Xác định đột biến gen HBB gây bệnh β thalassemia bằng kỹ thuật giải trình tự gen sanger

TKf V*: -u LỊÌ CÁM ƠN Với tất ca lịng trân trọng, cm xin bảy tó lịng biết ưn sâu sắc tới GS.TS Tạ Thành Văn Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Gen- Protein Trường Dại học Y Hà Nội; PGS.TS.BS Trần Vân Khánh Phó Giám dồc Trung tâm Nghiên cửu GenProtein Trường Dại hợc Y Hà Nội Trưởng Bộ môn Bệnh học phân tứ Trường Dại Học Y Hà Nội tạo diều kiện cho em thực khóa luận trung tâm đồng thời người hướng dẫn tận tỉnh chi báo giúp dừ em ln dưa lời khun hừu ích lịi góp ý tâm huyết dè em hồn thành tot bãi khỏa luận nảy Em xin bày tó lòng biết on sâu sắc tới TS Phạm Lê Anh Tuấn, TS Nguyen Hoàng Việt, người thầy tận tỉnh chia sè kỳ thuật kinh nghiệm hừu ích trinh thực thí nghiệm, cúng anh chị Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein Trường Đại họe Y Hà Nội ThS Lê Thị Phương Trưởng Đại học Y Hà Nội đà tận lình giúp dờ em dê em hồn chinh khơa luận lùn xin chân thành cam ơn Ban Giám Hiệu Phòng Quan lý Dào tạo Dại Học Khoa Kỳ thuật Y hục Trưởng Dại Hục Y Hà Nội đà tạo diều kiện cho em lâm khóa luận lốt nghiệp Lời cuối em xin gưi lời cam ưn tói gia dính, bạn bè ln quan tâm dộng viên giúp dừ em trinh học tập vả nghiên cứu Hà Nội 14 tháng nám 2021 Sinh viên Vương Thị Hãi Yen CỘNG HÒA XÂ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Dộc lập - Tự - Hạnh phúc TM/ V*: CAM ĐOAN Kinh gũi: Phòng Quãn lý tạo Dại học - Trường Dại học Y Hà Nội Hội dồng chẩm khóa luận tốt nghiệp Tôi xin cam đoan đày công trinh nghiên cửu cua với giúp đờ cua thầy cô lại Bộ môn Bệnh học phàn tư anh chị Trung lâm nghiên cứu Gen - Protein Trường Dại học Y Hà Nội rắt ca sổ liệu nghiên cứu khóa luận lã trung thực chưa công bố công trĩnh khác Hả Nội 14 tháng năm 2021 Người viết khóa luận Vương Thị Hai Yen TM/ V*: MỤC LỤC CHƯƠNG 1:1 ÓNG QUAN 1.1 1.2 1.3 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.4 PHỤ LỤC 1.5 DANH MỤC BẢNG 1.6 1.7 1.8 DANH MỤC HÌNH 1.9 1.10 1.11 PCR 1.13 Multiplex 1.12 Polymerase Chain Reaction 1.14 Multiplex Amplification Mutation ARMS-PCR Ml System Microliters 1.15 nin 1.16 Manometers 1.17 nil 1.18 Milil iters 1.19 ng 1.20 Mano grams 1.21 mg 1.23 pg 1.22 1.25 Miligrams Picograms 1.24 (L 1.26 Femtoliters 1.27 MCH 1.28 Mean Corpuscular Hemoglobin 1.29 1.31 MCV (X p ổ Y r pg 1.33 ®/o 1.30 Mean Corpuscular Volume 1.32 Chuồi alpha Chuỗi beta Chuồi delta Chuỗi 1.34 zeta 1.35 "C bp 1.36 Chuỗi gamma Chuồi epsilon Micrograms 1.37 Phần tràm 1.38 Độ c 1.40 Hb 1.39 1.41 Basepair Hemoglobin 1.42 DMA 1.43 Deoxyribonucleic acid 1.44 RNA 1.45 Ribonucleic acid 1.46 mRNA 1.47 Messenger Rbonucleic acid 1.48 DẠT VÁN DÊ 1.49 Bệnh Thalassemia thuộc nhóm bệnh rối loạn tồng hợp huyết sác tố nhùng bệnh di truyền lặn theo quy luật Mendel phố biền giói [I] Bệnh gây bới dột biến gen quy dịnh tông hợp chuỗi globin dẫn don giám hồn lồn tơng hợp chuồi nảy, tạo nên bất thường VC huyct sẳc tổ thành phàn loại huyết sắc tố dần tới tượng vờ hồng cầu gây tính trạng thiểu máu bệnh nhàn [2] Bệnh 0- Thalassemia gày bơi đột biến gen p globin nằm nhiễm sắc thè (NST) 11 Đột biền gen HBB phần lớn đột biến diêm [3] Cho đen dà có hem 900 dột biến phát gcn P-globin dược cơng bồ tồn giới, có khống 200 đột biến dà xác định gây bệnh 0- Thalassemia Theo Liên Đoàn Thalassemia Quốc Te sổ người mang gen bệnh the giới lớn ước tinh khoáng 7% [4], Ở Việt Nam bệnh |i- Thalassemia nguyên nhân hãng đầu gây thiểu máu tan máu nặng tré em [5] The bệnh lâm sảng nặng cùa bệnh |5-Thalasscmia với kiểu gcn bệnh đồng hợp tứ, có biểu bệnh thicu máu tan máu nặng nề với nhiều biến chứng nhiều quan cua the Nhừng người bệnh cần diều trị truyền mâu vả thái Silt suốt đời chất lượng sống thấp biến chứng cùa bệnh Ngoài bệnh có thê kết hợp với bất thưởng cầu trúc hemoglobin với hình thái làm sàng da dạng, phơ biến p- Thalassemia kết hợp với bệnh hemoglobin E (HbE) [6] Việc người mang gcn bệnh kct sinh nguồn phát lán gen bệnh chu yếu cộng dồng Hiện chưa có phương pháp diều trị bệnh 0Thalassemia triệt dê, số hưởng nghiên cứu liệu pháp gen vã ghép tế bâo gốc đà có bước dầu thành công, nhicn phương pháp tốn vã không phai lúc não thực dược Chinh vi phãt 1.50 nhừng người lãnh mang gcn bệnh đê tư vấn tiền hỏn nhân, chân đoán trước sinh nhầm hạn chế thai nhi bị bệnh biện pháp hữu hiệu nhàm giam tý lộ mắc bệnh cộng đồng 1.51 Bệnh ịỉ-Thalassemia chân đoàn dựa vào phản tích pha hộ, đậc diêm lâm sàng xét nghiệm huyết học Tuy nhiên, xét nghiệm di truyền phân tứ xác định đột biền gen p-globin điều kiện thiết yếu khảng định the bệnh, thực chân doán trước sinh vã lư van liền hôn nhân bệnh Trong năm gần dây, số kỳ thuật sinh học phân lư Multiplex ARMS- PCR góp phần tích cực việc chẩn đoán kiêu đột biển gcn giúp cho còng tác tư vần quan lý nguồn người mang gen vả phông bệnh ngày tốt lum Tuy nhiên, phương pháp giai trình lự Sanger khơng chi sử dụng dê phát hàu hết dột biến gcn phó biến gãy bệnh p-Thalasscmia mà coi tiêu chuàn vàng việc phát nhiều dột biến mói trẽn gen HBB đà dang trờ thành cơng cụ chấn đốn thường quy |7) Xuất phát lừ thực tế trên, chúng tòi thực đề tài •• Xác định đột hiên gen ỈỈBB gây bệnh /ỉThalassemia hăng kỳ thuật giãi trinh tựgen Sanger "vởỉ mục tiêu: 1.52 Phát biến trênbàng gen phương P-globin ỡ người mang gengen tự gây Sanger bệnh |ỉđột Thalassemia pháp giãi trình 1.53 1.54 Chương l:TĨNG QUAN 1.1 Bệnh P-Thalassemia 1.1 ỉ Địnli nghĩa 1.55 Thalassemia loại bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thê thường, đặc trưng bời suy giam thiếu hụt tồng hợp chuỗi « p-globin phân tư Hemoglobin Bệnh [Ị-Thalassemia xay đột biên diêm locus tạo chuồi p làm giam chức nâng cùa gen mã hỏa cho việc tống hợp p globin, dẫn đến giam không tổng hợp chuỗi p- globin [8] 1.2 Dịch tề học bệnh p - Th alassemia 1.56 Theo Liên đồn Thalassemia quốc tế (2005) the giới có từ 80-90 triệu người mang gcn bệnh, mỏi nãm có tới 60.000 trường hợp sinh mang gen bệnh Toàn Cháu Á có 60 triệu người mang gen p- Thalassemia Riêng khu vực Dõng Nam À dó có Việt Nam ước tính sổ người mang gen p-Thalassemia chiếm tói 50% người mang gcn tồn cẩu khoang 40 triệu người [9J Theo thống kè cua Bộ Y tế nãm 2019 nước ta ước tính có khống 12 triệu người dang mang gcn bệnh (chiêm khoang 12% dân số Việt Nam), mỏi năm có 8000 trê sinh bị bệnh, đõ cô 2000 tre mác bệnh mửc độ nặng cần diều trị ca dời hon 20.000 bệnh nhân dang cằn dược điều trị theo loại gen bị anh hưởng mà phản biệt thành bệnh uThalassemia p- Thalassemia [5] [10] 1.1.3 Dục điểm làm sàng phân loại bệnh fi- Thalassemia 1.57 Cản vào đậc diêm làm sàng, cận lâm sáng số lượng alcn bị dột bicn kiều hình bệnh P-Thalasscmia dưọc chia thành thè: thê nặng, thê trung gian thê nhẹ 1.58 Bệnh p-Thalassemia xáy dột biển gen [ỉ-globin dàn den xuẩt nhùng kiểu gcn sau: • p° -Thalassemia lã đột biến lâm mat chức náng gcn P-globin nén không tống hợp dưực chuồi P-globin, ví dụ như: dột biền làm tạo thành ba kềt thúc sớm • p-t -Thalassemia đột biến lãm giám chức nàng gen p-globin nên giám tông hợp chuồi p-globin nhiều mức độ khác Vi' dụ dột biến vùng khơi động [11] [12], 1.60 Kiể u hình 1.59 BãnỊỊ I ỉ Phân loại đột biển Ịỉ Thalassemia 1.61 Kiều gcn 1.62 Lâm sàng 1.65 Triệu chứng làm sảng không rõ ràng 1.63 Nhẹ 1.64 [ỉ°/ p p +/ p 1.66 I lồng cằu nho nhược sắc1.70 Biểu lâm sàng 1.68 5°/p+,p+/p + 1.67 Trun 1.69 [Ị°/ p + p +/ p, p +/ p p°/ g gian p° p +/ p +, p°/ p + p°/ p°, p +/ p + p°/ p + p +/ p p +/ p muộn 1.71 Thiếu máu nhẹ tning binh 1.72 Không phụ thuộc truyền máu 1.76 Biêu lâm sàng 1.74 Nặn g 1.78 1.79 1.75 [ỉo/p°.p+/p+, p°/p+ sớm 1.77 Thiều mâu nặng Phụ thuộc truyền mâu Ngồi cịn có cảc thê p-Thalassemia khác, sổ dó lã thê phổi họp P-Thalassemia Hemoglobin E (HbE) Bệnh hemoglobin E (HbE) xay đột biên cẩu trúc gen mã hóa san xuằt chuỗi p globin vị tri codon 26 thay nucleotide G thành nucleotide A làm cho acid glutamic bi thay the bơi lysin hậu qua khiêm khuyết gcn chuồi p globin ca VC sổ lượng vã chất lượng (13] 34 dụng cho kỳ thuật giãi trinh tự bang máy giái trinh tự gcn tự dộng Sau dó so sánh kết quà giãi trinh tự với trinh tự ngàn hàng Genbank bang phần mcm CLC Main Workbench Kcl giãi trinh lự gen trinh bày Bang 3.3 1.389 Báng 3.3 Các (lột hiển gen HBB cũn 15 mẫu nghiên cứu 1.390 Bệ nh nhân 1.391 VỊ 1.392 Tên dột biến tri đột biến 1.393 Thê đột biển 1.394 Mức độ bicu (Kiêu gen 1.395 T HAL1 1.400 T HAL2 1.405 T HAL3 1.410 T HAL4 1.415 T HAL5 1.420 T HAL6 1.425 T HAL7 1.430 T HAL8 1.435 T HAL9 1.440 T HAL10 1.445 T HAL11 1.450 T HAL12 1.455 T HAL13 1.396 Exon 1.401 Exon 1.406 Exon 1.411 Exon 1.416 Exon 1.421 Exon 1.426 Exon 1.431 Exon 1.436 Exon 1.441 Exon 1.446 Exon 1.451 Exon 1.456 -28 1.397 C.79G>A 1.402 C.79G>A 1.407 C.79G>A 1.412 C.79G>A 1.417 C.79G>A 1.422 C.79G>A 1.427 C.79G>A 1.432 C.79G>A 1.437 C.79G>A 1.442 c.l26-129delTCTT 1.447 C.52A>T 1.452 C.52A>T 1.458 -28A>G kiêu hình) p 1.398 D 1.399 ị hợp tir °/ p (nhẹ) 1.403 D 1.404 p ị hợp tứ °/ p (nhẹ) 1.408 DỊ 1.409 p hợp tử °/ p (nhẹ) 1.413 D 1.414 p Ị blip tư °/ p (nhẹ) 1.418 D 1.419 p Ị hợp lử °/ p (nhẹ) 1.423 D 1.424 p ị hợp tử °/ p (nhẹ) 1.428 D 1.429 p ị hợp từ °/ p (nhẹ) 1.433 Dị hợp 1.434 p tứ °/ p (nhẹ) 1.438 D 1.439 p Ị họp tử °/p(nhẹ) 1.443 D 1.444 p ị hợp tứ °/ p (nhọ) 1.448 D 1.449 p ị hợp tữ °/p(nhẹ) 1.453 Dị hợp 1.454 p tứ °/ p (nhẹ) 1.459 D 1.460 p+/p(n ị hợp từ hẹ) 1.457 (pro moter) 1.461 T 1.462 1.463 c 126-129delTCĨT 1.464 D 1.465 P HAL14 Exon ị hợp tứ °/P(nhẹ) 1.466 T 1.468 1.469 c.52A>T 1.470 D 1.472 p HAL15 Exon ị hựp tữ °/ p (nhẹ) 1.473 Kct quã giãi trinh tự cho thẳy có 15/15 mầu cỏ biền đổi gcn HBB 1.474 so với trinh lự chuẩn Genbank (NG 000007 NM 000518) dó ỡ TM/ V*: 4Ả 'V 35 1.475 exon I phát dược dột biến lã C.79G>A ( xuất 9/15 mầu) C.52A>T (xuất hiộn 3/15 mầu); exon phát dược I dột biến C.I26l29dclTCTT (xuất 2/15 màu); vùng promoter khơng mà hóa phát I đột biến -28A>G (xuất 1/15 mầu) Tất ca mầu nghiên cứu mang dột biển dị hợp lư Dưới dày lã biếu đồ thê li lệ xuẩl cua đột biến phát dược 15 mẫu nghiên cứu: A J !26-!2MdTCTT piAĩ-T 2$A>G 1.476 1.477 1.478 Hình 3.5 Biểu (lồ ù lệ xuất đột hiển 15 mầu nghiên cứu 1.479 rf rf C.79G>A (p.Glu27Lỵs) C.79G I AGTTGGĨGGTGAGGCCCTGGGC* VGGEALG I AG T T GGTGGT It AGGCCC TGGGC* VGGXALG; AAMAAAAAA, A/VVWV\A/V\ Trinh tự binh thinrng I rinh tự có đột biro C.79G>A 1.480 1.481 Hỉnh 3.6 Kết quã giai trinh tự mầu THALỈ 1.482 Nhận xét: Tín hiệu đinh lẽn rõ ràng, khơng bị nhiều Tại vị trí c.79 1.483 mầu có đinh tín hiệu trùng tưưng ứng với hai nucleotid G A Đột biến TM/ V*: 36 làm thay đơi ba GAG mà hóa cho acid glutamic thành AAG mã hóa cho acid amin Lysin Như mầu nảy chứa dột biển C.79G>A (dị hợp tứ) T (dị hợp t) TM/ V*: 'V 37 ã2SAX ã2ôA Ị _ I :AGGGCĨGGGCATAgAAGTCAGGGCA ; AGGGCTGGGCATAAAAGTCAOGGCA 1.491 Innh IV x»it hiịn đột bWa -28AXĨ T (dị hợp tử) 1.494 Chương 4: BÀN LUẬN 1.495 4.1 Đánh giá kết quà tách chiết kiềm tra chất lượng DNA 1.496 Trong năm gần dây, với phát triền nhanh chóng cua khoa học kỹ thuật, ngành sinh học phân tử có bước phát triển vượt bậc Với nhùng công nghệ ngày đại hơn, ngày cảng nhiều kỳ thuật can thiệp vảo vật chất di truyền dược thê Cùng với điều phai kê đen tầm quan trọng cua kỳ thuật tách chiết DNA 1.497 Như đà biết, kỳ thuật tách chiết DNA bước ban đầu liên quan trọng anh hướng trực tiếp đen kỳ thuật sinh học phân tử Kiêm tra chắt lượng DNA ca nống độ độ tinh bước cấn thiết quy trinh tách chiết DNA bới số lượng chất lượng DNA có the anh hưởng đen kết qua PCR, nồng dộ dư thừa cũa DNA nhiễm cãc chắt cồn cỏ thê gây ức che khuếch dại cúa DNA mong muốn 1.498 Trong nghiên cứu chúng lôi tiến hành lách chiết thành công DNA tỏng sô cua 15 mầu máu loàn phần cua người lãnh mang gcn bệnh Thalassemia Ket quã tách chiết kiêm tra bang điện di DNA tơng sổ trẽn gel agarose 0.8% ( Hình ) Kết TM/ V*: 38 diện di cho thấy DN'A tỏng số tách chiết thu tách chiết thu dược sạch, chất lượng tương dối tốt, hầu hết báng thu dược sac nét bị dirt gày Độ sáng cua cảc bâng có khác nhau, có bảng dậm giếng 1.2 6; có bâng mờ giếng 10 11 chứng lo hàm lượng DN/X cỏ sán phàm tách chiết cua màu khác lã khác Khi kiểm tra nồng độ dộ linh cua 15 mầu kết qua thu cho thầy cãc mầu DNA dược tách chiết linh vã du nồng dộ cho phan ứng PCR Trong nghiên cửu kỹ thuật tách chiết DNA dược tiến hành theo kít The Wizards Genomic DNA Purification cua hàng Promcga Ưu diêm thực tách chiết theo kit Promega hóa chầl dề dàng sir dụng, dám bao 1.499 vô trùng, sir dụng mà không cần pha chế san phẩm DNA thu dược có nống dộ độ tinh cao Bên cạnh dó vần cịn vài nhược diem phụ thuộc nhà sàn xuất, giá thành cao 4.2 Đánh giá độ nhạy (lộ đặc hiệu cùa kỳ thuật PCR vói cập mồi 1.500 Phán ứng PCR diễn hiệu phụ thuộc vào nit nhiều yếu tố dó phai kè đến chất lượng nồng dộ DNA khuôn, nồng độ thiết kể mồi dung dịch đệm, nong dộ nuclcotid lự Taq polymerase chu trinh nhiệt phán ứng 1.501 Nghiên cứu cúa chúng tói sứ dụng mồi nồng độ tương ứng pmol/pl với thê tích ().5pl nhiệt độ gắn mồi /thời gian gắn mồi sứ dụng 60*C 30 giây Môi lã nhừng diêm quan trọng can ý dê tạo sán phâm PCR dặc hiệu Nhiệt dộ gấn mồi câng cao thí độ đặc hiệu câng tốt vả kha nàng gắn mồi vảo DNA đích câng thấp, nhiệt độ thắp thí độ đặc hiệu giám, mồi gẩn vào DNA đích tổt nhimg có the gần cà vảo đoạn gen không mong muốn Nồng độ cao gây tượng mồi không đặc hiệu, nồng độ mồi thắp làm giam hiệu suất cua phan ứng thiếu mồi cho chu kỳ 1.502 GoTaq Hot Start Master Mix 2X thay the cho GoTaq Master Mix 2X phan ứng PCR Hoạt tính enzym Taq polymerase GoTaq Hot Start Master Mix cao gấp 1.5 lần so với enzym GoTaq Master Mix 2X nên giúp láng kha nâng (liền TM/ V*: 4Ả 'V 39 phan ứng Dong thời enzym Taq polymerase GoTaq Hot Stan Master Mix 2X dược gần với kháng thê kháng hoạt tính cùa enzym kháng the chi bị bất hoạt nhiệt độ cao giúp enzym hoạt dộng dặc hiệu giam lượng san phàm không dặc hiệu trinh khuếch dại Việc sư dụng GoTaq Master Mix 2X hay GoTaq Hot Start Master Mix 2X dã mang lại nhiều ưu diêm trinh thực phán ứng PCR giúp rút ngan bước chuẩn hóa thành phần cua phán ứng Như đe phan ứng PCR dạt hiệu qua cao thí viộc chuẩn hóa chu trinh nhiệt cho phan ứng PCR vò củng quan trụng 1.503 Chu trinh nhiệt cùa phân ứng PCR, gồm giai đoạn: giai đoạn biến tính, giai đoạn kéo dải giai doạn gắn mồi Giai doạn biến tính giai đoạn DNA khn bị biến lính, tách khỏi thành hai chuồi dơn thường khoang 94 - 95°c Giai đoạn gắn mồi giai đoạn nhiệt độ dược hạ xuống thích hợp cho phép doạn oligonuclcotid gắn với sợi DNA khuôn, thường khoáng 50 60°C Giai đoạn kéo dãi giai doạn nhiệt độ dược nâng 1.504 lên đền nhiệt dộ tối ưu cùa cnzym xúc tác cho trinh kéo dài chuồi, thường 72°c Nhiệt dộ giai đoạn biến tính kéo dài có biền đỏi khơng phụ thuộc vào kích thước doạn gen vả doạn moi sư dụng má thưởng ngưởng chung với nhiệt độ 95°c (giai doạn biến tính) 72°c (giai đoạn keo dài) Còn nhiệt độ gắn mồi phụ thuộc vào kích thước, trinh tự đoạn mồi sư dụng cần tính tốn, chuẩn nhiệt độ phù hợp với tửng trinh tự mồi khác 1.505 Dê kiêm tra san phẩm PCR có đặc hiệu hay khơng, lien hành kỳ thuật diện di gel agarose 1.5% Tỷ lệ agarose có ban gcl phụ thuộc vào kích thước cua đoạn gcn đích Do kích thước cua đoạn trinh tự cần khuếch dại nam khoáng từ 660781bp nên sứ dụng agarose ty lộ 1.5% thích hợp dê kết qua diện di rõ nét Kct diện di hình 9.1 vả 9.2 cho thay mỏi giếng diện di có bảng diện di sáng gọn rị nét khơng có bảng phụ, kích thước tương ứng với kích chuẩn cua đoạn gen cần khuếch dại Diều chứng to cập mồi dược sư dụng bắt cập đậc hiệu, chu trinh nhiệt càc diều kiện khác tối ưu giúp phán ứng PCR thực thánh công TM/ V*: 40 4.3 Đánh giá ý nghía cùa phương pháp giãi trình tự gen Sanger so vói phương pháp Multiplex ARMS PCR 1.506 Kỹ thuật Multiplex ARMSdược nghiên cửu đoạn dê phát thời dồng dược cácthê có SNP xác nhùng dộtPCR biến điếm nho TM/ V*: 4Ả 'V 41 1.507 định kiêu gen đồng hợp tư hay dị hợp tư cua mầu nghiên cứu [28] Do có độ xác cao, giá thành thắp phức tạp nên kỳ thuật sư dụng đe phát loại đột biến phố biến đột biến c.79A>C (p.Glu27Lys) gãy [*• Thalassemia Việt Nam Tuy nhiên, số lượng đột biến dược phát bị hạn chế lần chạy kỳ thuật, chi phát nhùng dột biến phơ biền đà biết Ví nghiên cứu sử dụng kỳ thuật giái trinh tự gen Sanger, dây phương pháp sinh học phàn tư đời từ sớm vã vần nguyên ý nghía nghiên cửu cho đen Với giái trinh tự Sanger, toàn trinh tự đầy đủ cũa gen HBB gồm cãc đoạn exon, intron, trình tự diều hịa phiên mà dịch mà có thê xác định trinh lự dam bao hầu het cãc dột biền liên quan đến [ỉ- Thalassemia có thê phát dưực Hiện kít dựa nguyên lý kỳ thuật Multiplex ARMS- PCR đe phát vả sàng lọc đột biến phố biến gây bệnh [T Thalassemia dược ãp dụng rộng rãi bệnh viện cho bệnh nhân, kỳ thuật giai trinh tự gen phương pháp Sanger lại phù hựp ứng dụng nhiều lum lại trung lâm nghiên cứu sinh hục phân lư cho người mang gcn bệnh vói mong muốn phát them nhiều dột biến trẽn gcnHSB 4.4 Đặc diem chi số cận lãm sàng cũa dột biến gcn phát hiệndưọc 4.4.1 Dột biển c, 79G>A 1.508 Tại vị tn C.79 thuộc exon I xay dột biến GAG>AAG thay I nucleotide gảy biếu hiện: 1.509 Quá trinh cắt intron nối exon xay bính thường, tạo nên chuồi p globin có thay dơi Ư acid amin thứ 26 acid glutamic thảnh lysin hĩnh thảnh nên Hemoglobin E 1.510 Kích hoạt vị trí cất - noi phân lừ tiên mRNA làm ngan chuồi |ì - globin gây nên Thalassemia (hình 14) 1.512 1.511 1.513 Hình 4.1 Mơ tà dột biến tạo vị trí cắt TM/ V*: 42 1.514 Dột hiến tụi codon 26 kích hoạt mối nối vị tricho nối GT cua codon 25 exon 1.515 I với vị trí nhộn nồi -ta cùa codon 30 think- exon lảm mat 16 nucleotide trẽn phân tư niR.V.4, làm ngần chuồi Ịỉglohin gày fi- Thalassemia 1.516 Chính ví dột biến lụi codon 26 gây bệnh HbE the p- Thalassemia dục biệt Người mang dột biến dị họp lư có HbAj giam cịn 66.5%, HbF làng cao tới 8,5%, llbA; có tý lộ trung bình 31,28% Hb (ồn phần ( trung bính mẫu mang gcn dột biển nghiên cứu này) Theo Suthat Fucharocn cộng (nám 1993) the phối hợp p- Thalassemia/HbE khu vực Dông Nam Á phô biến p-Thalassemia đồng hợp tư [6] Tại Việt Nam, theo Nguyền Công Khanh cs 1993 HbE phô biến Việt Nam tần số thay dõi từ Bắc đen Nam từ 1.24% den 55.9%, phô biển người dân tộc ứ người nhiều dân lộc Kinh, phô biến khu vực mien Trung Nam nhiều lum miền Bẳc[29J 1.517 4.42 Dột biển C.52A>T 1.518 ĐỘI C.52A>T dột biền vô nghia (nonsense nucleotide mutations) vị tnlệ C.52 Sự thay thè exon nucleotide 1hơn cua gcn Atoàn thành HBB dẫn den thúc sớm tạo thành so với mà binh kết thúc thường ƯAG vã làm tạo cho sân việc phâm dịch p-globin mà kết không gãy thê vừng bệnh bền nặng bị phá tning huy gian nhiều tế bào Dột thê biến nhẹ Người mang nhẹ đột cịn biến HbA> dị có hợp lý tư trung cỏ HbAj bính giam cịn 5.2% 94.5% llb HbF phần tảng TM/ V*: 1.519 4.43 Dột biền c.ỉ26-129(ielTCTT 1.520 Đây đột biến dịch khung xày cxon cùa gen HBB Đột biển tụi c.l26l29dclTCTT làm di đoạn gồm nucleotide TCTT, dần đến thay đỗi khung đọc mà di truyền, lãm thay dồi sán phẩm ịỉ-globin gây bệnh p Thalassemia Người mang dột biến dị họp tứ HbAj giám cịn 59.85%, HbA; có ty lộ trung bính 5.0% Hb toàn phần 4.4.4 Dột biển -28A>G 1.521 Đột biến -28A>G đột biến diem dột vùng khới dộng (promoter) trí -28 Đột hộp biến TATA thay cùa the gen IHBB nuclcolit Gcn A P-globin, thành biển c diều vịpkhiên mức bính ARN thường p-globin dần hoạt den động giam thấp tông hợp chuồi nhiều lằn so gáy với Thalas$emia TM/ V*: 44 1.522 KÉT LUẬN 1.523 Càn cừ vào kểt phân tích dưa kểt luận sau: 1.524 Áp dụng kỹ biển thuật giãi trinh gen Sanger dãmang phát phát HBB xác gây định bệnh dược PThalasscmia 15/15 mầu nghiên Phân cửu tích mang kết dột qua biến cho thấy li gen lộ biển C.79G>A dột gây biến bệnh HbE nghiên 9/15 cứu ti lộ lã đột 15/15 biến ti C.52A>T lệ đột lã 3/15 lại ti 28A>G lệ kiểu dột chiếm 1/15 c.l26-129delTCTT Tất cá 15lự mẫu lả nghiên 2/15 cứu đột biền dột biền có gcn dị hợp tư TM/ V*: 4Ả 'V 1.525 TÀI LIỆU THAM KHÁO 1.Cai L Bai H„ Mahairaki V cộng (2018) A Universal Approach to Correct Various HBB Gene Mutations in Human Stem Cells for Gene Therapy of BThalassemia and Sickle Cell Disease STEM CELLS Translational Medicine 7(1) 87 97 2.The Thalassemia International Federation: a global public health paradigm 3.Nguyen Công Khanh (2008) Thaỉassemia-Huyểt học lãm sàng Nhi khoa 4.Origa R (2018) B-Thalassemia University of Washington Seattle 5.Công thông tin Bộ Y tế https://moh.gov.vn i in-lien-quan-xiet-nam-co- khoang-12trieu-nguoi-mang-gen-benh-Thalassemia 6.Hirsch R.E Sibmooh N Fucharoen s cộng (2017) HbE/p- Thalassemia and Oxidative Stress: The Key to Pathophysiological Mechanisms and Novel Therapeutics Antioxidants & Redox Signaling, 26(14) 794 813 7.Abdaoui w Bcnouareth D.E Djcnouni A cộng (2019) Genetic 1.526 Background of 0- Thalassemia in Northeast Algeria with Assessment of the Thalassemia Severity Score and Description of a new p Thalassemia Frameshift Mutation ( HBB: c.374dup; 1.527 p.Prol26Thrfe* 15) Hemoglobin 43(4-5) 223-228 8.Phạm Quang Vinh (2006) Bệnh huyết sắc tố Bài giáng Huyểt học truyền máu Nhà xuất ban Y học 124-147 9.Old J Harteveld C.L Traeger-Synodinos J vả cộng (2012) Acknowledgements Thalassaemia International Federation 10 https://moh.gov.vn/documents/20182/212437/840 11 Vichinsky E (2016) Non-transfusion-dependent Thalassemia and Thalassemia intermedia: epidemiology, complications, and management Current Medical Research and Opinion 32(1), 191 204 12 Vichinsky E (2016) Non-transfusion-dependent Thalassemia and Thalassemia intermedia: epidemiology, complications, and management Current Medical Research and Opinion 32(1), 191 -204 13 Nam N.H Trục D.B (2019) Lién quan kiêu gen kiểu hình ỊlThalasseniía 14 Doro M.G Casu G Frogheri L cộng (2017) Molecular Characterization of p-Thalassemia Mutations in Central Vietnam, null, 41(2), 96 99 15 Vo L.T.T., Nguyen T.T Le I l.x cộng (2018) Analysis of Common pThalassemia Mutations in North Vietnam, null 42(1) 16- 22 16 Farmakis D Giakoumis A Angastiniotis M cộng (2020) The changing epidemiology of the ageing thalassaemia populations: A position statement of the Thalassaemia International Federation European Journal of Haematology- 105(1) 16-23 17 Nguyền Ọuang Tùng (2003) Càc thông so lề bào nưiu ngoại vi Huyết học Truyền máu bán Nhà xuất ban y học tr 84-85 18 Trần Vân Khánh Phạm Thanh Loan Hồ Câm Tú, Nguyền Đức llinh Trần Thị Oanh Trần Huy Thịnh Tạ Thành Vàn (2014) Phái hiên dột hiến gen gàv bệnh fỉThalassemia bang Kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR Tạp chí nghicn cửu Y học 90 (5) - 2014 17-25 19 Wajcman H vã Kiger L (2002) L’hemoglobine des micro-organismes 1’homme: un motif structural unique, des fonctions multiples Comptes Rendus Biologies 325(12), 1159 1174 20 Hegele R.A., Lahiry p., Al-Attar S.A (2008) Understanding B- Thalassemia with Focus on the Indian Subcontinent and the Middle East TOHJ.2(1) 13 21 Stamm o l.atscha u., Janecek p cộng (1976) Development of a special electrode for continuous subcutaneous pH measurement in the infant scalp Am J Obstet Gynecol 124(2) 193-195 22 Kumar R., Sagar c., Shanna D cộng (2015) p-Globin Genes: Mutation HotSpots in the Global Thalassemia Belt Hemoglobin 39(1), 1-8 23 Nguyền Khắc Hân Hoan et al Chân đồn trước sinh bợnlì Thalassemia 290 trưởng hợp Tạp chí Nghiên cứu Y học 74(3) - 24 Heather J.M vã Chain B (2016) The sequence of sequencers: The history of sequencing DNA Genomics 107(1) 1-8 25 Thein S.I Heskcth c Brown J.M cộng (1989) Molecular characterization of a high A2 [Ỉ Thalassemia by direct sequencing of single strand enriched amplified genomic DNA Blood, 73(4), 924 930 26 Ajaz s., Czajka A., vả Malik A (2015) Accurate Measurement of Circulating Mitochondrial DNA Content from Human Blood Samples Using Real-Time Quantitative PCR .Mitochondrial Medicine Springer New York New York NY 117 131 27 Voytas D (2001) Agarose Gel Electrophoresis Current Protocols in Molecular Biology John Wiley & Sons Inc Hoboken NJ, USA mb0205as51 28 Jalil T Yousafzai Y.M Rashid cộng (2019) Mutational Analysis Of B Thalassaemia By Multiplex Arms-Per In Khyber Pakhtunkhwa Pakistan J Ayub Med Coll Abbottabad 31(1).98-103 1.528 Khanh N.C Thu L.T., Trtic D.B vâ cộng (1990) Thalassemialỉaemoglobin Tropical Pediatrics 36(1) E Disease 43-45 in Vietnam Journal of B- 1.529 PIIỤ LỤC 1.530 Thông tin 15 mầu nghiên cửu vờ sổ chì sổ xét nghiệm cận lủm sàng 1.531 M 1.532 G 1.533 Nàm iới tính sinhMCH 1.545 a nghiên 1.546 ( pg) cứu 1.552 T HAL1 1.561 T HAL2 1.570 T HAL3 1.579 T HAL4 1.588 T HAL5 1.597 T HAL6 1.606 T HAL7 1.615 Ĩ HAL8 1.624 T HAL9 1.633 T HAL10 1.642 Ĩ HAL11 1.651 T HAL12 1.660 T HAL13 1.669 T HAL14 1.678 T HAL15 1.553 1.554 Nữ 983 1.562 1.563 Nam 986 1.571 1.572 Nử 1988 1.580 1.581 Nừ 1992 1.589 1.590 Nam 985 1.598 1.599 Nam 2020 1.607 1.608 Nừ 998 1.616 1.617 Nam 992 1.625 1.626 Nừ 997 1.634 1.635 Nừ 993 1.643 1.644 Nử 972 1.652 1.653 Nam 983 1.661 1.662 Nừ 992 1.670 1.671 Nam 2011 1.679 1.680 Nử 1991 1.534 M 1.536 Hb 1.537 CV Ai (%) HbA? 1.535 ( ÍL) 1.555 1.556 21.6 65.5 1.564 1.565 26.6 78.5 1.573 1.574 25 74.7 1.582 1.583 25.4 1.591 1.592 23.8 75.6 1.600 1.601 19.5 59.5 1.609 1.610 26 72.6 1.618 1.619 21.1 62.5 1.627 1.628 26.1 76.4 1.636 1.637 24 1.645 1.646 20 64.6 1.654 1.655 20.3 64.9 1.663 1.664 22.5 64.6 1.672 1.673 18.4 54.7 1.681 1.682 19.6 59.8 TC V*: 1.557 86.8 1.566 74 1.575 70.8 1.584 71 1.593 1.602 70.5 1.611 73 1.620 79 1.629 732 1.638 94.4 1.647 94.4 1.656 88.6 1.665 94.4 1.674 95.3 1.683 95.3 1.539 1.541 HbF HbE 1.538 1.540 1.542 (%) (%) (%) 1.558 1.559 1.560 4.7 26.5 1.568 1.567 8.5 1.569 1.6 24.4 1.577 1.576 1.578 3.7 25.5 1.586 1.585 1.587 3.6 25.4 1.595 1.594 1.596 5.7 93.6 1.603 1.604 1.605 3.5 2.6 23.4 1.613 1.612 1.614 3.7 23.3 1.622 1.621 1.623 4.2 15.7 1.631 1.630 1.632 23.8 1.641 1.639 1.640 5.3 0.3 1.649 1.650 1.648 5.6 1.659 1.657 1.658 5.9 5.5 1.667 1.668 1.666 5.6 1.676 1.677 1.675 4.7 1.685 1.686 1.684 4.7 ... •• Xác định đột hiên gen ỈỈBB gây bệnh /? ?Thalassemia hăng kỳ thuật giãi trinh t? ?gen Sanger "vởỉ mục tiêu: 1.52 Phát biến trênbàng gen phương P-globin ỡ người mang gengen tự gây Sanger bệnh |? ?đột. .. cầu gây tính trạng thiểu máu bệnh nhàn [2] Bệnh 0- Thalassemia gày bơi đột biến gen p globin nằm nhiễm sắc thè (NST) 11 Đột biền gen HBB phần lớn đột biến diêm [3] Cho đen dà có hem 900 dột biến. .. nguyên lý kỳ thuật Multiplex ARMS- PCR đe phát vả sàng lọc đột biến phố biến gây bệnh [T Thalassemia dược ãp dụng rộng rãi bệnh viện cho bệnh nhân, kỳ thuật giai trinh tự gen phương pháp Sanger lại