Xác định đột biến trên exon 4 của gen SRD5A2 gây bệnh thiếu hụt enzym 5a reductase týp 2

TKf V*: -u LỜI CAM ƠN Trong trinh học đại học khóa luận tốt nghiệp dấu ấn quan trọng trinh học tập vã nghiên cửu tnrờng Thời gian liến hãnh làm khóa luận lốt nghiệp khoa Kỳ Thuật Y học- Trường Đại học Y Hà Nội vừa qua đà giúp em học hoi nhiều điều, từ chuyên môn kiến thúc tác phong lãm việc từ Thầy cô anh chị bạn bè khoa Trước tiên, em xin bày tỏ cam on sâu sắc đến ThS Lẽ Hồng Bích Nga giang viên Bộ mơn Hóa Sinh lâm sàng Khoa Kỹ Thuật Y học Trường Đại học Y Hà Nội người Thầy đà hướng dần tận tính giúp đờ ln dưa nhùng góp ý q báu, sứa chừa ti mf lòi khuyên hừu ích tụo điều kiện giúp em hỗn thiện khóa luận tốt nghiệp Em xin cám on Ban Giám Hiệu Phòng Quân lý Đào tạo Đại học Trường Đại học Y Hà Nội dã tạo điều kiện thuận lợi giúp cm hồn thành khóa luận Em xin chân thành cam ưn sâu sầc lới Ban Giám Đốc anh chị kỹ thuật viên Trung tâm xét nghiệm Chemedic dà ln giúp dị cm tận lính dê cm có thê hồn thành khóa luận Em xin cam ơn đến Thầy cị mơn llóa sinh lâm sảng Khoa Kỳ thuật Y Học Trường Đại học Y Hà Nội lạo diều kiện tốt cho em dược thực khóa luận Cuối cùng, em xin gùi lời cam ơn lới gia đính, bạn bè dà quan lâm động viên, chia se khỏ khăn với em suốt trinh học tập Hả Nội ngày thảng nám 2020 Sinh viên HỒNG THỊ IIUYẾN TRANG Cộng hịa xã hội nghía Việt Nam TM/ V*: Độc lập - Tự - Hạnh phúc _**** _ LỜI CAM ĐOAN Kính gứi: Phịng Qn lý Đào tạo Đại học -Trường Đại học Y llà Nội Hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp Tơi xin cam đoan công trinh nghiên cứu cua với giúp đờ cua thằy cô Khoa Kỳ thuật Y học- Trưởng Đại học Y Hà Nội, tất cá số liệu khóa luận lã trung thực vã chưa cõng bố bất cử cóng trinh nghiên cửu não khác /ỉà Nội ngày tháng nàni 2020 Người viết khóa luận Hồng Thị Huyền Trang TM/ V*: DANH MỤC VIÉT TẤT bp base pair dd.NTP DHT Dideoxyribonucỉeotid triphosphate Dihydrotestosteron DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxyribonucleotid triphosphat DSDs EDTA FSH LH Disordnerof sex development Ethvlen diamine tetraacetic acid • Follicle stimulating hormone Hormon Luteinizing OD Optical Density (Dộ hằp thụ quang) PCR Polymerase Chain Reaction (Phan ừng khuếch dại chuỗi polymerase) T Testosterone SRD5A2 Steroid 5-alpha-reductase TM/ V*: MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN D AN H MỤC BÂN G DANH MỤC HÌNH DANH MỤC VIÉT TÁT 4.1 IKn I Lv/Ạỉì ••■•••■••■■•••a ■»•••■»• TÀI LIỆU THAM KIIO ãããããããããããããã ããã*ôããã ããããããôãããããããããã M ããããã DANH MC BANG DANH MỤC HÌNH ĐẠT VÁN DÈ Bệnh rối loạn phát triển giới tính (DSDs) lã nhóm bệnh lý rối loạn gặp dặc trung hoi bất thường nhiễm sắc the tuyến sinh dục biêu xác định phát iricn giới tính Tỳ lệ bệnh nhân mắc bệnh DSDs chưa thống kê rõ ràng the giới Bệnh thiếu hụt cnzym 5«-reductase týp sổ bệnh điên hỉnh cùa bệnh loạn phát triền giới lính nhóm bệnh 46.XY DSDs Bệnh nhân thiếu hụt enzym 5ơ-rcductase týp có dặc diêm lãm sàng như: dương vật nhó lỗ đái thấp, bíu chẽ đơi ân tinh hồn Những bất thường có thê dược xãc định sớm tử thai kỳ nhờ siêu âm ỡ giai doạn sơ sinh, trê có quan sinh dục không rõ ràng, tuyên sinh dục vã quan sinh dục không phũ hợp với đặc diêm nhicm sac thê giới tính; giai doạn dậy thi trè có bệnh lỷ loạn phát triển giới tính Nguyên nhàn gây bệnh thiểu hụt cnzym 5«-reductase tỷp - enzym xúc tác chun dơi testosterone (T) thành dihydrotestosterone (DHT), dỏng vai trò trung tâm phân hóa giới tính sinh lý androgen, tàc dộng trục tiếp vào phát triên giới tính nam giới F.nzym 5a- reductase týp dược mà hóa bơi gen SRD5A2 Nghiên cửu cho thấy, bất thường gen SRD5A2 lãm thay dôi giám nồng dộ hoạt tính cua cnzym 5«- reductase tỷp 2, dẫn đến giam hình thành DI IT gây nên xuất cua quan sinh dục khơng diên hình Đẽ chân đốn bệnh thiều hụt cnzym 5(í-rcductase tỷp câc bác sỳ dựa vào đặc diêm làm sàng bat thường, dục diêm cận lâm sàng: xét nghiệm cãc hormone, mô bệnh học tuyến sinh dục phản tích nhiễm sầc thê Dê khắng dịnh chắn đoán, bệnh nhãn nghi ngờ mắc bệnh thiều hụt enzym 5u-ređuctase týp cần dược tiến hành phân tích dột biến gen SRD5A2 cấu trủc gen SRD5A2 gồm exon, dó exon dà cịng bơ có nhiêu dột biên liên quan dến chức nàng vã hoạt tính cua enzym Xuất phát từ thực tế chúng tơi thực đề tài: *• Xác định dột biến cxon gen SRD5A2 gây bệnh thiếu hụt cn/.ym 5«-reductase týp 2” với mục tiêu: "Phãt đột biến exon cùa gen SRD5A2 bệnh nhàn bị thiều hụt enzym 5a-reductase tỹp CHƯƠNG I: TÒNG QUAN TÀI I.IẸƯ 1.1 Bệnh thiếu cnzvm 5«-reductase týp 1.1.1 Giới thiệu bệnh DSD Bệnh rối loạn phát triển giới tính (DSDs) lã nhóm bệnh lỷ rối loạn hiểm gặp thường dược đặc trưng bơi đặc diem bất thường nhièm sắc thê tuyển sinh dục kiêu hỉnh thường xác định phát triển giới tính Bệnh nhàn cỏ đặc diêm quan sinh dục bất thường tre sơ sinh có dặc diêm dậy thi' muộn thiểu niên [1] Sự phát tricn giới lính bao gồm ba giai đoạn: (I) thiết lập giới tính di truyền thời diêm thụ tinh (2) giai đoạn tạo thành quan sinh dục trinh biệt hóa luyến sinh dục (3) biệt hóa kiêu hình tuyến sinh dục dần đen khác biệt cua quan sinh dục ngồi xoang niệu sinh dục theo giới lính [2], NTgèpốii ri ô* uMt.ới Miu dc KbtaifB 4ằ xôp aáa dio IZ= Dtrang vịt Am vịt Xtpaip Bm mói ptengltB Xép Biệo đạo Bm toói pùttg 10 tail Điudxrangxịt Móikn Mài bi ÀmUf a Tki«dtra»t4l Mớ Blệ« Màimđạo ELm.mẻa _ Ị Khimh 10 Hình 1.1 Hình thành quan sình dục nam nữ giới (Nguồn: Britannica) Cơ quan sinh đục phát sinh lừ mấu sinh dục bìu mơi phổng lên nếp niệu dạo Ớ nữ giới, chúng trớ thành âm vật môi lớn môi bé nam giới, ánh hưởng cùa dihydrotcstostcron mấu sinh dục trờ thành quy đầu cúa dương vật nềp gấp niệu sinh dục dài vả hợp lại dê tạo thành trục cua dương vật hạch sinh dục nói len hợp đe tạo thành biu Quá trinh hợp hoàn thành sau 70 ngày tuôi thai phát triển cùa dương vật tiếp tục kéo dải [3] Sự biệt hóa cùa nừ giới khơng bị anh hương cua nội tiết tổ phát triển bính thưởng cua quan sinh dục nam địi hói tống hợp testosterone bính thường, chun dỏi thành DHT bơi 5«-reductase thụ thê androgen bính thirờng Năm 2006 nhóm chuyên gia Hiệp hội Nội tiết Nhi khoa châu Àu (ESPE) Hiệp hội Nội tiểt Nhi Lawson Wilkins (LWPES) dà đề xuất phán loại cho DSDs Theo rối loạn dược chia nho thành: - Nhóm bất thường nhiễm sẳc the giới tính - Nhóm cỏ nhiêm sắc the: 46 XY DSDs (rối loạn phát triền linh hỗn (ví dụ rỗi loạn phát triển luyến sinh dục hỗn tồn / phần DSD buồng trứng thoái triền tuyến sinh dục) vã rối loạn tống hợp androgen) - Nhóm có nhiễm sắc thè: 46 XX ĐSDs (rối loạn phát triẽn buồng trứng (ví dụ loạn sinh dục DSD buồng trứng vã DSĐ tinh hoãn) vã rối loạn dư thừa androgen [4], Theo thuộc phân nhóm loại bệnh 46.triển bệnh XY DSDs thiếu bao hụt gồmhay enzym 5a-rcduclasc rỗi týp luyến sinhđộng tác dục androgen phát tinh hoàn suy yếuloạn tốngcua hợp và2 31 ❖ l ien hãnh chạy điện di: Tiến hãnh chạy diện di màu DNA với Marker hiệu diện 130V vòng 30 phút 2.6.6 Giái trình lựgen phân tích kết q Sau kiêm tra sán phàm PCR dạt yêu cầu sè dược gừi di giai trinh tự máy tự dộng Kết qua giái trinh lự se dược so sánh với trinh lự chuẩn NM 000348 cùa gen SRD5A2 ngàn hãng Gen Bank 2.7 Vấn đề đạo đức nghiên cứu - Trước tiến hành thu thập thòng tin mầu bệnh phẩm dược đồng ý cùa gia đình bệnh nhân tự nguyện tham gia nghiên cứu - Nghiên cứu dược dám bao tuân thu quy định dạo dức nghicn cứu Ysinh hục Các kỷ thuật, thao tác thực nghiên cứu dược dam bao dũng chuyên môn TM/ V*: 32 Cl I L ONG III KÉT QƯÀ 3.1 Kct quà tách chiết DNA Các mẫu DNA lách chiết từ máu ngoại vi cua bệnh nhân theo kil QIAGEN Sau tách chiết, mầu DNA dược kiêm tra nồng dộ độ tinh bang phương pháp đo mật độ quang học máy NanoDrop One bước sóng 260nm 280nm Kct qua đo nông độ vã độ tinh cùa mẫu DNA bệnh nhân c»u I 5000 im A2eO(IOrrwnpa tf9 O.MI un 1st Ẽ Hình 3.1: Kef đo mật (lộ quang học máy Nano Drop One cùa mầu SRD5A2- 03 sau tách chiết ĩ aa a- _ _ J Bàng 3.1 Kêt quũ nông độ dộ tinh cua cúc mâu DXA Độ tinh DNA Mã bệnh nhân Nồng (lộ DNA (ng/pl) (A:ốfr'A:so) / (A:«/AXJO) SRD5A2-01 502 1,71/2,09 SRD5A2- 02 68,4 1.8/2,05 SRD5A2- 03 88.7 1.89/1.91 Nhận xét: Từ bang 3.1 cho ta biết TC V*: 33 - Cãc mẫu DNA tách chiết có nồng độ DNA > 50 ng/pl - Độ tinh (A26O.28O) dao động khoang 1.71- 1.89 tỷ sổ (A260/A230) >2 => Các mầu DNA dược tách chiềt tương dối đạt yêu cằu đê thực cho phan ứng PCR 3.2 Kct quã khuếch dại exon cúa gen SRD5A2 Sau tách chiet DNA từ máu ngoại vi, bước khuếch dại exon gen SRD5A2 Sau dó sân phàm PCR sê diện di gel agarose 1.5% cho kết qua sau: Hìnli 3.2 Kấ qua điện di sàn phẩm PCR geỉ agarose 1,5% Chú ứìich: TC V*: 34 - M: Thang chuẩn DN A lOObp - (+): Chứng dương - (-): Chứng âm - 1-3: San phàm PCR cua bệnh nhân lần lưựt SRD5A2-O1 SRD5A2-02 SRD5A203 Nhận xét: Các bâng DNA tương đối rờ nét khơng cớ bâng phụ hình anh rờ ràng, du điểu kiện cho phán ứng tiềp theo 3.3 Kết giãi trinh tự exon cùa gen SRD5A2 Sán phẩm PCR tiếp tục sư dụng cho kỳ thuật giai trinh tự Kct qua giái trinh tự gcn so sánh với trinh tự chuẩn, biến dối gcn dược ghi lại trinh bảy ưên Bang 3.2 vã Hình 3.3 3.4 3.5 Răng 3.2 Kết dột hiển gen SRD5A2 bệnh nhân thiểu hụt enzyme 5a-redudase tuýp Tên (lột biến Thể (lột biến Bệnh nhân Ý' nghía SRD5A2-01 c.680G>A, pArg227Gln DỊ hợp tư Giám hoạt lính SRD5A2-02 C.680G>A pArg227Gln DỊ hợp tư Giám hoạt tính SRD5A2-03 c.607G>A p.Gly2O3Ser DỊ hợp tư Giam hoạt lính AAAWVVM'AM WWWUAAAM AAM/WW'A/AVA 100 w CTTGGTCCCTCCCAGCACTTGCATTTGCATTTTTCTCACTTTGTTTCCTTGGGCTGC^i W/WMMM M M MMA /WWM\ CCTCCGAGCTT GCTGCAAGCTT c.6S0G>A p Arg227Gln (Dị họp tứ) TC V*: 7^ E 35 B\SRD5/\2-OI Hình 3.4 : Hình (inh đột biền exan cũagen SRD5A2 cùa bệnh nhân Người binh thưởng Exon SRD5A2- 01 III ắc bệnh thiều hụt enzyme 5a-reductase týp Nhận xét: Tín hiệu dinh lẽn rị ràng, khơng bị nhiều Tại vị trí C.68O mầu SRD5A2-01 có hai dinh tín hiệu tương ửng với hai nuclcotit G A So sánh với trinh tự gổc mầu có dột biến c.680G>A (dị hợp tư) TC V*: 36 GCTGCGAGCTT HhKTWI HKMWA.’-OC Hình 3.5 Hình ánh đột hiền exon genSRD5A2 cùa bệnh nhân SRD5A2- 02 mắc bệnh thiểu hụt enzyme 5a-rednctase týp Nhận xét: Tín hiệu đinh lên rị ràng, khơng bị nhiều Tại vị tn'c.68O mầu SRD5A2-O2 có hai đinh tín hiệu tương ứng với hai nuclcotit (ì A So sánh vời trinh lự gốc, mầu có đột biên c.680G>A (dị hợp lư) Hình 3.6: Hình anh dột biển exon cũa gen SRD5A2 cua bệnh nhân I TGGATCGGCTA TGGATCAGCTA Ngươi t>nh thươr* ÍMXl4 c.6O7G>A.pGh2O)SA (dị hợp tư) CHƯƠNGn BÀN LUẬN • TC V*: 37 4.1 Kct tách chiết DNA Sự phát triển mạnh mè cùa sinh học phàn từ, đặc biệt phát triển ứng dụng ngành y học nàng cao chất lưựng chẩn doán chửa bệnh, ủng dụng sinh học pliàn tứ y hợc phương pháp chân đoán tiên tiến, hồ trọ diều ưị trúng đích, dậc biệt chân dốn vã điều ưị bênh nhiẻm trùng, ung thư bệnh di truyền vã chân dốn trước sinh Trong nghiên cứu chúng tơi sứ dụng kỳ thuật giãi trinh tự gcn máy tự động đe xác định đột bicn gen SRD5A2 gày bệnh thiều hụt enzyme 5« reductase tuýp nhiên vi’ nhiều hạn chế nên bãi nghiên cứu sè chi xác định dột biến exon cùa gcn Muốn xác định trinh tự gen trước hềt cần phái có DNA cua bệnh nhân Đây lã bước lả quan trọng DNA chất lượng sỏ anh hướng vả khơng tiến hãnh kỳ thuật tiểp theo phía sau quy trinh nghiên cứu Khi tách chiết DNA cần phái báo dam nguyên vẹn tối da cẩu true DNA không bị phả huy bơi tác dộng vặt lý (do thao tác), hóa học (hóa chất) hay sinh học (enzyme nội bào ngoại bão) Đe san phẩm tách chiết DNA dưực lốt nhất, kỹ thuật cua kỹ thuật viên thực phải thật cân thận, chắn, bước thực theo quy trinh chuẩn dam bao độ xác khơng làm lây nhiễm q trinh tách chiết Khi tách chief can dam bao dụng cụ thật linh dược hấp khử trùng trước sư dụng, hóa chất khơng bị nhiễm lạp chất Sau lách chiết xong cần báo quán DNA 4°c sư dụng irong gian ngắn cần báo quán -20°C thời gian dài Tách chiết DNA lừ máu ngoại vi nham thu lượng ĐNA lớn nhai lừ tế bào có nhân, cụ thê tế bảo bạch cầu San phẩm DNA không chi cần tốt mật số lượng mà cần phai tinh sạch, không bị dứt gày, khơng lần lần chất protein, lipit, cacbohydrate, cãc chất gây ức che phan ứng PCR Hiện có nhiều phương pháp tách chiềt DNA lắt cá dựa nguyên lý: phá màng, loại bó lúa protein, lúa thu DNA Tùy vào mục đích nghiên cứu TC V*: 38 mà lựa chọn phương pháp tách chiểt DNA phù hợp Trong nghiên cữu nảy kỳ thuật tách chict DNA lữ mâu ngoại vi dược tiền hãnh theo kít QIAGEN Ưu diêm kit lã quy trinh tách chiết đưực toi ưu hóa dơn gián, dẻ thực vã liềt kiệm thời gian Kỳ thuật viên khơng cần lự pha hóa chất, dam bao chất lượng tinh nồng độ DNA thu Tuy nhiên giã thành xét nghiệm lớn so với thực xét nghiệm bang hóa chất tự pha thường quy Sau tách chict DN/\ sán phẩm cần kiêm tra nồng dộ dộ tinh Nghicn cửu sứ dụng phương pháp đo mật độ quang học máy Nano DropOne lại bước sóng 260nm 280nm dê kiêm tra nồng độ dộ tinh DNA Trong thành phần cấu tạo cua DNA có base purin pyrimidine hấp thụ ánh sáng tư ngoại đinh hấp thụ cực dại bước sõng 260nm Đo dó, giá trị mật độ quang bước sõng 260nm cho phép xác định nồng độ DNA mầu theo cõng thức: CoNAmxhaíM (ng/pl) = 50 X A Trong đó: A2KMJ: độ hấp thụ dung dịch DNA Ư bước sóng 260nm 50: hệ số chuyên dồi cùa dung dịch cỏ nồng dụ DNA sợi đôi n:hộ sổ phalồng () bước sóng 280nm protein cỏ mức hấp thụ cao nhất, nhiên DNA có thê hấp thụ dược nên có thê làm sai lệch giá trị thật cua DNA Ví vậy, ty sổ A;6O/A2SC cho ta biết dộ linh cùa mẫu tách chiết nhiều hay Neu chi số giói hạn 1.8-2.0 thí chắt lượng DNA sau tách chiết xem tinh du chất lượng dê thực phan ứng Từ thòng số báng 3.1 cho thấy : - Tất cá mẫu dam báo nông độ đê thực phan ứng PCR - Tý số A;60/A;SO nằm khoang 1.8 2.0; A:60/A;50 > cho thấy DNA tách chict tương đối tinh sạch, hồn tồn có the cho kết qua PCR tốt 4.2 Kết PCR TC V*: 39 Sau có DNA cua bệnh nhân, bước tiềp theo cua nghiên cứu khuếch đại cxon cua gen SRD5A2 với cặp dục hiệu bang kỹ thuật PCR Phan ứng PCR trinh tòng hợp sợi DNA dựa trẽn DMA khuôn nhở hoạt động xúc tác cua enzyme DNA polymerase PCR gồm ba giai đoạn chính: dầu tiên giai doạn biến tính Buồng u sè táng nhiệt độ lẽn khống 90- 95°c dê lách mạch dơi DNA thành sợi dim, giai đoạn gắn mồi lúc nhiệt độ sè dưực hạ xuống VC nhiệt độ cho phép doạn mồi gấn vói sợi DNA khuôn (55-65°C) cuối lả giai đoạn kéo dài nhiệt độ đưực nâng tới nhiệt độ tồi ưu cùa enzyme Taq DNA polymerase xúc tác cho trinh kẽo dài chuỗi, thường lã 72°c Sau kết thúc chương trinh máy sẻ dưa nhiệt độ 10°C dế bao quan DNA máy Thành Taq Polymerase phàn phan ứng dNTPs PCR dung gom có dịch DNA đệm khn, PCR cộp nước moi đặc DNA hiệu, khuôn enym làqua DNA phương dược pháp tách doloãng chiết mật dộ quang kiềm tra học nồng (Báng độ 3.1) vã dụ Mồi tinh dược thiết thông kế trinh xuất lự (heo dạng dông nghiên khô cứuvới Sau dà sư nhận dụng dược thành môi công tử nhả dược sân xuat san tiên mix thành hành pha phần phan moi ứng PCR sau toi ưu nồng hóa dộ nồng mồi dộ khác mồi cách thảnh phần khác nồng độ không thay đồi Dựa vào kết qua điện di chọn nống độ mồi tối ưu 10 pmol/pl Trong nghiên cứu nãy, chúng lôi dã sử dụng GoTaq Master Mix với thảnh phẩn bao gồm nồng dộ thích hợp cùa nuclcotid tự cnzym Taq polymerase dung dịch đệm với pH thích hợp cho phan ứng PCR xây tổt Nước sử dụng PCR phái nước cất khư ion khơng có chứa DNAase, RNAase enzym cat giói hạn khơng có thành phần gây ức chẻ phan ứng PCR Dê kiêm tra san phâm cua PCR cằn tiến hành kiêm tra diện di gel agarose 1.5% Phan ứng PCR dụt hiệu hình ãnh điện di có bâng DNA có kích thước phũ hợp với kích thước cùa đoạn gen dược khuếch đại với độ sảng nét cao Phan ứng PCR dặc hiệu hình anh diện di chi có bâng DNA cua đoạn gen khuếch dại gọn rị nét khơng có báng phụ khơng có tín hiệu nhiêu, tượng smear, thừa 4.3 Kết q giãi trình tự CXOIÌ gen SRD5A2 Phương pháp giãi trinh tự gcn giúp việc xác định đột biền trẽn gcn SRD5A2 trờ nên dè dâng độ xác cao Tuy đế có dược kết qua giai trinh lự xác cần dam báo diều kiện phan ứng diễn tốt Do yếu tố định ket qua giai trinh tự sán phấm PCR Trên thực tế tnrớc tiền hành giai trinh tự chúng tơi dà TC V*: 40 chn hóa điều kiện de sán phẩm PCR thu dược lối ưu nhất, cụ the lả hình ãnh bâng diện di PCR rị net khơng dirt gảy khơng cỏ vạch phụ Từ dô dam bao kết qua giai trinh lự thu dược cho hình anh rị nét tín hiệu nen thấp, có thê dọc dược rị ràng, xác độ tin cậy cao Trong nghiên cứu dã sư dụng phương pháp giãi trinh tự gcn trẽn máy tự dộng cua hàng Apical Scientific Sequencing de xác định trinh tự nucleotid cua exon trẽn gen SRD5A2 4.4 Kốt quà đột biến gen SRD5A2 Sau giai trinh lự mẫu thu dược, chủng tiến hành đọc phàn tích kết qua giãi trinh tự bệnh nhàn phát dược dột biến: c.680G>A (ờ bệnh nhân SRD5A201 SRD5A2-02) c.607G>A (ớ bệnh nhản SRD5A2-O3) Dột biến c.607G>A, p.Gly203Ser Dây dột biến dicm lãm thay acid amin Glycine thành acid amin Serine Dột biển trẽn acid anin 203 acid anin nam trẽn khu vực chức nâng cua protein Dây vùng có trinh tự lập lại cua acid amin Serine đột biến dà công bo gây bệnh Trên the giới, nghiên cứu cua Wilson cộng nãm 1993 chứng minh hầu het đột biển nam giừa condon 197 vả 230 cùa cxon lâm cho enzyme giam hoạt tính rị rệt không hoạt động [25] Dột biến p.Gly2O3Ser lã dột biến làm mắt chức enzyme gây bệnh thiêu hụt 5a- reductase tuýp Đột biến p.Gly203Ser dược tím thấy dầu liên bệnh nhản nam Mexico the dị hợp lư kép (pGl I5D P-G2O3S) [261 Sau dột biến dược nghiên cửu phát phò biến Trung Quốc chiêm ty lộ tương dối cao gặp sổ quần thê người châu Á Hân Quốc [27] Thãi Lan [28] Đột biến c.680G>A p.Arg227Gln Dây đột biền thay đôi nuclcotit thứ 680 từ G thành A lâm thay dôi acid amin thứ 227 lừ Arginine thành Glutamine Dột biến xay alen gày nên thè dị hợp nguyên nỉiân làm giam lực cùa liên kết enzyme 5a- reductase với NADPH gây rỗi TC V*: 41 loạn chức nàng enzyme Trong nghiên cứu sinh hóa invitro cho thấy dột biền p.Arg227Gln làm giâm Vmax cùa enzyme xuống tương dương 3.2% so với enzyme cùa người bính thưởng dần đến bất thường kiêu hình [7] Các dột biến sai lệch sè làm giám 0.4% hoạt lính cúa enzyme gây quan sinh dục khơng rị ràng, nhừng đột biến gày giam hoạt tính từ 3-15% sè biêu nam tính hóa quan sinh dục ngồi tre nữ [22] [23] Đột biền p.Arg227Gln phó biến khu vực châu Ả Các nghiên cứu khác giới đà phát nhiều bệnh nhãn mang đột biến trạng thái dị hợp tứ: Nhật Băn [24], Trung Quốc [21] vã Việt Nam [8], Trong nghiên cứu the giới trước lỉm thấy đột biến hai anh em gốc Việt, có dậc diêm lâm sàng: người có biêu tụt bíu với bíu hai dương vật nho người có dương vật nho quan sinh dục nam bính thường tỳ lệ T DHT cao bắt thường sau kích thích hCG kéo dài [19] Vị trí acid amin 227 nhùng "diêm nóng” cua gen SRD5A2 cần có biến đỗi nhó sè làm thay dôi cầu trúc vã chức nâng cua protein Do dây dột biển thường xay exon cua gen SRD5A2 Bệnh nhân phũ hợp với biêu lâm sảng dương vật nhó lồ đái thấp the nặng gổc dương vật Kct qua steroid niệu bầt thường, có lý lộ 5«- THF/THF thấp giá trị tham chiếu Trong cừ khn khó nho khóa (3 bệnh luận nhân) tốt nghiệp, nên chưa nghiên the khăng cứu chi dịnh liền dược hành tyđề lộ phát cờ mẫu kin biến cua có gen so SRD5A2 sành với Nghiên mầu cứu người nèn bính đưực thường mơ rộng có dược quần thê cãi ớdột người nhìn tổng Việt quan Nam VC tý lệ đột biền vã đa hình TC V*: S KÉT LUẬN Căn vào kết qua phân tích cho phép rút kết luận sau: Nghicn cứu đà áp dụng quy trinh xác định đột biến cxon cùa gcn SRD5A2: Bệnh nhân SRD5A2- 01: Đột biến c.680G>A (p.Arg227GIn) dị hợp tử Bệnh nhàn SRD5A2- 02: Dột biển C.68OG>A (p.Arg227Gln) dị hợp lư Bệnhtứ nhân SRD5A2- 03: Dột biến c.607G>A (p.Gln2O3Scr), dị hợp TM/ V*: TÀI LIỆU THAM KHÁO Ahmed F Kyriakou A Tobias E cộng (2015) Disorders of sex development: advances in genetic diagnosis and challenges in management AGG 165 Yên H.T.T RỎI LOẠN PHÁT TRIỂN GIỚI TÍNH TRÊ EM 10 Kumar G vả Baiboza-Meca J.J (2021) Alpha Reductase Deficiency StaĩPearls StatPeark Publishing Treasure Island (FL) Sreenivasan R Alankarage D vã Harley V (2017) Disorders of Sex Development Loci Reference \fodule in Life Sciences Elsevier Sasaki G Ishii T Hori N cộng (2019) Effects of pre- and postpubertal dihydrotestosterone treatment on penile length in 5a-reductase type deficiency Endocrine Journal, 66(9) 837 842 Kumar G Baiboza-Meca J.J (2021) Alpha Reductase Deficiency StatPearls StatPearls Publishing Treasure Island (FL) Maleki N Kalantar Hormoá M Iranparvar Alamdari M vả cộng (2013) 5-Alpha-Reductase Deficiency in a Woman with Primary' Amenorrhea Case Repons in Endocrinology-, 2013 1-4 Nga L.H.B Anh T.T.N Mai T.T.C (2019) Xác định đột bicn gen SRD5 A2 gây bệnh thiếu hụt enzym 5ơ-reductase 2.8 Swerdloff R.S Dudley R.E Page S.T vã cộng (2017) Dihydrotestosterone: Biochemistry’ Physiology, and Clinical Implications of Elevated Blood Levels Endocr Rew 38(3) 220-254 10 Anh T.T.N Nghiên cứu dịnh lowngj steroid niệu GC MS chần đoán rối loạn sinh tống họp steroid bắm sinh tre em 11.SRD5A2 steroid alpha-reductase [Homo sapiens (human)] - Gene - NCBI accessed: 08/05/2021 12.SRD5A2 Gene - GeneCards S5A2 Protein S5A2 Antibody accessed: 17/05/2021 14 Xiao Q Wang L Supekar s cộng (2020) Structure of human steroid 5a-reductase with the anti-androgen drug finasteride Nat Commun 11(1), 1-11 15 Vilchis F., Mendez J.P Canto p cộng (2000) Identification of missense mutations in the SRD5A2 gene from patients with steroid 5alphareductase deficiency Clin Endocrinol (Oxft, 52(3) 3S3 387 16.SRD5A2 gene: MedlinePlus Genetics accessed: 29/04/2021 17 Li S.-P Li L.-W Sun M.-X cộng (2018) Identification of a novel mutation in the SRD5A2 gene of one patient with 46.XY disorder of sex development Asian JAndrol 20(5) 518 519 18 Femandez-Cancio M., Nistal M Gracia R vã cộng (2004) Compound heterozygous mutations in the SRD5A2 gene exon in a male pseudohermaphrodite patient of Chinese origin J Androl 25(3), 412-416 19 Batista R.L Mendonca B.B (2020)

Integrative and Analytical Review of the 5-Alpha-Reductase Type Deficiency Worldwide

TACG 13 S3 96 20 Mendonca B.B Batista R.L Domenice s cộng (2016) Steroid 5areductase deficiency The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology 163 206-211 21 Makridakis N.M di Salle E vã Retchardt J.K (2000) Biochemical and pharmacogenetic dissection of human steroid alpha-reductase type II Pharmacogenetics, 10(5) 407 413 22 Forti G Falchetti A Santoro s cộng (1996) Steroid 5«-reductase deficiency: virilization in early infancy may be due to partial function of mutant enzyme Clinical Endocrinology 44(4) 477 482 22 Wigley W.C Prihoda J.s Mowszowicz I cộng (1994) Natural mutagenesis study of the human steroid alpha-reductase isozyme Biochemistry, 33(5) 1265-1270 24 Sasaki G Ogata T Ishii T vã cộng (2003) Micropenis and the 5aReductase-2 (SRD5A2) Gene: Mutation and V89L Polymorphism Analysis in 81 Japanese Patients The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 88(7) 3431 3436 25 Wilson J.D Griffin J.E.? Russell DAV (1993) Steroid alphareductase deficiency Endocr Rev 14(5) 577 593 26 Canto p Vilchis F Chavez B vã cộng (1997) Mutations of the 5areductase Type gene in eight Mexican patients from six different pedigrees with 5a-reductase-2 deficiency Clinical Endocrinology, 46(2) 155-160 27 Ko J.M Cheon C.-K Kim G.-H vã cộng (2010) Clinical characterization and analysis of the SRD5A2 gene in six Korean patients with 5alpha-reductase type deficiency’ Horm Res Paediatr 73(1) 41 48 28.Sahakitrungiuang T Wacharasindhu s Yeetong p vã cộng (2008) Identification of mutations in the SRD5A2 gene in Thai patients with male pseudohermaphroditism Fertility and Sterility, 90(5) 2O15.ell-2O15.el5 ... nlm.nih.gov/gene/6716> accessed: 08/05 /20 21  12 .SRD5A2 Gene - GeneCards S5A2 Protein S5A2 Antibody A, pArg 227 Gln DỊ hợp tư Giám hoạt lính SRD5A2- 02 C.680G>A