Ứng dụng kỹ thuật lai điểm để phát hiện methyl hóa gen RASSF1A, GSTP1 ở bệnh nhân ung thư vú và ung thư tuyến tiền liệt

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Đoàn Thị Hồng Vân ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI ĐIỂM ĐỂ PHÁT HIỆN METHYL HÓA GEN RASSF1A, GSTP1 Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ VÚ VÀ UNG THƢ TUYẾN TIỀN LIỆT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội-2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Đoàn Thị Hồng Vân ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI ĐIỂM ĐỂ PHÁT HIỆN METHYL HÓA GEN RASSF1A, GSTP1 Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ VÚ VÀ UNG THƢ TUYẾN TIỀN LIỆT Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Võ Thị Thƣơng Lan Hà Nội-2017 LỜI CẢM ƠN Trong năm tháng theo học làm việc Phòng Thí nghiệm Sinh Y, tơi có hội học hỏi kiến thức mới, có điều kiện thực hành nhƣ tiếp xúc với tác phong khoa học nề nếp Tôi đƣợc thử sức với khó khăn, thử thách thực nghiệm mang lại Vì thế, lời cảm ơn đầu tiên, xin đƣợc gửi tới PGS TS Võ Thị Thƣơng Lan – ngƣời bên cạnh suốt năm tháng Cơ ngƣời hƣớng dẫn đặc biệt, tâm huyết vô kiên nhẫn sửa đổi khuyết điểm Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Tạ Bích Thuận Mặc dù, khơng hƣớng dẫn trực tiếp nhƣng lời động viên cô làm cho tơi suy nghĩ tích cực lúc gặp trắc trở Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS Phạm Anh Thùy Dƣơng NCS Ngô Thị Hà – hai ngƣời chị chia sẻ kinh nghiệm lắng nghe khúc mắc Tôi gửi lòng u mến tới bạn đồng khóa toàn thể sinh viên học viên cao học Phòng Thí nghiệm Sinh Y Để có đƣợc kết luận văn này, xin cảm ơn Khoa Giải phẫu, Bệnh viện K, thầy cô Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ q trình học tập thực hành Tơi gửi lòng biết ơn nhƣ lời cảm ơn tới thành viên gia đình ủng hộ định Hà Nội, ngày 27 tháng năm 2017 Học viên cao học Đoàn Thị Hồng Vân MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU CHƢƠNG – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 METHYL HÓA DNA VÀ UNG THƢ 1.1.1 Methyl hóa DNA 1.1.2 Methyl hóa DNA ung thƣ 1.1.3 Methyl hóa gen GSTP1 1.1.4 Methyl hóa gen RASSF1A 1.2 MỘT SỐ KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SỰ METHYL HĨA DNA 10 1.2.1 Các kỹ thuật phân tích phổ biến 10 1.2.2 Kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu methyl MSP (Methylation-Specific PCR) 12 1.3 KỸ THUẬT LAI ĐIỂM 15 1.3.1 Nguyên tắc chung kỹ thuật lai axit nucleic 15 1.3.2 Phƣơng pháp đánh dấu đầu dò 17 CHƢƠNG – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 26 2.1 CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 26 2.2 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 26 2.2.1 Nguyên liệu 26 2.2.2 Hóa chất 27 2.2.3 Thiết bị 30 2.3 PHƢƠNG PHÁP 30 2.3.1 Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm ung thƣ vú 30 2.3.2 Xử lý DNA với sodium bisulfite 30 2.3.3 Phƣơng pháp PCR 30 2.3.4 Tinh sản phẩm PCR 34 2.3.5 Tách plasmid 35 2.3.6 Phƣơng pháp xác định nồng độ DNA quang phổ hấp thụ 35 2.3.7 Điện di 35 2.3.8 Phƣơng pháp lai điểm 35 2.3.9 Phƣơng pháp phân tích thống kê sinh học 36 CHƢƠNG – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 ĐIỀU KIỆN LAI ĐIỂM TỐI ƢU CỦA ĐẦU DÒ G200 VÀ R200 PHÂN BIỆT TRÌNH TỰ BỊ METHYL HĨA VÀ TRÌNH TỰ KHƠNG BỊ METHYL HĨA 38 3.1.1 Kết tinh trình tự nucleotide bị methyl hóa trình tự nucleotide khơng bị methyl hóa 38 3.1.2 Kết tổng hợp đầu dò 39 3.1.3 Điều kiện lai điểm phân biệt trình tự GSTP1 bị methyl hóa (MeG) trình tự GSTP1 khơng bị methyl hóa (UnG) với đầu dò G200 40 3.1.4 Điều kiện lai điểm phân biệt trình tự RASSF1A bị methyl hóa (MeR) trình tự RASSF1A khơng bị methyl hóa (UnR) với đầu dò R200 42 3.2 PHÂN TÍCH SỰ METHYL HÓA PROMOTER GEN GSTP1 VÀ RASSF1A BẰNG KỸ THUẬT MSP 47 3.2.1 Tách chiết DNA 47 3.2.2 Xử lý DNA với sodium bisulfite 49 3.2.3 Xác định methyl hóa promoter hai gen GSTP1 RASSF1A mẫu bệnh phẩm 50 3.2.4 Mối liên hệ methyl hóa thơng số sinh học 55 3.2.5 Kết lai điểm số sản phẩm MSP từ mẫu bệnh phẩm 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các plasmid sử dụng cho kỹ thuật lai điểm 27 Bảng 2.2 Thành phần dung dịch dùng trình lai điểm 28 Bảng 2.3 Trình tự mồi sử dụng cho nghiên cứu kích thƣớc sản phẩm PCR tƣơng ứng 29 Bảng 2.4 Thành phần điều kiện phản ứng MSP với cặp mồi khuếch đại trình tự GSTP1 bị methyl hóa 31 Bảng 2.5 Thành phần điều kiện phản ứng MSP với cặp mồi khuếch đại trình tự GSTP1 khơng bị methyl hóa 32 Bảng 2.6 Thành phần điều kiện phản ứng MSP với cặp mồi khuếch đại trình tự RASSF1A bị methyl hóa 33 Bảng 2.7 Thành phần điều kiện phản ứng MSP với cặp mồi khuếch đại trình tự RASSF1A khơng bị methyl hóa 33 Bảng 2.8 Thành phần điều kiện phản ứng PCR tổng hợp đầu dò có khơng có biotin 34 Bảng 3.1 Điều kiện lai điểm phân biệt sản phẩm tinh mang trình tự GSTP1 bị methyl hóa (MeG) trình tự GSTP1 khơng bị methyl hóa (UnG) sử dụng đầu dò G200 40 Bảng 3.2 Điều kiện lai điểm phân biệt sản phẩm tinh mang trình tự RASSF1A bị methyl hóa (MeR) trình tự RASSF1A khơng bị methyl hóa (UnR) sử dụng đầu dò R200 45 Bảng 3.3 Nồng độ độ số mẫu DNA tách chiết từ mẫu mô 48 Bảng 3.4 Nồng độ độ số mẫu DNA sau xử lý với sodium bisulfite 49 Bảng 3.5 Tỷ lệ methyl hóa hai gen GSTP1 RASSF1A ung thƣ vú 55 Bảng 3.6 Mối liên hệ methyl hóa promoter hai gen GSTP1 RASSF1A với thông số sinh học bệnh nhân ung thƣ vú 56 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Sự methyl hóa DNA genome động vật có vú Hình 1.2 Cấu trúc gen GSTP1, mRNA, protein yếu tố điều hòa phiên mã Hình 1.3 Cấu trúc gen RASSF1A Hình 1.4 Phƣơng pháp biến đổi DNA nhờ sodium bisulfite 12 Hình 1.5 Các cặp mồi kỹ thuật MSP 13 Hình 1.6 Kỹ thuật MethyLight 14 Hình 1.7 Phƣơng pháp đánh dấu thông qua phản ứng tổng hợp DNA in vitro 18 Hình 1.8 Hệ thống đánh dấu gián tiếp 20 Hình 1.9 Mức độ tƣơng đồng trinh tự bị methyl hóa trình tự khơng bị methyl hóa với đầu dò đặc hiệu 23 Hình 3.1 (A) Kết tách plasmid mang trình tự bị methyl hóa khơng bị methyl hóa (B) Kết điện di ng tinh sản phẩm PCR trình tự nucleotide GSTP1 RASSF1A bị methyl hóa (MeG, MeR) trình tự nucleotide khơng bị methyl hóa (UnR, UnG) 39 Hình 3.2 Kết tổng hợp đầu dò G200, R200 có khơng có biotin 39 Hình 3.3 Kết lai điểm với đầu dò G200 nồng độ muối SSC khác 41 Hình 3.4 Kết lai điểm với đầu dò R200 sản phẩm tinh mang trình tự RASSF1A bị methyl hóa (MeR) trình tự RASSF1A khơng bị methyl hóa (UnR) 43 Hình 3.5 Kết lai điểm với đầu dò R200 nhiệt độ 400C, 450C 490C dung dịch đệm lai có bổ sung 50% formamide 45 Hình 3.6 Kết lai điểm điện di sản phẩm PCR tinh mang trình tự bị methyl hóa (MeG, MeR) trình tự khơng bị methyl hóa (UnG, UnR) 46 Hình 3.7 Kết điện di minh họa số DNA tách chiết từ 49 cặp mẫu bệnh phẩm mô ung thƣ vú-VU mô liền kề-VL (A) từ 10 mẫu đúc mô ung thƣ tuyến tiền liệt T1-T10 (B) 47 Hình 3.8 Kết điện di sản phẩm MSP phát methyl hóa promoter GSTP1 sử dụng mẫu bệnh phẩm ung thƣ tuyến tiền liệt (T1-T10) 51 Hình 3.9 Kết điện di minh họa sản phẩm MSP phát methyl hóa promoter gen GSTP1 sử dụng mẫu bệnh phẩm ung thƣ vú 52 Hình 3.10 Kết điện di minh họa sản phẩm MSP phát methyl hóa promoter RASSF1A sử dụng mẫu bệnh phẩm ung thƣ vú 54 Hình 3.11 Kết lai điểm số sản phẩm MSP từ mẫu bệnh phẩm ung thƣ vú (A) ung thƣ tuyến tiền liệt (B) 57 Danh sách bệnh nhân ung thƣ tuyến tiền liệt Mã Họ tên Tuổi Vị trí sinh thiết Giải phẫu bệnh Chẩn đốn lâm sàng 56957 Trƣơng Ngọc T 59 C61.0 8140/3 carcinoma tuyến, gleason 5+4=9 44466 Nguyễn Đặng Q 89 C61.0 8140/3 carcinoma tuyến độ 38380 Lê Văn T 78 C61.0 8140/3 carcinoma tuyến tiền liệt, gleason 4+3 24245 Nguyễn Trọng L 66 C61.0 8140/3 carcinoma tuyến tiền liệt, gleason độ 4A 31254 Nguyễn Cao H 80 C61.0 8140/3 carcinoma tuyến tiền liệt, gleason 3+3 33818 Dƣơng Công T 68 C61.0 8140/3 carcinoma tuyến tiền liệt, gleason 4A 36568 Kim Văn N 84 C61.0 8140/3 carcinoma tuyến tiền liệt, gleason 4B 41249 Nguyễn Văn C 61 C61.0 8140/3 carcinoma tuyến tiền liệt, gleason 3+2=5 42919 Lê Khắc Đ 81 C61.0 8140/3 carcinoma tuyến tiền liệt, gleason 4+3 43724 Phạm Văn H 70 C61.0 8140/3 carcinoma tuyến tiền liệt, gleason 2+2 Powered by TCPDF (www.tcpdf.org) Powered by TCPDF (www.tcpdf.org) Powered by TCPDF (www.tcpdf.org) Powered by TCPDF (www.tcpdf.org) CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc ============ GIẤY XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ học viên cao học Đoàn Thị Hồng Vân Tên tơi là: Đồn Thị Hồng Vân, tác giả luận văn với đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật lai điểm để phát methyl hóa gen RASSF1A, GSTP1 bệnh nhân ung thư vú ung thư tuyến tiền liệt” bảo vệ trước Hội đồng chấm luận văn thạc sĩ trường Đại học Khoa học Tự nhiên ngày 20 tháng năm 2017 Theo góp ý Hội đồng, xin bổ sung chỉnh sửa nội dung sau: 1) Sửa lại mục tiêu kết luận luận văn Mục tiêu: - Tối ưu điều kiện lai điểm đầu dò G200 R200 - Khảo sát tình trạng methyl hóa promoter GSTP1 RASSF1A 49 cặp mẫu mô ung thư vú mẫu mơ liền kề; tình trạng methyl hóa promoter GSTP1 10 mẫu đúc ung thư tuyến tiền liệt kỹ thuật MSP; - Phát số sản phẩm MSP từ mẫu bệnh phẩm dương tính với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại trình tự GSTP1 bị methyl hóa nhờ kỹ thuật lai điểm Kết luận: - Điều kiện lai điểm sử dụng đầu dò G200 khơng có formamide, điều kiện lai điểm sử dụng đầu dò R200 giúp phân biệt trình tự nucleotide bị methyl hóa trình tự nucleotide khơng bị methyl hóa ng cho phép phát ng sản phẩm tinh bị methyl hóa - Khảo sát tình trạng methyl hóa hai gen GSTP1 RASSF1A kỹ thuật MSP mẫu bệnh phẩm mối liên hệ methyl hóa với thơng số sinh học - Đầu dò G200 phát sản phẩm có GSTP1 bị methyl hóa điều kiện lai điểm tối ưu 2) Cần làm rõ lý lựa chọn hai gen nghiên cứu Sự methyl hóa GSTP1 RASSF1A quan sát ung thư tuyến tiền liệt ung thư vú Cụ thể, methyl hóa GSTP1 có mối liên hệ với giai đoạn khác ung thư tuyến tiền liệt, phân biệt ung thư tuyến tiền liệt với bệnh liên quan tới tuyến tiền liệt Sự methyl hóa GSTP1 xác định thơng qua dịch thể (huyết thanh, huyết tương, nước tiểu) có độ đặc hiệu cao so với xét nghiệm PSA huyết Trong đó, RASSF1A có mối liên hệ với đặc điểm xâm nhập khối u nên khối u xảy methyl hóa RASSF1A có mối tương quan với độ Gleason PSA Đối với ung thư vú, nghiên cứu năm 1990 cho thấy, đảo CpG promoter GSTP1 không bị methyl hóa mơ vú bình thường bị methyl hóa q mức mơ ung thư vú đồng thời có mối liên hệ với mức giảm biểu protein GSTP1 Sự methyl hóa mức promoter RASSF1A kiện xảy sớm trình phát triển ung thư vú, trì ổn định tất giai đoạn trình tiến triển ung thư vú Hơn nữa, methyl hóa RASSF1A xuất có mối tương quan với tiên lượng xấu trở thành thị sinh học có giá trị cho ung thư vú Do đó, methyl hóa hai gen chúng tơi lựa chọn để nghiên cứu luận văn 3) Tại lựa chọn mẫu mô ung thư mẫu mô liền kề Các nghiên cứu không sử dụng mẫu mô ung thư mà lựa chọn mẫu đối chứng để phân tích methyl hóa Nghiên cứu Phuong cs (2015) sử dụng 20 mẫu mơ vú bình thường phân tích 95 mẫu mơ bệnh nhân ung thư vú người Việt Nam Hoque cs (2006) sử dụng mẫu đối chứng 76 mẫu máu Theo Massie cs (2017), mẫu đối chứng phù hợp để phân tích methyl hóa đặc hiệu khối u mẫu mơ bình thường nằm quan với khối u Ở nhiều loại ung thư, thay đổi methyl hóa quan sát mơ liền kề Vì thế, mơ liền kề lựa chọn thích hợp để so sánh biến đổi di truyền ngoại gen với mô ung thư Cho cs (2010) phân tích methyl hóa gen cặp mẫu mô ung thư mô liền kề từ 40 bệnh nhân ung thư vú Trong luận văn này, ngồi việc phân tích methyl hóa promoter GSTP1 10 mẫu mô đúc ung thư tuyến tiền liệt, chúng tơi phân tích methyl hóa promoter GSTP1 RASSF1A 49 cặp mẫu mô ung thư mô liền kề từ bệnh nhân ung thư vú kỹ thuật MSP Từ đó, chúng tơi khảo sát tình trạng methyl hóa hai gen hai loại mẫu 4) Sửa lại thuật ngữ khoa học luận văn Chuyển ADN thành DNA Nhân tố phiên mã SP1 (Stimulator protein 1), AP1 (Activator protein 1) 5) Làm rõ đặc tính tiêu chuẩn mẫu Các cặp mẫu mô tươi (mẫu mô ung thư vú mẫu mô liền kề) từ 49 bệnh nhân ung thư vú; mẫu mô đúc từ 10 bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt cung cấp Khoa Giải phẫu, Bệnh viện K từ tháng năm 2012 đến tháng 12 năm 2013 Các mẫu mô liền kề lấy cách khối u ung thư vú khoảng 3-5 cm Tôi xin trân trọng đề nghị Hội đồng xác nhận việc chỉnh sửa, cho phép làm thủ tục xin cấp Thạc sĩ khoa học Hà Nội, ngày CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC (Ký ghi rõ họ tên) tháng năm HỌC VIÊN CAO HỌC (Ký ghi rõ họ tên) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG CHẤM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC (Ký ghi rõ họ tên) ... tài: Ứng dụng kỹ thuật lai điểm để phát methyl hóa gen RASSF1A, GSTP1 bệnh nhân ung thƣ vú ung thƣ tuyến tiền liệt Chƣơng – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 METHYL HĨA DNA VÀ UNG THƢ 1.1.1 Methyl hóa DNA... −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Đoàn Thị Hồng Vân ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI ĐIỂM ĐỂ PHÁT HIỆN METHYL HÓA GEN RASSF1A, GSTP1 Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ VÚ VÀ UNG THƢ TUYẾN TIỀN LIỆT Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm... họa sản phẩm MSP phát methyl hóa promoter RASSF1A sử dụng mẫu bệnh phẩm ung thƣ vú 54 Hình 3.11 Kết lai điểm số sản phẩm MSP từ mẫu bệnh phẩm ung thƣ vú (A) ung thƣ tuyến tiền liệt (B)