Xác định đột biến trên một số exon của gen GAA trên bệnh nhân pompe bằng kỹ thuật giải trình tự gen sanger

BỌ GIÁO DỤC VÀ DÀO TẠO TRƯỜNG DẠI HỌC V HÀ NỘI BỌ Y TÉ PHẠM HÀ TỦ ANH XÁC ĐỊNH ĐỘT BI ÉN TRÊN MỘT SÓ EXON CỦA GEN GAA TRÊN BÊNH NHÂN POMPE BÀNG KỸ THUẬT GIÁI TRÌNH Tự SANGER Ngành đào tạo: Xét nghiệm Y hục Mà số : 52720332 KHÓA I.UẬN TÓT NGHIỆP cừ NHÂN Y KIIOA KHÓA 2017-2021 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Vãn Khánh TS Phạm Lê Anh Tuần HÀ NỘI- 2021 TM/ V*: I ỜI CÁM ƠN Đê hoàn thành khóa luận em xin bày to lịng kính trọng biết ơn sáu sắc tói: - PGS.TS Trần Vân Khánh - Trưởng Bộ môn Bệnh học Phân tư Khoa Kỳ thuật Y học, Phó Giám dốc Trung tâm nghiên cửu Gen-Protcin Trường Dại học Y Hà Nội tận tính hướng dần truyền đạt cho tơi nhùng kiên thức, phương pháp nghiên cửu khoa học vô củng quý giá: động viên tạo diều kiện tốt cho suốt trỉnh thực luận vân - TS Phạm Lé Anh Tuấn, TS Nguyễn Hoàng Việt - giáng viên Bộ môn Bệnh học Phân tư Khoa Kỳ thuật Y hục Trường Đại Học Y Hà Nội người Thầy dành nhiều tâm sức tạo, hướng dàn động viên giúp dờ đè em có dược kiến thức giá trị suốt thời gian hục tập vã thực nghiên cứu I lơn tất ca thầy dã dạy cho em kiến thức chuyên môn phương pháp nghiên cứu khoa hục tài sàn mà em có dược vả giúp ích cho em nhửng chặng đường tièp theo Em xin tràn trọng cam ơn Ban Giám hiệu, Phỏng Quan lý Dâo tạo dại học trường Dại học Y Hà Nội đà tạo diều kiện cho em dược lãm hồn thành khóa luận Em xin trân trọng cam ơn anh chị Trung Tàm Nghiên cứu Gen Protein dã dành cho em tính cam quý mến dộng viên kịp thời, hồ trợ chia sc cõng việc vã trinh học tập Cuối cùng, em xin dưực bây tó lịng biết ơn sảu sắc dền Cha Mẹ nhùng người thân gia đính dà thưởng xuyên động viên, khích lộ tạo cho em nguồn dộng lực giúp em chuyên tâm học tập nghiên cứu không ngừng phấn dấu Xin cam ơn bạn bè đà chia se giúp đờ em mặt trinh học tập hoàn thành luận vàn tốt nghiệp Hà Nội tháng năm 2021 Sinh viên Phạm Hà Tú Anh Cộng Hòa Xã Hội Chù Nghĩa Việt Nam TM/ V*: Độc lập - Tự - Hạnh phúc LỜI CAM ĐOAN Kính gũi: Phỏng quăn lý Đào tạo Dại Học - Trường Đại Học Y Hà Nội Hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp Tơi tên lã Phạm Hà Tủ Anh sinh viên tó 31 lớp Y4K, chuyên ngành Cứ nhãn Xét Nghiệm Y Học niên khóa 2017 - 2021 trưởng Đại Học Y Hả Nội xin cam đoan: Đây luận ván tòi trực tiếp thực hướng dần cua PGS.TS Trằn Vân Khánh - Trưởng Bộ môn Bệnh học Phân tư Khoa Kỳ thuật Y học Phó Giám đỗc Trung tâm nghiên cứu Gcn-Protein Trường Đại học Y Hả Nội TS Phạm Lê Anh Tuấn - giang viên Bộ môn Bệnh học Phân tư Khoa Kỳ thuật Y học, Trường Đại Học Y Hà Nội Các số liệu vả thõng tin nghiên cửu xác trung thực vã khách quan, đà dược xác nhận vã chấp thuận cua sơ nơi nghiên cứu Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật nhừng cam kết I Nội, tháng nâm 2021 Sinh viên Phạm Hà Tú Anh TM/ V*: MỤC LỤC LỜI CAM DOAN LỜI CÂM ƠN DẠT VÁN DÈ _ CHƯƠNG I: TỎNG QUAN 1.1 Bệnh Pompe 1.1.1 Đặc diêm dịch tề hục bệnh Pompe 1.1.2 Di truyền học bệnh Pompe 1.1.3 Cơ chế bệnh sinh 1.1.4 Chân đoán phân loại bệnh 1.1.5 Diều trị bệnh Pompe 11 1.6 Phòng ngừa bệnh 12 1.2 Enzym acid alpha-glucosidase 13 1.3 Gen OU 15 1.4 Các kỳ thuật sinh học phân tư sứ dụng xác định đột biến 17 1.4.1 Phương pháp phan ứng chuồi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction) .17 1.4.2 Kỳ thuật giai trình tự gen Sanger 20 CHƯƠNG 2: DÔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cút 23 2.1 Đối tượng nghiên cứu 23 2.1.1 Đối tượng nghiên cữu 23 2.2 Thời gian dịa diem 23 2.3 Dụng cụ trang thiết bị hóa chất nghiên cứu 23 2.3.1 Dụng cụ vả trang thiết bị 23 2.3.2 Hóa chất dũng nghiên cứu 24 2.4 Phương pháp nghiên cữu 26 2.4.1 Thiel kc nghiên cứu 26 2.4.2 Sơ đo nghiên cửu 27 2.4.3 Quy trình nghiên cứu 27 2.5 Xứ lỷ phân tích số liệu 34 2.6 Đạo đúc nghicn cứu 34 CHƯƠNG 3: KÉT QUẢ NGHIÊN cứu .- .35 3.1 Đặc đícm chung cùa đối ttrợng nghiên círu 35 3.2 Kết tách chiết DNA .35 3.2.1 Kct kiểm tra bàng phương pháp đo quang 35 3.2.2 Kết qua điện di DNA tòng số 37 3.3 Kct phan ứng PCR khuếch đại đoạn gen G.-L4 3S 3.4 Ket qua phân tích đột biền cxon 5, 14 cúa gen GAA .41 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN .46 4.1 Dặc diêm chung cua doi tượng nghiên cứu 46 TM/ V*: 4.2 Ket qua tách chiết DNA .47 4.3 Ket qua phan ứng PCR .48 4.4 Ket qua giai trinh tự cxon 14 cua gcn GAA kỳ thuật giai trinh tự Sanger 50 4.4.1 Dột biến vùng cxon 14 gcn GAA vã mối liên quan với nghiên cứu giới .51 4.4.2 Dột biển vùng exon gen GAA vã mồi liên quan với nghiên cứu trẽn giới .53 4.4.3 Dột biến vùng exon gen GAA vã mối liên quan với nghiên cửu tren the giới .54 KÉT LUẬN 55 TÀI LIỆU THAM KHÁO PHỤ LỤC DAXII MỤC BÁNG Bang 2.1 Trinh tự mồi khuếch dại cxon 2.5, 14 cua gcn GAA 25 Bang 2.2 Thành phần phân ứng PCR 31 Bang 2.3 Thành phần phán ứng PCR giãi trinh tự .33 Bang 3.1 Kết qua đo nồng độ vả độ tinh cua mẫu PI-P10 trẽn mây Nanodrop 2000c .36 Báng 3.2 Đột biến gcn GAA cùa 10 bệnh nhân IOPD .44 TM/ V*: - DANH MỤC BI ÉC DÒ Biêu dỏ 1.1 Tân suâl cùa alcn dội biên gen GAA 17 DANH MỤC IIÌMI Hình I I Sơ đồ di truyền Bệnh Pome Hình 1.2 Quá trinh hình thành cnzym GAA người bính thường 14 Hỉnh 1.3 Quả trinh hình thành cnzym GAA bệnh nhãn Pompe .14 Hỉnh 1.4 Vị trígen GAA NST người 16 Hình 1.5 Minh họa giai trinh tự gcn gel 21 Hình 1.6 Minh họa giai trinh tự gen hộ thống máy tự dộng 22 ỉlính 2.1 Sơ đồ minh họa cập mồi khuếch đại đoạn cxon 14 cùa gcn GAA 25 Hỉnh 3.1 Kết nồng độ độ tinh cua mầu P6 35 I lỉnh 3.2 Kcl qua diện di DNA tông sổ 37 I linh 3.3 Kết diện di sán phàm PCR exon 2.1 cùa gcn GAA 38 Hình 3.4 Kct diện di sán phàm PCR cxon 2.2 cùa gcn (ỉ A A 39 Hỉnh 3.5 Kct điện di san phàm PCR cxon cùa gen GAA .39 Hình 3.6 Kết qua điện di san phàm PCR exon 14 cua gen GA A 40 Hình 3.7 Hình anh dại diện cho dột biến Arg40* exon gen GAA bang kỳ thuật giãi tành tự gcn (bệnh nhãn P4) 41 Hình 3.8 Hình ánh đợi diện cho đột biển Asp645His/Asn cxon 14 gcn GAA kỳ thuật giai trinh tự gen (bệnh nhân P8) .42 llính 3.9 Ilính anh dại diện cho đột biến C.2O4O+1G>T cxon 14 gen GA A bang kỹ thuật giãi trinh tự gcn (bệnh nhân P9) 43 DANH MỤC CÁC CHỬ VIẾT TÁT : Complementary DNA (DNA bô sung) cDNA : Dried Blood Spot (vet mâu khô) DBS : dideoxy nucleotide dđNTP : Enzym Enhancement Therapy (liệu pháp tãng cưởng enzym) EET : Enzym Replacement Therapy (liệu pháp thay the enzym) ERT : Enzym acid alpha-glucosidase GAA : Gen mà hỏa enzym acid alpha-glucosidase GAA : Tetrasaccharide glucose niệu Glc4 : Glycogen storage disease type 11 (bệnh dự trử glycogen typ II) GSD-ĨI : Glycogen storage disease (các bệnh liên quan đen dự trữ glycogen) GSDs : Hematopoietic stem cell transplantation (ghép tế bâo gổc tạo máu) : Infantile-onset Pompe disease (bệnh Pompe khơi phát sớm) HCT : Late-Onscl Pompe Disease (bệnh Pompe khơi phát muộn) : Nhiễm sẳc thè IOPD : The recombinant human GA A (enzym GAA tái tố hợp người) LOPD NST : Substrate Reduction Therapy (liệu pháp giam chất) rhGAA : Temperature melting (nhiệt độ nóng chay) SRT Tin ĐẠT V ÁN ĐÈ Glycogen đại phân lử polysaccharide đa nhánh cùa glucose hình thành tích trừ yếu tế bào cua gan đỏng vai trò nguồn dự trừ lượng làu dài người Tuy nhiên, nhùng loại dường dự trử dạng glycogen cần phai dirực xử lý thông qua cnzym chuyên hóa trước có thê sứ dụng, thiếu hụt cnzym cần thiết sè dẫn tới việc glycogen chất chuyển hóa trung gian tích tụ lại qua thời gian sè gây nhiều rối loạn, diên nhùmg ánh hướng đến gan, thận, xương, lim chí hệ thần kinh trung ương2 Các bệnh liên quan đến dự trừ glycogen (GSDs) nhóm rối loạn di truyền gập đậc trưng bời việc glycogen không thê chuycn hóa thành glucose mỏ thiêu hụt số cnzym tham gia dường phán giái glycogen3 Bệnh Pompe dược xếp vào GSDs loại II (GSD-II) gây bơi thiếu hụt enzvm acid alpha-glucosidasc (GAA) dần tới tích tụ glycogen tiêu thè (lysosome) vã cân bệnh di truyền nguy hiêm Bệnh mỏ ta lần dầu bơi bâc si' người I Lan JC Pompe bệnh nhi vào năm 1932’ Nguyên nhân gây thiếu hụt enzym GAA đột biển trẽn gen mà liõa enzym GAA, trực tiếp anh hường đến trinh hoạt dộng cua cnzym làm cho khơng hoạt dộng, hoạt dộng kẽm không the kết hợp dược với chất Vùng mà hóa trung tâm hoạt động cùa enzyrn nằm exon dó dột biến vùng gây anh hương trực tiếp đến hoạt dộng cùa enzym Dựa vào nghiên cứu dân sổ Thài Lan Trung Quốc, sàng lục dột biến cua exon 14 mang lại tỷ lệ phát 62% (21/34) Từ nhùng dần chứng ke trên, lựa chọn vùng cxon 14 dê nghiên cứu bơi tàm quan trọng cùa vùng tới hoạt động cùa cnzym tần suất xuất đột biến vị trí theo nghiên cửu dà dược còng bố trước Tất cá cán trờ phân giãi glycogen thành glucose Qua thời gian, glycogen bat đau tích tụ cãc loại mơ, TM/ V*: - yếu xương, trơn lim nơi gây tốn thương cẩu trúc chức nãng cua mô5 Bệnh nhân Pompe thirờng gặp triệu chứng giam trương lực nặng yếu dần gặp khó khăn di lại nhiều bệnh liên quan den tim Bệnh có tiên lượng xấu tiền triển nhanh chõng, tre em thường chết ví suy tim suy dường hơ hap trước tuổi6 Pompe loại bệnh gặp với ti lộ mắc khoang từ 1:14.000 đến 1:300.000 phụ thuộc vảo chung tộc vùng địa lý Ớ Việt Nam chưa có số xác ti lệ người mẳc bệnh ca bệnh dơn lé vần đưực ghi nhận diều trị bệnh viện nhi tồn quổc Có nhiều phương pháp khác đè chân đoán xác định bệnh Pompc như: đo hoạt tính GAA nguyên bão sợi da sinh thiết mỏ kiêm tra hoạt tính GAA từ vết máu khỏ xêt nghiệm gen Trong dó xét nghiệm gen lã tiêu chuẩn vàng dê chân đoán bệnh nhùng quốc gia dang phát triền mà xct nghiệm hoạt độ chưa phô biển rụng rãi s Tại Việt Nam vỉ điều kiện y khoa giới hạn chân doán xác định bệnh nhân Pompc chi dựa vào triệu chửng lâm sàng - da số lại không đặc trưng cho bệnh dẫn dến nhiều trường hợp bị chân đốn nhầm Them vảo dó việc xảc định dột biến gen cần thiết cho việc tiến lới diều trị bênh theo liệu pháp cá thê diên hình liệu pháp enzym thay (The recombinant human GAA rhGAA) hứa hẹn kéo dãi tuổi thọ cai thiện chất lượng sống cùa bệnh nhản Xuắt phát từ điều kiện thực tế mong muốn làm sáng lo đột biển gcn gây bệnh Pompe phục vụ cóng tác chan đoản Dồ tài: “Nghiên cứu Xác định dột biến trẽn số cxon cua gen GAA trẽn bộnh nhân Pompe bang kỹ thuật giai trinh tự gcn" dược thực nham mục dích: Xác định dột biển vùng exon 2, 14 gen 6/L-í bệnh nhân Pompe TC V*: 44 dổi với sàn phấm khuếch đại đoạn gen cỏ chứa exon cần xác định, có kích thước phù hợp khơng bị nhiềm sán phấm phụ dạt du nồng dộ cho phán ứng tiếp Kct PCR phụ thuộc vào nhiều yếu tổ như: nống độ chất lượng DNA mầu nồng độ thiết ke cua nồng độ ion Mg2*, nồng dộ dNTP Taq DNA polymerase, hệ thống đệm chu trinh nhiệt Chi cần sai sót nhị có thê dẫn den phán ứng thất bại Trong nghiên cửu sừ dụng Gotaq master mix promega, dược sán xuắt kèm theo hệ thống đệm vơi pl I thích hụp dó cỏ chửa Mg :* dNTPs vói nồng độ phù hợp giúp rút ngấn thời gian phan ứng không phái qua nhiều thao tác thu công, giam kha tạp nhiễm trinh thao tác Mỗi thành phàn quan trọng phán ứng PCR Moi nhóm nghiên cửu sư nghiên cứu tham kháo theo nghiên cứu “Nghiên cứu dột biên trẽn gen GAA bệnh nhân Pompe Brazil’’15 Chúng tỏi tiến hãnh kiêm tra lại tính dộc hiệu bang chương trinh Blast-Primer trẽn NCBI dè khắng định kha gắn đặc hiệu cua cộp mồi Trong trinh thí nghiệm, chúng tơi dà lien hành thư nghiệm nhiệt độ gan mõi tot nhai theo khuyến cáo cùa nhà sán xuất Gotaq 2X Cho phan ứng PCR bàng câch chạy gradient nhiệt dộ từ 55°c đến 65°c chọn nhiệt độ gán mồi 58°c nhiệt độ mà đõ vạch san phâm PCR dóng kích thước mong dợi dộ sáng cua vạch san phẩm rị nhắt vã lã vạch nhất, khơng có bàng phụ Thực khuếch dại 10 mầu DNA bệnh nhàn Pompe dạt yêu cầu theo dủng quy trinh với nhiệt độ gắn mồi dà thư nghiệm De kiềm tra săn phẩm cùa phan ứng PCR tất ca san phấni PCR dược diện di kiêm tra trẽn gel agarose 1.5% Tất cá sán phâm PCR nghiên cứu đù tiêu chuẩn tiến hành phan ứng giải trinh tự Sangcr trcn hình anh điện di có bâng DNA nhát sáng rị nét khơng cỏ bàng phụ vã kích thước cua vạch diện di san phẩm PCR so thang DNA chuẩn 420bp dối với cxon 2.1 424bp với exon 2.1 618bp cxon 415bp dối với cxon 14, tất ca phù TM/ GẠ: • -U 45 hợp vói thiết ke mồi Kiếm sốt sai sót lỊiiá trinh thực phán ứng PCR Hiện tượng âm tính giá: Âm tính gia tượng có the bị nhiêm chất ức chế phan ứng trinh thao lác Các chất chất ngoại lai lây nhiễm trinh thao tác tồn dư thành phần cùa phán ứng PCR như: DNA tơng số Bên cạnh dó số trường hợp thao tác kỳ thuật chưa chuẩn xác làm thiếu hóa chắt, thay đỗi diều kiện mơi trường phan ứng ong mastermix dần đen phan ứng PCR không xay Đê trành tượng tiến hành phan ứng PCR nên sư dụng chửng nội chuẩn Chứng nội chn phai ln lên vạch với kích thước mong muốn ỡ tất ca mẫu Mau coi âm tính gia mà ca san phẩm khuếch đại cua gcn đích vã gcn nội chn đểu khơng lẽn vạch, coi lã âm lính thật mã san phâm khuếch dại cua gen đích khơng len vạch cịn gcn nội chuấn thỉ vần Tuy nhiên nghiên cửu khơng sứ dụng chứng nội chn bời san phàm PCR sư dụng dê lãm nguyên liệu cho phan ứng chử khơng phai chắn đốn Thay vào dó chủng tỏi sứ dụng mầu DNA dã dược sử dụng dê khuếch dại đoạn PCR thành cõng trước dó lãm chửng dương Chứng dương lên với hình anh I vạch dặc hiệu, sáng rô dam bao điều kiện hoạt dộng cua me phan ứng PCR xay thuận lựi Hiện tượng dương tính gia: Một mẫu PCR dược coi lã dương tính gia hai san phẩm khuếch dại cùa gcn đích gen nội chuẩn mầu chứng âm cho kết qua dương tính Ngược lại mầu coi lã dương tính thục khơng có sán phẩm khuếch dại cua cá gen đích gcn nội chuẩn màu TM/ V*: - 46 đối chứng âm Nguyên nhân có the lây nhiem DNA tử mẫu duơng vào hóa chất tham gia phán ứng như: mồi đệm dNTP nước cat dụng cụ thí nghiệm Một nguyên nhân khác lã nhiễm ban dương tính từ lần xét nghiệm trước vào lần xét nghiệm sau thông qua trinh diện di Đế phát dương tính giá cần tiến hành kỳ thuật PCR có mầu chứng âm (là mẫu nước tinh thay cho DNA khuôn) Tất sân phàm khuếch đại sân phẩm PCR nhóm nghiên cứu sư dụng chửng âm nhằm dâm báo khơng có cãc tượng nhiễm tạp DNA ngoại lai sán phẩm khuếch đại đoạn gcn đích cùa bệnh nhân Các sán phàm PCR cua nhôm nghiên cứu dại yêu cầu mỏi lẩn diện di kiêm tra gel agarose 1.5% 4.4 Kot giãi trình tự exon 14 cùa gen G.4.4 kỹ thuật giãi trình tự Sanger Nghiên cứu cùa tịi đà ứng dụng thành công kỹ thuật giai trinh tự gen Sanger dê xác định dột biền gen G.4J Bước giai trinh lự tự động, đoạn DNA đích dược nhàn lẽn từ trình PCR sè dược tiến hành PCR giai trinh tự lần PCR chi cỏ lã mồi xuôi mồi ngược vã cô thêm ddNTPs de thu dược san phàm mạch cua DNA với độ dâi khác Sau dó hệ thống máy giai trinh tự sê cho ta kết qua sau khoang thời gian 40 - 120 phủl/1 hàng phụ thuộc kích thước san phàm cằn chạy Hiện nay, ngồi kỳ thuật giai trinh tự gen Sanger, cỏ rắt nhiều phương pháp xác định dột biên gen kỳ thuật real-time PCR Scoipion ARMS (Scorpion Amplification Refractory Mutation System, giãi trinh tự gen thể hộ NGS Tuy nhiên, giai trinh tự Sanger vàn phương pháp tốt đê xác định xác dột biến phân đoạn cần phân tích, đặc biệt phù hợp cho nghiên cửu chua xác định dược dột biến gcn liên quan dền bệnh lý quan tàm Một nhược diêm cua giai trinh tự gen Sanger khó có thê phân lích nhiều dột biến nhiều gen nhiều mầu khác lúc Nhưng nghiên cửu số lượng nho đột biến cùa gen ví dụ nghiên cứu lằn gen GJJ việc sứ TM/ V*: dụng giái trinh tự gen Sanger vần phù hT với I (1/10) bệnh nhân mang alendột biến TÀI LIỆU THAM KHÁO Sadava D Life: The Science of Biology Sunderland: Sinaucr Associates; 2011 Accessed April 26 2021 http://archive.org/details/isbn_9781429255417 Hicks J Wartchow E Mierau G Glycogen storage diseases: a brief review and update on clinical features, genetic abnormalities, pathologic features, and treatment Ultrastruct Pathol 201l;35(5):183-196 Ozen H Glycogen storage diseases: new perspectives World J Gastroenterol 2007; 13( 18):2541-2553 doi:10.3748Avjg.v 13.i 18.2541 POMPE JC Oxer idiopatliische hypertrophic van het halt Ned Tijdschr Geneeskd 1932;76:304-311 Martiniuk F Chen A Mack A et al Carrier frequency for glycogen storage disease ripe II in New York and estimates of affected individuals bom with the disease Am J Med Genet 1998;79(l):69-72 doi: 10.1002/(sici)l 0968628(19980827)79:1 3.0.co;2-k Kishnani PS Steiner RD Bali D et al Pompe disease diagnosis and management guideline Genet Med 2006:8(5): 267-288 Van der Kraan M Kroos MA Joosse M et al Deletion of exon 18 is a frequent mutation in glycogen storage disease type II Biochem Biophys Res Commun 1994;203(3):1535-1541 Hirschhom R Huie ML Frequency of mutations for glycogen storage disease type II in different populations: the delta525T and deltaexon 18 mutations arc not generally “common" in white populations J Med Genet 1999:36(1 ):8586 Dasouki M Jawdat o Almadhoun o et aL Pompe Disease: Literature Review and Case Series Neurol Clin 2014:32(3):751-776 10 Genetics of Glvcogen-Storage Disease Type n (Pompe Disease): Background Pathophysiology Epidemiology Published online March 2021 Accessed May 17 2021 https://emedicine.medscape.contfarticle/947870-overview 11 Lin CY Hwang B Hsiao KJ Jin YR Pompe’s disease in Chinese and prenatal diagnosis by determination of alpha-glucosidase activity J Inherit Metab Dis 1987;10(l):l 1-17 12 Poorthuis BJ Wevers RA Kleijer \VJ et al The frequency of lysosomal storage diseases in The Netherlands Hum Genet 1999:105(1-2):151-156 13 Kishnani PS Hwu W-L Mandel H et al A retrospective multinational, multicenter study on the natural history of infantile-onset Pompe disease J Pedtatr 2006:148(5)1671-676 doi: 10.1016/j.jpeds.2005.11.033 14 Colella p Mingozzi F Gene Therapy for Pompe Disease: The Time is now Hum Gene Tha\ 2019:30(10):1245-1262 15 Turaẹa LT de Faria DOS Kyosen so et al Novel GAA mutations in patients with Pompe disease Gene 2015;561(l):124-131 16 Pompe - Bệnh rối loạn chuyên hỏa gặp khiến trc chét dần Accessed April 2021 hnps:/A-iencongnghedna.com.vn'pompe-benh-roi-loan- chuyen-hoahiem-gap/ 17 Griffin JL Infantile acid maltase deficiency I Muscle fiber destruction after lysosomal rupture PlrdỉOMts Arch B Cell Pathol Incl Mol Pathol 1984;45(l):23-36 18 Fukuda T Roberts A Plotz PH Raben N Acid alpha-glucosidase deficiency (Pompe disease) Curr Neurol Neurosci Rep 2007:7(1 ):71-77 19 Fukuda T Roberts A Ahearn M et al Autophagy and lysosomes in Pompe disease Autophagy 2006;2(4):318-320 doi:10.4161/auto.2984 20 Terman A Catabolic insufficiency and aging Ann N Y Acad Sei 2006:1067:27-36 21 Preisler N Laforet p Madsen KL et al Fat and caibohydrate metabolism during exercise in late-onset Pompe disease Mol Genet Metab 2012;107(3):462-468 doi:10.1016/j.ymgme.2012.08.019 22 van der Plocg AT, Reuser AJJ Pompe's disease Lancet Load Engl 2008:372(9646): 1342-1353 23 van den Hout HMP Hop w van Diggelen OP et al The natural course of infantile Pompe's disease: 20 original eases compared with 133 cases from the literature Pediatrics 2003:112(2):332-340 24 Kien VD Van Minh H Giang KB Mai VQ Tuan NT Quam MB Trends in childhood measles vaccination highlight socioeconomic inequalities in Vietnam Int J Public Health 2017;62(Suppl l):41-49 25 Ing RJ Cook DR Bengur RA et al Anaesthetic management of infants with glycogen storage disease type II: a physiological approach Paediatr Anaesth 2004:14(6):514-519 doi: 10.1111/j 1460-9592.2004.01242.x 26 Dreyfus JC Poenaru L White blood cells and the diagnosis of alphaglucosidase deficiency PediatrRes 1980:14(4 Pt l):342-344 27 Porto c Cardone M Fontana F et al The Pharmacological Chaperone Nbutyldeoxynojirimycin Enhances Enzyme Replacement Therapy in Pompe Disease Fibroblasts Mol Ther 2009:17(6):964-971 28 Orchard PJ Blazar BR Wagner J Chamas L Krixit w Tolar J Hematopoietic cell therapy for metabolic disease J Pediatr 2007:151(4):340-346 29 Suzuki Y Chemical chaperone therapy for GM 1-gangliosidosis Cell Mol Life Set CMLS 2008;65(3):351-353 doi:10.1007/s0001S-008-7470-2 30 Matsuda J Suzuki o Oshi ma A et al Chemical chaperone therapy for brain pathology in G(Ml)-gangliosidosis Proc Natl Acad Sci ISA 2003; 100(26): 15912-15917 31 Tropak MB, Reid SP Guiral M Withers SG, Mahuran D Pharmacological enhancement of beta-hexosaminidase activity in fibroblasts from adult Tay- Sachs and Sandhoff Patients J Biol Client 2004:279(14): 13478-13487 32 Maegawa GHB, Tropak M Buttner J et al Pyrimethamine as a potential pharmacological chaperone for late-onset forms of GM2 gangliosidosis J Biol Client 2007:282(12):9150-9161 33 Butters TD Dwek RA Platt FM Imino sugar inhibitors for treating the lysosomal glycosphingolipidoses Glycobiology 2005;15(10):43R-52R 34 Schmutzler AG Theory and practice of preimplantation genetic screening (PGS) EurJMed Genet 2019:62(8): 103670 35 Pôs o Budis J Szcmes T Recent trends in prenatal genetic screening and testing FlOOOResearch 2019:8 36 Bodamer OA Scott CR Giugliani R Pompe Disease Newborn Screening Working Group Newborn Screening for Pompe Disease Pedianics 2017; 140(Suppl 1):S4-S13 37 Chien Y-H Hwu W-L Lee N-C Pompe disease: early diagnosis and early treatment make a difference Pediatr Neonatol 2013:54(4):219- 227 38 Acid alpha-glucosidase In: Wikipedia ; 2020 Accessed April 2021 https://en.wikipedia.org'w/index.php?title=Acid_alphaglucosidase&oldid=992 236150 39 Adeva-Andany MM Gonzalez-Lucan M Donapetry-Garcia c FernandezFernandez c Ameneiros-Rodriguez E Glycogen metabolism in humans BBA Clin 20165:85-100 40 Hoefsloot LH Hoogeveen-Westerveld M, Reuser AJ Oostra BA Characterization of the human lysosomal alpha-glucosidase gene BiochemJ 1990;272(2):493-497 41 Marti niuk F Mehler M, Tzall s, Meredith G Hirschhorn R Sequence of the cDNA and 5’-flanking region for human acid alpha-glucosidase, detection of an intron in the 5' untranslated leader sequence, definition of 18-bp polymorphisms, and differences with previous cDNA and amino acid sequences DNA Cell Biol 1990:9(2):85-94 42 Raben N Plotz p Byrne BJ Acid alpha-glucosidase deficiency (glycogenosis type II Pompe disease) Ctor Mol Med 20022(2): 145-166 43 lysosomal alpha-glucosidase preproprotein [Homo sapiens] - Protein NCBI Accessed April 15, 2021 https://www.ncbi.nlm.nih.gav/proteinNP_000143.2 44 Enzvm In: Wikipedia tieng Việt ; 2021 Accessed April 15 2021 https:/A'i.wikipedia.org'w/inde.x.php?title=Enzym&oldid=64652894 45 Feizi T Larkin M AIDS and glycosylation Glycobiology 1990:1(1): 17- 23 46 HGMD® home page Accessed April 15 2021 http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/ 47 Peruzzo p Pavan E, Dardis A Molecular genetics of Pompe disease: a comprehensive overview Ann Transl Med 2019;7(13):4-4 48 Phan ứng chuồi polymerase In: Wikipedia tiếng Việt ; 2021 Accessed April 16, 2021 hnps://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Ph%E 1%B A%A3 n_%E %BB %A9ng_chu%E %BB%97i_polymerase£oldid=6454 2845 49 PCR - thảnh phần quan trọng cần hicu cho dũng Sinh Học Online Published December 21, 2018 Accessed April 16, 2021 https://tapchisinhhoc.convpcr-6-thanh-phan-quan-ưong-can-hieu-chođung.html/ 50 Giai trinh lự bang phương pháp Sanger Accessed April 16 2021 htt ps://genti s com vn/giai-tri nh-tu-bang-phuong-phap-s anger-d39 51 Ngiwsara L, Wattanasirichaigoon D, Tim-Aroon T et al Clinical course, TM/ V*: mutations and its functional characteristics of infantile-onset Pompe disease in Thailand 5.UC Med Genet 2019;20(l):l 56 52 Kroos MA Mullaart RA Van Vliet L et al p.[G576S; E689K): pathogenic combination or polymoiphism in Pompe disease? Eur J Hum Genet EJHG 2008;16(8):875-879 53 Lin CY Shieh JJ Identification of a de Novo point mutation resulting in infantile form of Pompe’s disease Biocheni Biopins Res Commun 1995;213(1):367 54 Huie ML Tsujino s, SWower Brooks s et al Glycogen storage disease type II: identification of four novel missense mutations (D645N G648S R672W R672Q) and two insertions'deletions in the acid alphaglucosidase locus of patients of differing phenotype Biodiem Biophys Res Commun 1998:244(3):921-927 d 55 Mm H Ma K J van B Ba o, Aj R Human lysosomal alpha glucosidase Characterization of the catalytic site J Biol Chew 1991;266(21) Accessed May 14 2021 https;//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/1856189/?dopt=Abstract 56 Marti niuk F, Mehler M Bodkin M, et al Identification of a missense mutation in an adult-onset patient with glycogenosis type II expressing only one allele DNA Cell Biol 1991;10(9):681-687 57 Hermans MM de Graaff E Kroos MA et al The conservative substitution Asp-645~>GIu in lysosomal alpha-glucosidase affects transport and phosphorylation of the enzyme in an adult patient with glycogen-storage disease type II Biochem J 1993;289 ( Pt 3):687-693 58 Shieh JJ Wang LY Lin CY Point mutation in Pompe disease in Chinese JInherit Merab Dis 1994; 17( 1): 145-148 59 Huie ML Chen AS Brooks ss Grix A Hirschhom R A de novo 13 nt deletion, a newly identified C647W missense mutation and a deletion of exon 18 in infantile onset glycogen storage disease type II (GSDU) Hum Mol Genet 1994;3(7):IOS 1-1087 60 Baralle D Baralle M Splicing in action: assessing disease causing sequence changes J Med Genet 2005:42(10):737-748 61 Chien Y-HL Lee N-C, Chen C-A et al Long-term prognosis of patients with infantile-onset Pompe disease diagnosed by newborn screening and treated since birth JPediatr 2015;166(4):985-991.el-2 62 Kroos MA Waitfield AE Joosse M, Winchester B Reuser AJ MacDermot KD A novel acid alpha-glucosidase mutation identified in a Pakistani family with glycogen storage disease type II J Inherit Metab Dis 1997;20(4):5 56558 63 McCready ME Carson NL Chakraborty p et al Development of a clinical assay for detection of GAA mutations and characterization of the GA A mutation spectrum in a Canadian cohort of individuals with glycogen storage disease, type II Mol Genet Metab 2007;92(4):325-335 64 Fukuhara Y Fuji N Yamazaki N et aL A molecular analysis of the GAA gene and clinical spectrum in 38 patients with Pompe disease in Japan Mol Genet Metab Rep 2018:14:3-9 doi:10.1016/j.ymgmr.2017.10.009 PIIỤ LỤC DANH SÁCH BỆNH NHẰN NGHIÊN cứu STT Mà sổ Họ tên Giới ruôĩ Chồn (tháng) đốn p1 Hồng Ngọc D Nừ Pompe P2 Triệu Như T Nữ Pompe P3 Nguyen Minh K Nam Pompe P4 Lê Thanh H Nừ Pompe P5 Nguyen Hoàng K Nam Pompe P6 Phạm Minh Đ Nam Pompe P7 Nguyền Th| Ngọc D Nữ Pompe P8 Nguyền Thị Yen N Nử Pompe P9 Đỏ Minh Q Nam 10 P10 Ngô Thao M Nừ Pompe Pompe XÁC NHẬN CỦA TRUNG TÂM GEN PROTEIN PGS TS TRÀN VÂN KHẢNH Ngươi biuh tliươug TM/ V*: Máu bệnh nhân Hình 3.7 Hỉnh ánh đại diện cho dột biển Arg40* * exon gen GA A bùng kỹ thuật giúi trĩnh tự gen (bệnh nhân P4ị Chủ thích: Arg: Arginine * : mà kết thủc Nhận xét: Đây hình anh dụi diện cho kết qua dột biến Arg40* exon gen GAA kỹ thuật giái trinh tự gcn So sánh trinh tự DNA bệnh nhân với DNA mầu chứng , phát dột biền thay the nuclcotid c thảnh T vị trí 118 cDNA, dần den thay dói acid amin Arginine thành mà kết thúc condon 40 TM/ V*: ... “Nghiên cứu Xác định dột biến trẽn số cxon cua gen GAA trẽn bộnh nhân Pompe bang kỹ thuật giai trinh tự gcn" dược thực nham mục dích: Xác định dột biển vùng exon 2, 14 gen 6/L-í bệnh nhân Pompe TC... Asp645His/Asn cxon 14 gcn GAA kỳ thuật giai trinh tự gen (bệnh nhân P8) .42 llính 3.9 Ilính anh dại diện cho đột biến C.2O4O+1G>T cxon 14 gen GA A bang kỹ thuật giãi trinh tự gcn (bệnh nhân P9) 43... dược biến dơi cấu trúc DNA, lừ dó xác định dột biến Khoang 2952 dột biến vã nhiều biến thê gen GAA dã dưực xảc định vã dưực lập danh mục (https://databases.lovd.nl/shared/genes /GAA/ graphs) việc xác