe đốtsống (spina bifida: do phần đuôi ống thần kinh không đóng được) Ở Mỹ, tỷ lệmắc các loại bệnh này 1-2/1000 trường hợp sinh Tương tự như vậy, trong tật

hở thành bụng (gastroschisis) hay thoát vị rốn (omphalocele) thì AFP từ thai

sẽ đi vào trong máu mẹ với một lượng lớn hơn bình thường Trong thai kỳ 2,

nồng độ AFP giảm gặp trong khoảng 30% trường hợp thai nhi mắc hội chứngDown.

uE3 (Unconjugated estriol-estriol không liên hợp)

Estriol có nguồn gốc từ dehydroepiandrosterone (DHEA) được sản xuất

từ tuyến thượng thận sau đó được bánh rau chuyển hóa thành estriol Estriolvào máu mẹ và được bài xuất qua đường tiết niệu hoặc bài xuất qua gan vàomật Trong huyết thanh của mẹ, estriol được đo dưới dạng không kết hợp(uE3) Trong thai kỳ bình thường, nồng độ của estriol tự do và estriol toànphần tăng dần trong suốt thai kỳ Xét nghiệm liên tục estriol thai kỳ 3 để theodõi tình trạng của thai Nếu estriol giảm báo hiệu thai đang có nguy cơ và cóthể có chỉ định kết thúc thai kỳ Estriol cũng giảm trong thai bị hội chứngDown hoặc thiểu sản tuyến thượng thận kèm theo vô não

Bảng 5 Các marker được sử dụng trong sàng lọc huyết thanh mẹ

Marker Thai kỳ Giá trị tham khảo trung vị MoM

Mỗi marker được sử dụng trong sàng lọc huyết thanh đều có các giá trịtrung vị MoM Nếu giá trị MoM lớn hơn hoặc thấp hơn so với giá trị thamchiếu, kết quả sẽ được coi là nghi ngờ [55].

Nhìn chung, thai phụ nguy cơ cao thai mắc hội chứng Down có AFP vàuE3 giảm, trong khi βhCG và inhibinA tăng trong sàng lọc thai kỳ 2 [56],[57]

Độ chính xác của các marker huyết thanh hiện nay có thể đạt tới độ nhạy 90%

và độ đặc hiệu 95% [57]

2.2.5.1 Sàng lọc thai kỳ 1 (11-13 tuần 6 ngày)

Sàng lọc kết hợp thai kỳ 1 (CFTS: Combined first trimester screening)thực hiện từ 11-13 tuần 6 ngày dựa trên tuổi mẹ, siêu âm đo NT và phân tíchnồng độ FβhCG và PAPP-A trong huyết thanh mẹ, từ đó dựa vào phần mềmtính toán yếu tố nguy cơ trisomy 21, 18, 13 Đây là phương pháp sàng lọcchuẩn đang được sử dụng ở phần lớn các nước đang phát triển Phương phápnày có độ nhạy cao và có thể phát hiện bất thường NST sớm trong thai kỳ 1.Thai phụ mang thai trisomy 21 ở thai kỳ 1, nồng độ FβhCG (khoảng 2MoM) trong huyết thanh mẹ cao hơn ở thai phụ mang thai bình thường, trongkhi đó PAPP-A thấp hơn (khoảng 0,5MoM) Tỷ lệ phát hiện trisomy 21 bằngsàng lọc doule test thai kỳ 1 khoảng 60% với tỷ lệ dương tính giả 5% [58].Khi sử dụng phương pháp sàng lọc kết hợp sẽ tăng được hiệu quả sànglọc hơn so với phương pháp riêng lẻ Kết hợp NT với β-hCG và PAPP-Atrong huyết thanh mẹ (CFTS), tỷ lệ phát hiện các loại bất thường NST 21, 18,

13 khoảng 90% với tỷ lệ dương tính giả 1% [59] Ngoài ra, còn một số đặctính đặc trưng khác của thai nhi cũng có thể nhận biết bất thường NST Đốivới trisomy 18, thai kém phát triển trong buồng tử cung (IUGR), nhịp timchậm [60] Trisomy 13 có đặc điểm nhịp tim nhanh (quan sát thấy khoảng2/3 trường hợp), IUGR sớm và dấu hiệu não trước không phân chia(holoprosencephaly) là khá đặc hiệu cho hội chứng trisomy 13 và gặp trong

30% trường hợp [61] Hội chứng Turner có đặc điểm nhịp tim nhanh, khoảng50% các trường hợp, và IUGR sớm [62] Thai đa bội, IUGR sớm, nhịp timchậm, holoprosencephaly trong 40% trường hợp [63] Trisomy 18 và 13,FβhCG và PAPP-A giảm Trường hợp bất thường NST giới tính, FβhCG bìnhthường và PAPP-A thấp Nhiều nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng kết hợp siêu

âm xương mũi với NT, FβhCG và PAPP-A tỷ lệ phát hiện đạt tới 95% [53]

2.2.5.2 Sàng lọc thai kỳ 2 (15-22 tuần)

Năm 1984, Merkatz và các cộng sự nghiên cứu sàng lọc trước sinh thai

kỳ 2 cho thấy nồng độ AFP thấp trên thai phụ mang thai trisomy 21 [64] Sau

đó, rất nhiều nghiên cứu đã báo cáo sự thay đổi nồng độ FβhCG, inhibin A vàuE3 huyết thanh mẹ trong các trường hợp bất thường NST [65],[66],[67].Sàng lọc triple test dựa theo tuổi mẹ và kết hợp với các chỉ số sinh hóa AFP,FβhCG và uE3 huyết thanh mẹ có tỷ lệ phát hiện trisomy 21 là 60-70% với tỷ

lệ dương tính giả là 5% [6] Tuy nhiên, một yếu tố quan trọng trong sàng lọcbằng marker huyết thanh mẹ thai kỳ 2 là kết quả siêu âm phải chính xác ngày

dự kiến sinh, nếu không tỷ lệ phát hiện sẽ giảm 10% Sàng lọc quad test đượcthực hiện bằng cách định lượng các chất AFP, βhCG, uE3, Inhibin A tronghuyết thanh mẹ, kết hợp với tuổi mẹ, chiều cao, cân nặng mẹ và tuổi thai, sau

đó đánh giá nguy cơ các hội chứng Down, Edwards hoặc dị tật ống thần kinhcủa thai ở thai kỳ 2 bằng phần mềm chuyên dụng Tỷ lệ phát hiện quad test là81% với tỷ lệ dương tính giả là 5% [68]

Bảng 6 là phân tích tổng hợp tỷ lệ phát hiện và tỷ lệ dương tính giảtrisomy 21 của các xét nghiệm sàng lọc bất thường NST 21 của Nicolaidesnăm 2003 [6]

Bảng 6: Tỷ lệ phát hiện và tỷ lệ dương tính giả trong sàng lọc trước sinh

trisomy 21 [6]

Xét nghiệm sàng lọc DR (%) FPR (%)

TM + hCG và PAPP-A huyết thanh ở tuần

TM + NT ở tuần thai thứ 11 – 14 75 (hoặc 70) 5 (hoặc 2)

TM + NT + xương mũi ở tuần thai thứ 11 – 14 90 5

TM + NT + hCG và PAPP-A huyết thanh ở

tuần thai thứ 11 – 14 90 (hoặc 80) 5 (hoặc 2)

TM + NT + xương mũi + hCG và PAPP-A

huyết thanh ở tuần thai thứ 11 – 14 97 (hoặc 95) 5 (hoặc 2)

TM + Các chỉ số huyết thanh ở tuần thai thứ

Siêu âm để phát hiện các bất thường và các

dấu ấn chỉ điểm (markers) ở thai nhi vào tuần

là sàng lọc integrated, sequential hoặc contingent (bảng 7) [68]

Bảng 7: Tỷ lệ phát hiện và tỷ lệ dương tính giả của sàng lọc trước sinh

trisomy 21 [68]

Sequential stepwise

Contingent

screening

11-14 sau đó 15-22

TM: tuổi mẹ, NT: độ mờ da gáy; DR: tỷ lệ phát hiện; FPR: tỷ lệ dươngtính giả

Sàng lọc integrated kết hợp đo NT, phân tích PAPP-A huyết thanh mẹthai kỳ 1 và quad test thai kỳ 2, sau đó đưa ra chỉ một kết quả đánh giá nguy

cơ lệch bội với tỷ lệ phát hiện khoảng 96% với tỷ lệ dương tính giả là 5%.Tuy nhiên, sàng lọc integrated phức tạp, yêu cầu đánh giá siêu âm thai kỳ 1 và

2 lần xét nghiệm máu và kết quả cuối cùng đưa ra vào thai kỳ 2

Giống như sàng lọc integrated, cả 2 phương pháp sàng lọc sequentialstepwise và contingent đều dựa vào sàng lọc thai kỳ 1 và 2 để đưa ra kết quảcuối cùng Tuy nhiên kết quả sàng lọc thai kỳ 1 sẽ được trả lại cho bệnh nhân.Sàng lọc sequential stepwise thực hiện sàng lọc thai kỳ 1 và quad test Bệnhnhân nguy cơ cao lệch bội sẽ được tư vấn và chẩn đoán sớm kết quả sàng lọcthai kỳ 1 Sàng lọc contingent thực hiện sàng lọc thai kỳ 1 cho tất cả thai phụ,sau đó phân loại nguy cơ cao, nguy cơ trung bình và nguy cơ thấp Nhómnguy cơ cao sẽ được tư vấn xét nghiệm chẩn đoán Nhóm nguy cơ thấp sẽkhông phải xét nghiệm thêm Nhóm nguy cơ trung bình được tiếp tục xétnghiệm quad test Tỷ lệ phát hiện từ 88-95% với tỷ lệ dương tính giả là 5%.Như vậy trong các phương pháp sàng lọc trước sinh bằng huyết thanh

mẹ kết hợp với siêu âm và một số yếu tố nguy cơ khác có thể tăng DR lên đến96% nhưng FPR vẫn khá cao là 5% [68] Do vậy vẫn rất cần một phươngpháp sàng lọc có tỷ lệ phát hiện cao hơn với tỷ lệ dương tính giả thấp hơn nữa

để có thể giảm bớt các xét nghiệm chẩn đoán xâm lấn gây ảnh hưởng tới thaiphụ và thai nhi

2.3 Các phương pháp chẩn đoán trước sinh phát hiện bất thường NST 2.3.1 NST đồ - Karyotype

Nuôi cấy tế bào và phân tích NST đồ là kỹ thuật truyền thống và đượcxem như một tiêu chuẩn vàng cho các phân tích rối loạn di truyền ở người Kỹthuật này có thể xác định bất thường về số lượng và cấu trúc NST trong phạm

vi > 5 – 10 Mb [69]

2.3.2 Kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang (FISH)

Kỹ thuật FISH là sự kết hợp giữa di truyền phân tử và di truyền tế bào.Nguyên tắc kỹ thuật sử dụng các đoạn dò phân tử được đánh dấu chất pháthuỳnh quang bắt cặp chuyên biệt với một vùng NST đặc hiệu Dưới kính hiển

vi huỳnh quang, các vị trí đoạn dò huỳnh quang gắn với NST sẽ được pháthiện Dựa vào số lượng tín hiệu màu huỳnh quang để xác định số lượng cácNST: tế bào 2n cho 2 tín hiệu, tế bào lệch bội cho 3 tín hiệu [70] Trong chẩnđoán trước sinh, kỹ thuật FISH thường được dùng để chẩn đoán lệch bội NST

21, 18, 13 và NST giới tính

2.3.3 Kỹ thuật MLPA

MLPA được ứng dụng để chẩn đoán lệch bội các NST 21, 18, 13 và NSTgiới tính vào năm 2002 MLPA có ưu điểm là xác định trên 40 locus khácnhau trong một phản ứng duy nhất [70]

2.3.4 Kỹ thuật CGH

CGH cho phép phân tích toàn thể bộ gen với kết quả chính xác hơnkaryotype Nguyên tắc kỹ thuật dựa trên mạch đơn DNA lai đặc hiệu vớinhau Kỹ thuật này có thể phát hiện sự mất cân bằng NST trong chẩn đoántrước sinh Tuy nhiên hạn chế của nó là phải đảm bảo NST ở giai đoạnmetaphase và độ phân giải đạt được chỉ là 3 Mb [71]

2.3.5 Kỹ thuật Array CGH

Array CGH cũng như kỹ thuật CGH truyền thống nhưng chúng sử dụngcác trình tự DNA thay vì NST ở giai đoạn metaphase làm mục tiêu lai Kỹthuật này có thể phát hiện được lệch bội NST, các mất đoạn và lặp đoạn nhỏ[71],[72]

2.3.6 Kỹ thuật QF-PCR

Từ năm 1993, kỹ thuật PCR huỳnh quang định lượng (QF-PCR,quantitative fluorescence PCR) đã được chứng minh có thể áp dụng vào chẩnđoán nhanh và chính xác tình trạng lệch bội của một số NST 21, 18, 13 và NSTgiới tính [73] Phương pháp PCR khuếch đại DNA trong nhân tế bào nên khôngnhất thiết đó phải là tế bào sống và đang hoạt động nên không đòi hỏi phải xử lýngay sau khi lấy mẫu Vì vậy, kỹ thuật này có thể áp dụng cho mẫu dịch ối củanhững thai kỳ sớm (12 tuần) hoặc muộn (34 tuần) vì ở những thời điểm nàytrong dịch ối không hiện diện nhiều tế bào còn sống của thai nhi [74]

2.3.7 Kỹ thuật Prenatal-BoBs

Prenatal-BoBs (PN BoBs) là kỹ thuật di truyền phân tử sử dụng rộng rãitrong xét nghiệm chẩn đoán trước sinh So với kỹ thuật FISH, QF-PCR lànhững kỹ thuật được ứng dụng để phát hiện thêm hoặc mất DNA trong cácvùng NST liên quan tới các hội chứng dị bội NST 13, 18, 21 và NST giới tính,

PN BoBs còn phát hiện thêm 9 loại đột biến mất đoạn nhỏ thường gặp nhưDiGeorge, Williams-Beuren, Prader-Willi, Angelman, Smith-Magenis, Wolf-Hirschhorn, Cri du Chat, Langer-Giedion, Miller-Dieker [75]

3 Giải trình tự thế hệ mới (Next generation sequencing - NGS)

Một phương pháp phát hiện lệch bội NST đó là xác định trình tự chínhxác của các nucleotide trong DNA Các phương pháp giải trình tự DNA đầutiên được nói đến đó là dựa trên các đoạn DNA có độ dài biến đổi về mặt hoáhọc hoặc enzyme và tách chúng bằng điện di gel Các phương pháp này trên

thực thế không phải dễ thực hiện vì sử dụng theo cách thủ công và thường xácđịnh khá nhiều thông số tối ưu cho thí nghiệm [76].

Năm 1977, Sanger và Coulson [77] công bố một quy trình được cải tiếnphương pháp này dựa vào hoạt động của enzyme DNA polymerase trong quátrình tổng hợp DNA DNA polymerase xúc tác gắn các nucleotitde vào mạchđơn của DNA đang tổng hợp ở vị trí 3’-OH, khi gặp nucleotide không cónhóm OH phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại Đặc trưng của phương pháp là sửdụng các dideoxynucleotide (ddNTP) để làm ngưng các mạch đơn DNA đangđược tổng hợp một cách ngẫu nhiên Chìa khóa của phản ứng là sử dụng cácddNTP không có nhóm 3’-OH ở phân tử đường Do đó, enzyme DNApolymerase gắn chung vào DNA thì quá trình tổng hợp bị dừng lai ĐoạnDNA cần xác định cần phải được tạo dòng vào 1 vector tách dòng, thực hiên 4phản ứng tổng hợp DNA trong 4 ống khác nhau và tiền hành đồng thời Mỗiphản ứng là hỗn hợp gồm có sợi DNA cần giải trình tự gắn trong vector DNAmỗi mạch đơn khoảng 20 nuccleotide bắt cặp với trình tự chuyên biêt trênvector Enzyme DNA polymerase, 1% ddNTP đánh dấu đồng vị phóng xạ chomỗi phản ứng 4 loại dNTP Thực hiện phản ứng tổng hợp, các đoạn DNAđược tổng hợp sẽ có độ dài khác nhau do phân tử ddNTP sẽ gắn ngẫu nhiênlàm dừng phản ứng, và được nhận biết bằng phương pháp điện di Sản phẩmcủa 4 ống phản ứng cũng được phân ly trên cùng 1 bản gel thực hiện hìnhphóng xạ, có thể quan sát được băng vạch DNA trên bản gel Căn cứ vào vị trícác vạch quan sát được trên bản gel mà xác định trình tự các nucleotide tronggel theo chiều từ 5’-3’ từ dưới lên

Năm 1986, Smith và cộng sự [78] cải tiến quá trình này bằng cách sửdụng mồi gắn nhãn huỳnh quang khác nhau, Trong phương pháp của họ, mồi

sẽ được gắn một trong bốn loại tín hiệu huỳnh quang khác nhau và được đưavào các phản ứng giải trình tự riêng biệt cùng với một trong bốn loại

dideoxynucleotides Khi phản ứng đã hoàn tất, bốn phản ứng được gộp lại vàchạy cùng nhau trong một làn của gel giải trình tự polyacrylamide Một cảmbiến laser bốn màu sẽ quét qua các đoạn di chuyển trong gel Tín hiệu huỳnhquang của từng đoạn sau đó được gửi tới một máy tính với phần mềm đượcthiết kế để nhận diện các base Phương pháp này được thương mại hóa vàonăm 1987 bởi Applied Biosystems Năm 1987, Prober và cộng sự [79] đã cảitiến quá trình này trong đó thay vì gắn huỳnh quang vào mồi, họ gắn tín hiệuvào chính các kết thúc dideoxy, với hệ thống phát hiện này, phản ứng giảitrình tự có thể được thực hiện trong một ống duy nhất với tất cả bốn loạiddNTP và quá trình đọc trình tự được thực hiện chỉ trong một lần điện di gelduy nhất.Đây là công nghệ chính được sử dụng để lập trình ban đầu của hệgen người.

Sự tiến bộ trong công nghệ giải trình tự DNA đã đưa đến sự phát triểncủa kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới (NGS) So với trình tự Sanger truyềnthống, NGS cho phép giải trình tự 100 mẫu đồng thời trên mỗi lần chạy, NGScho phép hàng triệu đoạn DNA được sắp xếp cùng một lúc Và đặc biệt, NGScho phép sàng lọc các lệch bội nhiễm sắc thể với ưu điểm vượt trội hơn so vớicác phương pháp truyền thống: đó là sử dụng DNA thai tự do lưu hành trongmáu mẹ (cffDNA), cffDNA chiếm 3-13% tổng số cfDNA trong máu mẹ, cóthể phát hiện sớm từ tuần thai thứ 7 và biến mất nhanh chóng ngay vài giờ saukhi sinh cffDNA này có thể được xác định và định lượng thông qua kỹ thuậtNGS [100]. Thủ thuật chọc hút dịch ối hay sinh thiết gai rau thu được dịch ối

và gai rau cũng chứa DNA thai nhi, tuy nhiên đòi hỏi cách tiếp cận lấy mẫuxâm lấn, có thể có nguy cơ sảy thai Do vậy, sử dụng cffDNA trong máu mẹ

an toàn cho thai nhi, giảm thiểu nguy cơ sảy thai so với thủ thuật xâm lấn

3.1 Các công nghệ giải trình tự NGS hiện nay

Công nghệ NGS nổi bật trên thị trường hiện nay bao gồm Illumina (SanDiego, CA), Roche Diagnostics (Indianapolis, IN), và Life TechnologiesCorporation (Carlsbad, CA) với các hệ thống tương ứng HiSeq/MiSeq, 454 vàcác hệ thống SOLiD/Ion Torrent (bảng 3)

Illumina cung cấp hệ thống giải trình tự với giá từ 200000 đến 700000

USD Hệ thống HiSeq lần đầu tiên xuất hiện trong năm 2009 và được sử dụngcho các ứng dụng đọc nhanh, nhưng vào năm 2011, Illumina đã cho ra đờimột thiết bị phản ứng nhanh hơn đó là hệ thống MiSeq Các hệ thống dữ liệucao của Hiseq có thể mất đến 14 ngày để giải trình tự, trong khi giải trình tựbằng MiSeq có thể cho kết quả trong vòng 27 giờ Ngoài ra, nhiều loại hệthống được sản xuất bởi Illumina có thể mang lại từ 1 đến 600 Gb mỗi lầnchạy Các hệ thống của Illumina sử dụng công nghệ giải trình tự tổng hợp

"sequencing by synthesis- SBS" Công nghệ giải trình tự tổng hợp SBS sửdụng 4 nucleotide đánh dấu huỳnh quang để giải trình tự hàng chục triệucluster đồng thời trên bề mặt flow-cell trong 1cm2 Trong mỗi chu trình giảitrình tự, một deoxynucloside triphosphate đánh dấu (dNTP) được thêm vàochuỗi acid nucleic Nhãn huỳnh quang của nucleotide đóng vai trò như mộtkhóa dừng phản ứng polymer hóa, do đó sau khi mỗi dNTP được tích hợp,nhuộm huỳnh quang được ghi lại để xác định nucleotide và sau đó bị cắt bỏ đểtổng hợp nucleotide tiếp theo Vì cả 4 loại dNTP gắn khóa dừng tổng hợp thuậnnghịch có mặt đồng thời dưới dạng đơn phân tử, sự cạnh tranh ngẫu nhiên giúpgiảm thiểu việc tổng hợp mất cân đối Việc xác định các base dựa vào cường độtín hiệu đo được trong mỗi chu trình, giúp giảm thiểu các sai số thô so với côngnghệ khác Kết quả cuối cùng là trình tự được đọc từng base một với độ chínhxác cao, loại bỏ được các lỗi do đặc thù trình tự, cho phép quá trình giải trình

tự mạnh mẽ trên toàn bộ genome, bao gồm các trình tự lặp lại [80] Công nghệgiải trình tự trên hệ thống Illumina được thể hiện ở hình 14:

Hình 14: Giải trình tự trên hệ thống Illumina

Roche với hệ thống giải trình tự 454 dựa trên công nghệ

pyrosequencing và sử dụng PCR nhũ tương để chuẩn bị mẫu [81].Pyrosequencing dựa vào khả năng phát hiện phân tử pyrophosphate được giảiphóng ra mỗi khi 1 dNTP được lắp ghép vào chuỗi DNA đang được tổng hợpnhờ các phản ứng enzyme Để giải trình tự, trước hết mẫu được tạo thànhngân hàng DNA sợi đơn và gắn adapter (oligonucleotide) ở hai đầu, sau đóđược liên kết với các oligonucleotide trên bề mặt của các vi hạt Sepharose tạođiều kiện thuận lợi cho bước khuếch đại các sợi đơn thành hàng triệu bản saoDNA sợi đơn bao xung quanh vi hạt nhờ phương pháp ePCR Vi hạt-DNAđược đưa lên các giếng của đĩa picotiter để đọc trình tự Trong giếng có cácenzyme (ATP sulfurylase, luciferase, DNA polymerase, apyrase) và các cơchất (luciferin, adenosine 5’ phosphosulfate (APS)) Bốn loại dATP, dTTP,dGTP và dCTP sẽ được bổ sung vào tuần tự, DNA polymerase sẽ tiến hànhtổng hợp DNA sợi mới dựa vào sợi khuôn Khi dNTP đầu tiên được lắp ghépvào bổ sung với sợi khuôn sẽ giải phóng ra một phân tử pyrophosphate.Pyrophosphate sẽ được chuyển thành ATP nhờ ATP sulfurylase khi có mặt củaAPS Luciferase sẽ sử dụng ATP để oxy hóa luciferin dạng oxy hóa thànhdạng khử và phát ra ánh sáng Ánh sáng này được camera chuyên dụng CCD