Ứng dụng kỹ thuật real tiem pcr xác định đột biến gen itga2 và itga3 liên quan đến chứng ưa huyết khối di truyền ở phụ nữ có tiền sử sẩy thai thai chết lưu

-■c -ÍM Qỉ ugc V Hl LỊI CẤM ON Lời đầu liên, tòi xin bây to lòng bict cm sâu sấc vã lời cám cm chân thành lới PíĩS.TS Nguyen Thị Trang, giang viên cao cấp Bộ Y Sinh học Di truyền, trưởng Đại học Y Hà Nội người htrớng dần khoa học cho tòi Cỏ người đà định hướng diu dất tỏi từ nhùng bước đầu tién trẽn dường nghiên cữu khoa học Nhờ cò hướng dần tận tinh, kiến thức quý báu động viên, quan tâm cua cô đà giúp tỏi hỗn tlìảnh khóa luận tốt nghiệp náy Tôi xin chân thảnh cam cm thầy cỏ anh chị nội tnì anh chị kỳ thuật viên Bộ ntơn Y sinh học - Di truyền, trưởng Dili học Y Hà Nội dã chi dạy giúp dờ tỏi rầt nhiều then gian học tập nghiên cửu Bộ mơn Tói xin trân trợng cam em Ban giám hiệu Phòng Dão tạo Dại học Thư viện trưởng Đại hợc Y Hâ Nội tạo diêu kiện thuận lọi cho tơi hỗn thảnh khóa luận Lời cuối cùng, tơi xin gứi lời biết ưn đến bố mẹ gia đính, bạn bè vi dà chỏ dựa tinh thần vừng chắc, khích lệ ung hộ tỏi q trình học tập thực khóa luận Hà Nội ngày 09 tháng 05 nám 2021 Giáp Ánh Tuyết -ÍM CỊỈ ugc V Hl LỜI CAM ĐOAN Tỏi lã Giáp Ánh Tuyết, sinh viên tô s lớp Y6B chuyên ngành Bác sỳ đa khoa, xin cam đoan: Khóa luận tốt nghiệp hồn tồn tơi thực hướng dần cứa PGS.TS Nguyễn Thị Trang Các số liệu kết khóa luận trung thực, khách quan vá chưa lừng công bố trước Nghiên cửu khơng trùng lập vói bất cử nghiên cửu khác đà cõng bồ Việt Nam Hả Nội ngày 09 tháng 05 năm 2021 Giáp Ánh Tuyết -ÍM Qỉ ugc V Hl DANH MỤC CHỦ VIẾT TÁT FIGO WHO ACOG The International Federation of Gynecology and Obstetrics World Health Organization The American College of Hiệp hội Sân phụ khoa thê giới Tô chức Y tẽ thê giới Hiệp hội San phụ khoa Hoa Kỳ Obstetricians and Gynecologists MRI Magnetic Resonance Imaging Chụp cộng hương từ POC Products of conception APS Antiphospholipid syndrome Nhi cm sẳc thê đổ tô chức phôi thai Hội chửng khàng phospholipid LVS Low vaginal swab Tâm âm đạo thấp HVS High vaginal swab Tàm âm dạo cao TORC H Toxoplasmosis, other agents Toxoplasma, cảc tác rihản khác rubella Cytomegalovirus and Herpes simplex; rubella, cytomegalovirus, herpes simplex HLA Human leukocyte antigen Khảng nguyên bạch câu người TSH Thyroid-Stimulating hormone Hormon kich thich tuyền giáp FT3 Free Triiodothyroxin Hormon tuyền giáp T3 tự FT4 DNA Free Thyroxine Deoxyribonucleic acid Hormon tuyên giáp T4 tự IVIG Intravenous immunoglobulin Thuổc gây miền dịch thụ dộng p-hCG Beta human chorionic gonadotropin LH Luteinizing Hormone PICSI Physiological intracvtoplasmic Tiêm tinh trùng vào bào tương cua sperm injection nồn Intracytoplasmic Tiêm tinh trúng có chọn lọc hĩnh morphologically selected sperm thái vào bào tương noãn IMSI Hormon kích tlũch hồng thê injection BMI Body mass index Chi sơ khơi thê -ÍM Qỉ ugc V Hl MỤC LỤC TÀI LIỆU THAM KHÁO PHỤ LỤC -ÍM Qỉ ugc V Hl DANH MỤC BÁNG DANH MỤC BIÉƯ DỎ Hĩnh 22 Kiêu gen dồng help tứ bi'nh thường với gen ITGA2 vã ITGB3 31 Hình 23 Kiêu gen dị hựptư dột biến với gen ĨTGA2 \'ảỉTGB3 31 Hình 2.4 Kicu gcn đồng hợp tư dột biến gen ITGA2 ITGB3 32 Hình 3.1 Kết Real-time PCR cưa bệnh nhãn HK46 với kiêu gen dị hợp tứ dột biến cua gen ITGB3 34 Hĩnh 32 Ket qua Real-time PCR cua bệnh nhân HK08 với kiêu gcn dồng hợp từ bính thưởng cũa gen ITGA2 35 ỦNG DỤNG KỸ THUẬT REAL TIME PRC XÁC ĐỊNH ĐỘT BIÊN GEN ITGA2 NẰITGB3 LIÊN QUAN ĐẾN CHÚ NG ƯA HUY ÉT KHÓI DI TRUYỀN Ó PHỤ NŨ CÓ TIỀN sử SÂY THAI THAI CHÉT Lưu Tộm tầt Sẩy tíiai thai chết lưu lã biến cổ sán khoa nặng nề với người phụ nử Tuy nhiên, có tới khoang 50% cãc trưịng họp khơng tim thây ngun nhản rõ ràng Từ dây gcn liên quan đến chứng ưa huyết khối di truyền đà quan tâm nghiên cửu dựa ưẽn gia thuyct hình thành cục máu đơng làm giản đoạn tuần hồn từ cung - rau thai Hai gen ITGA TTGB3 mà hóa protein hỉnh thành nên trung gian kết dinh tiêu cầu Do đột biến hai gen có thê liên quan đến chứng tăng dóng Nghiên cứu mơ ta cắt ngang sư dụng kỹ thuật Real-time PCR nhằm xác định ty lệ đột biến haĩ gen ĨTGA2 vã ITGB3 dối tượng cỏ tiền sư sây thai, thai chết lưu Nhóm phụ nữ tham gia nghiên cứu cùa chúng tòi cõ tuổi trung binh lã 31.99 ± 6.02 Kct qua tim được, tý lệ alcn đột biến (T) cùa gen JTGA2 22.0% (CT 34.0%, TT 5.0%) gen ĨTGB3 cỏ tỳ lệ alcn dột biến (C) 1.5% (TC 3,0%, cc 0,0%>) Nghiên cứu chưa tim bang chúng mối liên quan giừa hai gen ITGA2 ĨTGB3 với tinh trạng sây thaị thai chết lưu cần tiến hảnỉỉ nghiên cứu cỏ nhóm chứng trãi cừ mầu lớn vã phân tích thêm tương tác đột biển gen lèn tinh trạng Từ khóa: IT GA JTGB3 sây thai, thai chết lưu chứng ưa huyết khối di truyền DETERMINING ITGA2 AND ỈTGB3 POLYMORPHISMS BY REAL TIME PCR TECHNOLOGY IN WOMEN WITH MISCARRIAGES OR STILLBIRTHS Abstract Miscarriage and stillbirth are serious pregnancy complications for women Many etiologies have been found However, up to about 50% of cases lias not had clear causes Front a hypothesis about thrombi disrupting utero-placental circulation recently, researchers are concentrating on genes related to inherited thrombophilia ITGA2 and ITGB3 encode proteins which form adhesion molecules promoting platelet aggregation Hence, different polymorphisms of these genes can associate with thrombophilia This descriptive cross-sectional study applied Real-time PCR technology to determine rates of ỈTGA2 C807T and ITGBỈ Leu33Pro polymorphisms in women with miscarriages and stillbirths Women in our study had average age of 31,99 = 6.02 The percentage of allele T of gene ĨĨGA2 was 22,0% (CT 34.0%, TT 5.0%) while the proportion of allele c of gene ỈTGBỈ is 1.5% (TC 3.0% cc 0.0%) Through this study, we cannot conclude any relationship between these two polymorphisms and miscarriages and stillbirths Thus, there is a need to conduct controlled studies, on a larger sample size, and further analysis of the interaction between different gene polymorphisms on these obstetric complications Key- words: inherited thrombophilia JTGA2 ITGB3, miscarriage, stillbirth, ĐẬT VẨN ĐÈ sẩy thai thai chết lưu hai biền cồ san khoa thường gập ánh hương km tới sức khoe thê chầt tinh thần cua người phụ nử Theo Hiệp hội San phụ khoa giởi (FIGO), tý lộ sẩy thai chiếm khoang 12-15% nhùng trưởng hợp đà nhận biểt dược minh cõ thai [1] Trong dó theo nghiên cúu khác, sổ ước tính -■c -ÍM Qỉ ugc V Hl tỳ lệ thục có tile lên 26% [2] Đổi vởi thai chết lưu theo FIGO, tning bình có 7000 ca mỏi ngây giới [3] Việc thai dè lại nhừng tãc dộng xấu lèn sửc khóc người mẹ gia dính, dặc biệt ánh hường VC tàm lý Những người phụ nừ thai cỏ 30 50% nái qua trạng thãi lo king, khoáng 10-15% bị trầm cám [1] Nhiều yếu tố đà xác định nguyên nhàn yếu tố nguy dần đến sây thai, thai chết kru vi dụ như: bẩt thưởng nhiêm sấc thê bất thường giãi phẫu tứ cung, chấn thương, rối loạn mien dịch chuyên hóa nhiêm trùng Tuy nhiên, cịn khống 50% trường hợp chưa xác định nguyên nhãn [4] Đẻ cỏ the tim hiểu rò cãc chể dần đến mầt thai, ngày cảc nhà khoa học dà ứng dụng phảt triên cua sinh học phản tư vào việc nghiên cữu biêu (dột biến tính da hínlì) cua càc gen liên quan dến sấy thai, thai chết lưu Trong dó gcn liên quan đen tinh trạng tâng đông máu dần đen hinh thành cãc cục mâu đơng lãm gián đoạn tuần hỗn tư cung - thai dtrợc quan tảm nghiên cửu [5] Nếu tím dược mối liên quan giừa tinh ưạng thai vá gen thi có thê dự đốn nguy mắt thai cua người phụ nử vả từ dó có biện pháp dự phịng hiệu qua Trẽn thề giới, nhiêu nghiên cứu dột biền tính da hỉnh cúa gen liên quan den chế tâng đông máu chi mối quan hệ gen vã biền cổ sấy thai, thai chết lưu ví dụ cãc đột biến gen MTHFR, FVL PAI-L Những thư nghiệm làm sàng dà dược tiền hành nhầm dành giá hiệu q cua việc đùng thc chơng đông cho nhửng san phụ mang dột biển gcn tàng đơng máu có tiền sư say thai, thai chềt lưu liên tiếp [5] [6], Ở Việt Nam nghiên cứu gcn liên quan đền dông máu phụ nừ có tiền sir sẩy thai, thai chết lưu cịn rẩt .Một vài nghiên cứu đà kháo sát đánh giã tỷ lộ đột biến cua gcn MTHFR FVL F2 hay PAI-J Tuy nhiên chưa có nghiên cứu đánh giá dột biến hai gen ĨTGA2 ITGB3 lã hai gen mà hóa cãc protein CĨ vai trị trung gian kct dinh tiêu cầu, bệnh nhản có tiền sư sây -■c -ÍM Qỉ ugc V Hl 55 4.32 dột biến gen ITGB3 Leu33Pro Bâng 4.1 So sánh tý lệ kiiu gen ITGB3 vói sổ nghiên cứu the giới Kicu gen/TGB3 (%) Nghiên cứu Cua chúng tòi Fatemeh Karanii [36] Quốc gia Mầu TT TC 97.0 3,0 80,0 20.0 0.0 86.36 10.91 2.73 82,0 1,0 Chứng: 100 58.0 27.0 Bệnh: 98 55.1 42.9 Việt Nam 100 Iran Bệnh: 110 Chứng: 100 Raheleh Torabi [37] Ruzzi [38] Iran Bệnh: 100 Italy Chúng: 38 A Sharif [39] Sameh Sadek [40] Mehri Khatami [41 ] Goncharova [31] Palestine Bệnh: 102 81.6 68.6 18.4 29,4 Chứng: 97 63.9 Bệnh: 25 84.0 Chửng: 25 76.0 Bệnh: 132 66.67 22,7 Chứng: 122 852 14,8 Ai Cập Iran Nga Bệnh: 186 Chứng: 629 68.8 71.7 34.0 cc 0.0 17,0 15.0 2,0 0.0 2,0 2.1 8,0 8.0 12,0 12.0 10.6 0.0 25,3 5.9 26.2 2,1 Trong nghiên cửu cùa chúng tỏĩ tỳ lệ kiêu gen đột biến gen ITGB3 -ÍM Qỉ ugc V Hl 56 thấp nhiều so với cảc nghiên cứu khàc trẽn giới, chi chiếm 3.OỸỐ; tần suất alen đột biến (C) 1.5% Tý lệ thắp cá ty lộ tương ứng nhóm chững (nhóm người bính thường) nghiên CÍR1 trẽn, mặc dủ cờ mầu vả đặc diêm mẫu nghiên cứu cua chúng tỏi tương dồng với nghiên cứu Điều nảy cỏ thè dẫn đến gia thiết lã có khác phán bố kiêu gen cua gen ỈTGB3 giừa cãc quốc gia chung tộc Với tỷ lệ kiểu gen đột biến kliá thấp, kềt qua nghiên cứu cua chúng tòi chưa the chi mơi liên quan dột biến gen ITGB3 tinh trạng sẩy thai, thai chết lưu mối liên quan nghiên cữu giới dang có kết luận khác Phần lởn câc nghiên cúu chi alcn dột biển (C) kiêu gcn dột biển (TC CC) táng có ỷ nghía thống kẽ nhỏm phụ nữ cõ tiền sư thai tái diẻn [31] [36] [38] [42] Dột biến gen có the làm tâng nguy thai thõng qua tiêu cầu gảy tinh trạng tảng dõng máu làm rối loạn chức bánh rau Tuy nhiên, vài nghiên cữu chi khơng có mối liên quan giừa đột biến gen nảy tinh trạng thai Trong nghiên cứu bệnh chứng cua Torabi vã cộng năm 2012 nhóm 100 phụ nừ có tiền sử thai lần nhỏm 100 phụ nừ dà có nhắt sống vả khơng có tiền sư thai, tý lệ dột biến gen nhóm chứng cao nhóm bệnh Nghiên cứu kết luận cỏ thê dột biến gen không liên quan don việc lảng nguy thai tái diễn, chi nỏ cịn the có tãc dụng báo vệ chống lại tinh trạng [37] 4.3.3 Dánh giá mối tương quan đột biển gen ITGA2 C807T ITGB3 Leu33Pro vói tuổỉ Trong nghiên cứuchu cua chúng tơi.dối kiêu gen dị hợpđộ tưtuổi dột từ biến ỈTGA232 25 xuất nhiên dây yếu nhóm tượng -ÍM CỊỈ Qỉ ugc V Hl -■c -ÍM HCC V Hk Hỉ: 57 Ngồi binh giừa ranào cãc test nhóm đê kicm cho tra thấy khãc biệt có khác tuồi trung có khơng ý hệ nghía cỏ đột thống bicn gen VC tuổi Do đột haikhơng chúng nhõm tơi khơng đột biềnbiệt tím thấy gen não vã mối quan gi ùakẽ tuồi hai bion gen -W -ÍM Qỉ ugc V Hl 58 KẾT LUÂN Đảnh, giá chất Itrọng tách chiết DNA từ mẫu máu kit DNA Express (Lytech - Nga, IVD) Sư dụng kit DNA - Express (Lytech Nga IVD) dê tách chict DNA từ cảc mầu máu cho thu cãc nu DNA hồn tồn dam bao VC nồng độ vả dộ tinh Mau DNA thu dược dạt chắt lượng để tiền hành cảc kỳ thuật sinh học phân tư Mõ tâ dột biển gen ITGA2 ITGB3 liên quan dến chứng ưa huyết khối dỉ truyền ó phụ nừcó tiền sứ sẩy thai, thai Chet lưu -Ty lệ đột biến gen ỈTGA2: dị hợp tư 34.0% dồng hợp tư 5.0% Tần suất alen dột biền lả 22.0% - Ty lệ dột biến gen ITGBỈ- dị họp tư 3.0% dồng hợp tứ 0.0% Tằn suất alen dột biến 1.5% Khơngkhơng nhõm cỏ sựcó khác độtbiệt biềnvề gen tuổi giừa nhóm có dụt biến -c -ÍM CỊỈ ugc V Hl 59 KI ÉN NGHỊ Sư dụng kit DNA - Express (Lytech Nga IVD) ưong tàch chiết DNA từ mầu mâu Cầncõ biến thực gen liên nhùng quan dền nghiên chứng cứu ưathực đánh huyết giá khối da di gen truyền vềmẫu cáclớn ớdột phụ nừ nhân tiền Trong sư sấy cỏ thai, đảnh thai giá mồi chét liên lưu quan tương tác cãc nhãn tồ Các hợp nghiên gen vã ctinh ứu cằn trạng dược thai khơng rịcờ ngun vã cỏ nhóm chứng TÀI LIỆU THAM KHÁO Figo (2018) Psychological impact of miscarriage accessed: 30/03/2021 Dugas c Slane V.H (2021) Miscarriage StatPearls StatPearls Publishing Treasure Island (FL) Figo (2016) Report reveals global stillbirth rates accessed: 31/03/2021 28 Senguven B Baris E Oygur T et al (2014) Comparison of methods for the extraction of DNA from formalin-fixed, paraffin-embedded archival tissues IntJMed Sei 11 (5) 494 499 29 Andersen A Wohlfahrt J Christens p et al (2000) Maternal age and fetal loss: population based register linkage study BMJ 320(7251), 1708 1712 30 Goncharova I.A Babushkina N.P Minaycheva L.I et al (2013) Prevalence of alleles of polymorphic variants Leu33Pro and Leu66Arg gene ITGB3 among inliabitants of Siberia Russ J Genet 49(8) 877-880 31 Pasquier E Bohec c Mottier D el al (2009) Inherited thrombophilias and unexplained pregnancy loss: an incident case-control study Journal of Thrombosis and Haemostasis 7(2), 306-311 32 Poursadegh Zonouzi A., Chaparzadeh N., Ohorbian s et al (2013) The association between thrombophilic gene mutations and recunent pregnancy loss Jdssist Reprod Genet 30(10), 1353 1359 33 Golovchenko O.V Abramova M.Y Altukhova O.B et al (2020) The Role of Polymoiphism of Heredi tary Thrombophilia Candidate Genes in the Development of Arterial Hypertension in Women with Preeclampsia Systematic Reviews in Pharmacy- 11(6) 11-15 34 p MẫríG Asaadi Tehrani Dr., s Mirzaahmadi (2016) Relationship between GPIa(807C/T) and GPIIIa (PLA1PLA2) gene plvmorphisms and recurrent spontaneous abortion in women in Tehran Province Sci J Iran -ÍM Qỉ ugc V Hl 63 Blood Transfus Organ 13(2), 138-145 35 Karami F Askari M., vã Modarressi M.H (2018) Investigating Association of rs5918 Human Platelets Antigen and rsl 800790 Fibrinogen Chain as Critical Players with Recurrent Pregnancy Loss Med Sci (Basel), 6(4) Torabi of Thrombophilic R the Zarei s Gene Zeraati Polymorphi H Pregnancy et sms alas (2012) a Loss Cause Combination of Infertil Increased 13(2), Risk 89of 94 Recurrent J Rep rod -ÍM Qỉ ugc V Hl 36 Laura Ruzzi Iolanda Ciarafoni, Lorena Silvestri et al (2005) Association of PLA2 polymorphism of the ITGB3 gene with early fetal loss Fertility- and Sterility 83(2) 511-512 37 Al-Astal M.G Sharif F.A (2016) Beta-fibrinogen (-455 G/A) and Integrin beta-3 (PLA1/A2) polymorphisms and recurrait pregnancy loss in Gaza strip-Palestine International Journal of Reproduction, Contraception, Obstetrics and Gynecology 3(1) 134 138 38 Sadek s Kaflash D.E., Malidy M.E et al (2020) Platelet Glycoprotein iib/iiia (leu 33 pro) Polymorphism and its Role in Recurrent Early Pregnancy Loss Journal of Clinical