Tối ưu hóa quy trình kỹ thuật PCR khuếch đại một số exon gen slc25a13 gây bệnh thiếu citrin

TKf V*: -u LÒI CẢM ON Lởi em xin bày tơ lịng bicl ơn ưn sâu sắc tới Ths Nguyễn Thị Phương Thủy - Giang viên Bộ mòn Hoả sinh lâm sảng - Khoa Kỹ thuật Y học Trường Đại học Y Hà NỘI đà tận tinh dạy dỗ hướng dẫn dộng viên em thin gian hục tộp nghiên cứu đe hỗn thành khóa luận Em xin gưi lởi cám ưn chân (hãnh tái cãc thầy cô anh chị nhãn viên Trung tâm xét nghiệm đa khoa Chcmedic đà nhiệt tính hướng đản giúp dừ tạo điều kiện tốt đê em có the hỗn thảnh khóa luận lỉm xin gửi lời cam ơn tới Ban giâm hiệu, Phòng Quan lý lạo Dại họẹ cãc thầy cõ Bộ mơn Hố sinh Lãm Sàng, Khoa Kỳ thuật Y học trưởng Đại Học Y Hã Nội đà tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt quảng thời gian em học tập trường Cuối em xin cám ơn gia dính bạn bẽ dà ln dộng viên, giúp dờ lã chỗ dựa tinh thằn vùng chăc cho em học tập thật tổt Dù dà cố gắng đế thực hiỹn khóa luẠn cách tốt nhắt, dày lã lần dầu tiên thực nghiên cữu tam hiếu biết, kiến thửc hạn họp nẻn khóa luận cúa em côn rẩt nhiều thiếu sõt Em rầt mong nhận dược nhùng ỷ kicn dóng góp quý báu cùa thày cỏ vã cãc bạn đè khóa luận dược hoãn thiện Em xin chân thành cam ơn! Hà Nội, ngày 30 thủng nảm 2021 Sinh viên Trần Thị Thúy Lãnh TM/ V*: LỜI CAM ĐOAN Em lã TRÀN TH| THỦY LÀNH, sinh viên tồ 32 lớp Y4K chuyên ngành Cứ nhản Xét nghiệm Y học khóa học 2017 2021 trường Đại học Y Hà Nội xin cam đoan: Dây khóa luận ban thân em ưục tiếp thục hường dần cúa ThS Nguyễn Thị Phương Thủy Nghiên cứu không trùng lặp với nghiên cứu khác dược cơng bố tíũ Việt Nam Các số liệu vả thịng tin nghiên cửu hỗn tồn chinh xãc trung thực vã khách quan Em xin hỗn tồn chịu trách nhiệm trước phảp luật VC nhùng cam kết Hà Nội, ngày 30 tháng nàm 2021 Sinh viên Trần Thị Thúy Lãnh DANH MỤC TỪ VIÉT TAT VDƯM Vãng da ứ mật NICCD Neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency NST Nhiễm sác thê CTLN2 Adult onset type II citrullinmia FTTDCD Delayed development and dyslipemia caused by citrin deficiency AGC Citrin aspartate glutamate carrier ASA Argininosuccinate ASS Argininosuccinate synthetase PPAR-a Peroxisome Proliferator Activated Receptor alpha AFP Alpha-fetoprotein PSTI Pancreatic secretory ttypsin inhibitor MCT Medium chain triglycerid Solute carrier family 25 member 13 J Polymerase Chain Reaction SLC25AJ3 PCR T *m T Teampreture melting Nhiệt độ nông chay Teampreture annealing - Nhiệt dộ gắn mồi MỤC LỤC 2.2.1 2.2.2 Chắt liệu nghiên cữu Error! Bookmark not defined 2.3 Dốt tượng phương pháp nghiên cứu ERROR! BOOKMARK NOT DEFINE D 2.3.1 Dổi tượng nghiên cữu 25 25 2.3.2 P 25 hương pháp nghiên cứu 2.4 2.5 2.6 TÀI LIỆU THAM KHAO 2.7 PHỤ LỤC 2.8 DANH MỤC BÁNG 2.9 2.10 TM/ V*: 2.11 DANH MỤC HĨNH 2.12 2.13 2.14 ĐẠT VÁN ĐÈ 2.15 • 2.16 Cho tới ngày vàng da mật (VDƯM) tre em vần mót bệnh lý gan mật phức tạp vã đa dạng Nhờ ti én bỏ cùa sinh hóa lâm sàng, di truyền vã sinh hoe phân tứ nhiều nguyên nhân co chế bệnh sinh dà dằn duơc sáng to Mót nhùng nguyên nhàn gáy VDƯM tre em dươc xác định nhừng nám gần dãy bệnh VDƯM thiều citrin Đây lả bệnh lý di truyền lặn nhiêm sắc thê (NST) thướng dột biến gen SLC23A13 gày [1] Gen dược xảc dịnh vào nám 1999 lõi dà có 50 kiêu dột biên gen SLC23AJ3 cõng bỗ [2] Chức cua gen SLC23AỈ3 lã mà hõa tông hụp protein citrin chầt mang quan trọng thuộc protein vận chuyên qua mảng Sự thiều hụt citrin ánh hương đến quã trinh tỏng hụp protein, dưỡng phản sinh tơng hợpnucleotid vã nhiều q trinh chun hóa khác the [3] 2.17 Trên lãm sàng, thiểu hụt citrin biêu hiỳn it nhắt hai kiêu hinh dựa vào độ tuổi khới phát: VDƯM gan tré sư sinh tré nho (Neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency NICCD) lãng citrullin máu type II người lớn (Adult onset type II citrullinmia CTLN2) Ngoải gần dây kiêu hĩnh trung gian dã dược dể xuất, đặc trưng bới chậm phát triển rỗi loạn lipid mãu tre goi tảt FTTDCD (Delayed development and dyslipemia caused by citrin deficiency) Phần lớn trường họp NICCD xuất cãc triệu chứng vãi tháng dầu dởi như: VDƯM, gan lâch to, rỗi loạn dỏng máu triệu chứng dằn biển mat tré tròn tuổi Tuy nhiên số ưé tiếp tuc tiến triên thành FTTDCD vã CTLN2 với cãc triệu chửng liên quan dến thằn kinh, cô thè nguy hiem den tinh mạng khơng dưực chân dỗn vã điều trị kịp thời [4].[5].[6] 2.18 Sự thiều hụt citrin lần đầu ticn bão cáo Nhật Ban sau dược công nhận bệnh trẽn toản the giới với tý lộ lưu hãnh bệnh cao nước Đông Á Tần suất người mang gen bộnh cãc quằn the không dồng dều: Nhật Ban TM/ V*: 4Ả 'V 65 Trung Quốc: 63 Hàn Quốc: 108 [7] Tuy thuộc Đòng Á với tý lệ mang gen bệnh cao mải đến nỉm 2008 Việt Nam mói thực xét nghiệm di truyền xác định đột biển gen gảy bệnh Theo môt nghiên cứu tim hiêu nguyên nhân gãy VDƯM Bệnh viện Nhi Trung ương nám 2007 có tới 51,1% không xác định đưực nguyên nhân gãy bệnh vả sỗ rắt có thê cõ bệnh nhân thuộc nhõm bệnh thiếu hụt citrin [7], Tuy nhiên việc xâc định bệnh không phai điều dề dâng bới dấu hiệu lảm sàng xét nghiệm hóa sinh thơng thường thường khơng đặc hiộu [8] Chính vi kỳ thuật sinh học phàn tư đặc biệt lã PCR vàn công cụ hữu hiệu vã đáng tin cậy việc chân đoán xác định dối với bệnh nhản nghi ngớ mắc thiếu hụt citrin [9] Việc xây dụng quy trình PCR khuếch dại dặc hiệu do;m gen mà hóa tổng hựp protein citrin sè giúp phãt cãc đột biền gãy bệnh thicu hụt citrin xác Do dó em tiến hãnh đề tãi ‘Tối ưu hóa quy trinh kỹ thuật PCR khuếch dại sổ exon gen SLC25A13 gây bệnh thiếu citrin" với mục tiêu: 2.19 sổ exon Tắ gen iru SLC25AỈ3 hỏa quy trinh gáy bệnh kỳ thuật thiếuPCR citrin khuếch đại 2.20 2.21 Chương TONG QUANỉ TÀI LIỆU 1.1 Bệnh lý thiếu hụt citrin 1.1.1 Khái niệm bệnh lý thiến hụt citrin 2.22 Cĩtrin protein vận chuyền aspartate glutamate màng ty thè vói chức vận chuyển aspartate từ ty thê bào tương đồng thòi vận chuyền glutamate từ bào tương vào ty thẻ Ngoài rạ citrin cúng VỚI protein vận chuyền oxoglưtarate malatc tham gia vào kênh vận chuyển malate aspartate Việc thiếu hụt citrin dàn đền thiêu hụt aspartate tàng glutamate bào tương, cản NADHNAD’ dàn dển anh hương tới trinh chuyên hóa chu trinh urè, dưỡng phàn, tân tạo dường, tỏng hợp chắt béo vả lỗng hựp DNA/RNA [3] 2.23 Bệnh lý thiếu hụt citrin bệnh di truyền lận NST thường, dột biến gcn SLC25A13 gãy thiều hụt citrin dản tới rối loạn nhiều trinh chuyên hóa thê [1] TM/ V*: 4Ả 'V 1.1.2 2.24 Cơ chề bịnh sinh cùa bịnh lý thiều hụt cìtrin ỉ 1.2.1.Cẩu trúc cuaprớỉeĩn cữrin 2.25 cắu trúc cùa protein citrin mõ ta Hình 1.1 2.26 2.27 Hình 1.1: cầu trúc cúa protein cỉtrin [5| 2.28 Citrìn protein mâ hóa bơi gen SLC25.413 gồm 675 gốc axid amin với trọng lượng phàn tử 74 kDa [6], cầu tạo bời hai phần chính: 2.29 2.30 - Dầu N năm bào tương với EF motif có thê gắn Ca:_: Một motif EF cõ cấu trúc liên kết: vòng xoăn E chuồi lặp lại vịng xoăn F Cấu trúc dược mơ phong vị trí ngón tay vã ngơn tro cua bân tay; ion Ca:’ dược gắn kết bời lien két ion vịng xoắn lỳp (Hình 1.2) gãy kích hoạt citrin Citrin chi cỏ chức nhánh EF dược gắn vói Ca 2* Vi vậy, dạng dột biển gảy dừng tỏng hợp protein citrin dản tái phần toàn dầu N với càc nhánh EF sỗ khiên citrin không dược kích hoạt mầt hoạt tính [10] TM/ V*: 4Ả 'V 2.32.2.31 2.33 2.34 Hình 1.2: Mơ tã motif EF cùa protein Citrin [10] - Đầu c nằm mãng ty the có kênh vận chuyên xuyên màng Đầu c định vận chuyên cua citrin Việc vận chuyên aspartate tữ ty thê bảo tương dê tham gia chu trinh chuyên hóa gan yếu citrin dam nhiệm Trong aralar (một protein vận chuyên cỏ cấu tạo giống với citrin) gánh vác phần vận chuyên tố chửc ơcơ nầo [ ].[5].[ 11] [12] TM/ V*: 4Ả 'V 44 2.582 Kct qua khao sát mức nhiệt độ gán mồi lằn lượt lả 55 ỢC; 57°C; 58°C; 59°c PCR khuếch đại đoạn gen (1.3.6 9) thê Hình 3.1 Kct qua cho thấy: 2.583 Ó ca mức nhiệt dộ cảc đoạn gen I cho bàng sáng rị nét gọn vá kích thước Riêng đoụn gen sổ chi cho vạch sàng rỗ mức nhiệt cao lả 59°c So sành kết qua với kết qua gắn mồi lỷ tương cho từ phần mem cõ tương đồng: doạn gen Ẹ có nhiệt dộ gắn thấp, doạn gen cản mức nhiệt cao de đạt hiệu qua khuếch đại tối ưu 2.584 Dùng mức 59®c lãm nhiệt dộ gản đe khao sát trẽn 11 đoạn gen cua gen SLC25AỈ3 kết thu dược 10 11 bâng sáng gợn dứng kích thước; chi có nhẵt đoạn gen số xuất bàng phụ ngồi băng cớ kích thước 246 bp (Hĩnh 3.6) Với kết qua nãy, có thê sử dụng mức 59°c làm nhiệt độ gắn mòi phù hợp PCR khuếch dại đoạn gen 1,2.3.4,5.6.8,9.10.11 gen SLC25A13 Kct qua tương dối tương dồng với kết nghiên cứu Cua Qi-Qi Zhen vã cộng Sự (2016) việc phát đoạn dột biền trẽn exon cua gen SLC25A13 đà sư dụng 60°C làm nhiệt độ gắn mồi [40] Đây mức nhiệt gán mồi Zhan- Hui Zhang vả cộng Sự lựa chọn nghiên cửu phát đột biến xóa đoạn lớn trẽn exon cua gen SLC25AỈ3 vào nảm 2017 [41] 4.2 Tối ưu hóa số chu kỳ nhiệt PCR khuếch đại gen SLC25A13 2.585 số chu kỳ nhiệt phan ứng PCR thường phụ thuộc nhiều vảo nống dộ DNA khuôn ban dầu Trong nghiên cứu sữ dụng mẫu DNA tách từ máu tồn phằn với nồng độ DNA khn 21 ng uL Nống dộ không cao vần dam bao du lưọng dằu vảo cản thiềt dê thu dược đoạn gen đích mong muốn Với nồng độ mức chu kỳ nhiệt 30; 35; 40; 43 đẽ tiến hành kháo sát thu dược kết Hình 3.2 2.586 Với 30 chu kỳ nhiệt, vàn chưa khuếch đụi đu lượng DNA đích mong muốn, két qua ca bàng lên mờ Khi tàng dần số chu kỳ nhiệt, bàng thu đưực sáng rò hon Khi tâng dền 40 chu kỳ sỗ lượng DNA đích dược tạo rắt kin cá bảng sáng rị vã dũng vớt kích thước cịng bỗ Nhận thầy khơng có sụ khác biệt tảng từ 40 chu kỳ lên 43 chu kỳ Diều lã phù hợp với gia thiết việc giam thành phản phan ừng dặc biệt lả hoạt tinh cua enzym Taq polymerase dà không côn dam bao trinh luán nhiệt điền liên tục Vi đủ có chạy thêm nhiều chu kỳ nhiệt Iln’ lượng TC V*: 45 DNA đích thu dưực củng tàng lèn không dâng ke 2.587 Đê tiết kiệm thời gian vã hạn chế việc khuếch đụi cãc san phàm không đặc hiệu, khảo sãt gen SLC25A13 với 40 chu kỳ nhiệt Ket quã khuếch đại 11 đoạn gen dược thê trẽn Hình 3.6 với báng sảng gọn dũng kích thước Kẻt qua tương dồng với kết qua cùa Qi-Qi Zhen vả cộng vào nám 2016 nghiên cứu trẽn mầu máu toàn phần từ cãc bộnh nhân mấc NIC CD nhằm phảt đoạn dột biển trẽn exon cua gen SLC25AỈ3 [40] Tuy nhiên, theo nghiên cứu khác cùa Zhan-Hui Zhang cộng năm 2012 chi vởi 30 chu kỳ nhiệt dà có thẻ khuếch dại thành cơng đoạn gcn đích gen SLC25A13 từ mầu tể bão ối nuôi cấy từ thai nhi [42] Sự khác biột cõ thê đen tữ nồng độ DNA khuôn sứ dụng mồi nghiên cứu 4.3 TỐI ưu hóa thời gian kéo dài chuỗi PCR khuếch dại gen SLC25A13 2.588 Khi cài dặt chương trinh chạy PCR cho mảy, da sổ nhà nghiên cữu chi quan tâm tới nhiệt dụ gản vã sồ chu kỹ nhiệt tối ưu cho doạn gcn dích SC thường dê cố dịnh khoang thịi gian biến tinh, gấn mồi kẽo dãi chuồi Tuy nhiên, việc tìm mức thời gian tồi ưu cho giai đoạn quan trọng giúp hiệu qua khuếch dại doạn gcn đích lốt Đặc biệt, thời gian dỏ enzym Taq polymerase tiến hành kéo dãi chuồi thướng thay dơi dáng kê tùy thuộc vào kích thước san phàm khuếch dại 2.589 Bảng việc sứ dụng cặp Phụ lục cho đoạn gen cua gen SLC25AỈ3, sản phàm thu dược sau khuếch đại sè kích thước lằn lượt 426 bp 557 bp 307 bp vả 510 bp Đây lã cãc đoạn có kích thước tương đỗi lỡn nên khoang thời gian đẽ enzym Taq tiến hành gần lẳp rãp tong hựp mạch sè làu so với đoạn ngần Tuy cỏ kha gần tới 1000 bp I phút trái qua trình luân nhiột kéo dài hoạt tinh cùa enzym Taq polymerase sè khơng cịn (in định nhùng chu kỳ dầu hiệu khuếch dại đoạn gcn đích SC giam [3S] Chinh vi vậy, tiến hãnh khao sát thin gian kẽo dài chuỗi cãc mức thin gian 25; 30; 35; 40 giây thu kết qua Hĩnh 3.3 2.590 Với cà mức thin gian khao sát thu dược đoạn gen đích vin kích thước khơng có san phàm phụ Với 25 giãy vã 30 giãy kéo dài chuồi, cãc bâng thu đưực cỏ dộ sáng thấp lum so sánh với bâng mức thời gian dài hơn, dặc biệt bảng sổ Ket qua thu dược khơng có q nhiều khác biệt mức thời gian 35 TC V*: 46 giày 40 giày; băng thu sáng rỗ khơng có bâng phụ xuắt Vi vậy, cõ thê cài đặt khoang thời gian kéo dài chuỗi từ 35 40 giây cho phan ứng khuếch dại 2.591 Đè tiết kiệm thời gian mả vần đàm báo hiệu qua khuếch đại đoạn gen mong muốn, lựa chọn 35 giãy kẻo dài chuồi cài đật chương trinh chạy PCR Kháo sát với lụi trcn 11 đoạn gen cúa gen SLC25AJ3 Hinh 3.6 nhận thấy thòi gian đám bao khuếch đại dược tầt cà cảc đoạn gen mong muốn, bâng rị nét gụn dũng kích thước 4.4 Tối tru hóa nồng (lộ mồi PCR khuếch dại gen SLC25AI3 2.592 T rong phan ứng PCR chi cần thèm lượng nho mồi cỏ the dam bão khuếch dại dược cãc đoạn gcn đích mong muốn, thường dao dộng từ 0,1 2.593 pmol L Nồng độ mồi tối ưu tủy thuộc vảo lưựng DNA khuôn ban dầu vã sổ chu kỳ nhiệt sứ dụng Việc sư dụng quã nhiều mồi vừa gãy lầng phi vừa gia tàng kha nâng lụo cãc san phẩm không đặc hiệu Quá it mơi không đám báo trinh khuếch đại lượng gcn đích thu SC thấp Chinh vi vảy ticn hành khao sát nồng độ mồi mức 0,25: 0,5; 0,75; pinol/L vã thu kct qua Hình 3.4 2.594 nồng dộ mồi thấp 0,25 pmol/L: thu dược câc bảng sáng với kich thước Tuy nhiên, hiệu qua khuếch đại đoạn gen I nống dộ mồi chưa thục tốt, bảng mờ so sảnh với bàng ke cận Tảng nồng dộ mồi lên 0,5 umol L băng thu dược sáng rõ khơng có bảng phụ xuất gel Tiềp tục tâng lên mức 0,75 urnol L ngồi cảc bảng chính, doạn gen sỗ xuất hiộn vệt smear bàng phụ gcl diện di 2.595 Đẽ dam bao vừa tiềt kiệm mồi mà vàn khuếch dại tồt đoạn gen đích, nồng dộ mồi mức 0,5 umol L dược lựa chọn Với nồng độ này, 11 doạn gen đích trẽn gen SLC25AỈ3 dã dược khuếch dại thành công Hĩnh 3.6 với cãc bảng sáng rõ dứng với kích thước Tuy nhiên, bảng só ngồi báng vói kích thước 246 bp cịn xuất cua bàng phụ với kích thước lớn khống 300 bp vã 800 bp Các bảng phụ kích thước lớn có thê xuắt cập gan nhằm vảo cãc VỊ trí khơng đặc hiệu khác trẽn gen Việc sư dụng nồng độ quã cao thi thường chi lâm xuất cãc vệt smear cãc bàng phụ với kích thước nhơ cãc mồi tự bảt cụp Do dó trường TC V*: 47 hụp xuất bâng phụ doạn gen số có thê nguyên nhản nhiẻt dộ gấn mồi chưa phũ hụp gãy 2.596 Ket qua tối ưu nồng độ cùa chúng tỏi có khảc biệt so với nghiên cửu trước dó Trong nghiên cữu cua Qi-Qi Zhen cộng vào nãm 2016, vói 40 chu kỳ nhiệt nhả nghiên cứu can tới nồng độ mối 0,8 umol L đê dám báo hiệu khuếch dại đoạn gen mong muốn gen SLC25AJ3 [40] Côn nghiên cứu cua Hai-Yan Fu vã cộng nảm 2010 400 bệnh nhi Trung Quốc mắc NTCCD với chi 0.3 umol L nồng độ 30 chu kỳ nhiệt dà cõ thè khuếch dại thành cõng cãc đoạn gcn đích chửa đột biến cần tim [2] Sự khác biệt náy có thê nồng độ DNA khuôn ban dầu vã số chu kỳ nhiệt khao sát Hai-Yan I-U dồng nghiệp cua minh chí sừ dụng 30 chu kỳ nhiệt cho PCR nén lượng ban dầu cõ thê thắp so với nghiên cứu cua 4.5 Tối ưu hóa nồng độ DNA khn PCR khuếch đại gen SLC25A13 2.597 Nồng độ DNA khuôn cho PCR dao dộng tùy thuộc vào nguồn gốc cùa ĐNA khuôn Thông thường phan ứng cần từ 10 đền 10' phân tư tương ứng với nồng dộ DNA khuôn từ ng den 1000 ng đổi với DNA cua người [3S] Trong nghiên cữu tiến hành tối ưu hóa nồng độ DNA khn ban dầu thực chất lã di tím lượng DNA khn tơi thicu đê dám bao khch đại thành cịng doạn gcn đích mong muôn 2.598.DNA khuôn với nồng dộ 21 ng/pL dam bao độ tinh (do có tý số mật độ quang bước sóng 260 280 lả Ẹ902 (năm khoang 1.8 2:0)) pha 2.599 loàng dằn xuống mức thầp lã 15,75; 10,30; 5,25 ng/pL vả tiền hành kháo sát Ket qua thu the Hình 3.5, nhận thấy lượng DNA khn hạ xuống mức 5.25 ng ụL hiệu qua khuếch đại đoạn gcn đích bảng xuất mờ khó quan sãt đặc biệt đoạn gcn gằn bicn tren gcl diên di Khi tãng dần lượng DNA khuôn, bảng sáng rõ hon 2.600 gennên đích Đế đạt hiệu gen qua SLC25AJ3 cao chủng việc khuếch dưadộ dại khuyến đoạn cão ng/pL vã sư dam dụng bao cãc dộ màu tinh DNA khuôn cõ nồng dạt trẽn 10 TC V*: 48 2.601 KÉT LUẬN 2.602 Quỵ trình PCR khuếch đại số exon gen SLC25A13 gày bệnh thiêu citrỉn (lược tổi ưu sau: 2.603 Nhiệt độ gắn mồi: 59°c - Số chu kỳ nhiệt: 40 chu kỳ - Thời gian kéo dải chuỗi: 35 giây - Nồng độ mối tối ưu: 0.5 umol L 2.604 Nồng độ DNA khuôn: > 10 ngpL TM/ zfci V*: 4Ả 'V 49 2.605 KIẾN NGHỊ 2.606 cho doạn Cần gen tồi số ưu băng hỏa lại gen SLC25A13 điều cùa khắc phan phục úng tình PCR trạng xuắt phụ điệnkiện diđẽ gel TM/ V*: 4Ả 'V 2.607 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Kobayashi K Sinasac D s Iijima M et al (1999) The gene mutated in adult-onset type II citrullinaemia encodes a putative mitochondrial carrier protein Nat Genet 22 (2) 159-163 2.Fu H Y Zhang s R Yu H et al (2010) Most common SLC25A13 mutation in 400 Chinese infants with intrahepatic cholestasis World J Gastroenterol 16(18) 22782282 3.Saheki T Kobayashi K Iijima M et al (2002) Pathogenesis and pathophysiology of citrin (a mitochondrial aspartate glutamate carrier) deficiency Metab Brain Dis 17 (4) 335-346 4.Ohura T Kobayashi K Tazawa Y et al (2001) Neonatal presentation of adult-onset type II citrullinemia.Hwm Genet 108 (2) 87-90 5.Lu Y B Kobayashi K ưshikai M et al (2005) Frequency and distribution in East Asia of 12 mutations identified in the SLC25A13 gene of Japanese patients with citrin deficiency J Hum Genet, 50 (7) 33S-346 6.Tabata A Sheng J s ưshikai M et al (2008) Identification of 13 novel mutations including a retrotransposal insertion in SLC25A13 gene and frequency of 30 mutations found in patients with citrin deficiency J Hum Genet 53 (6) 534-545 7.Nguyen Thị Mai I lương Nguyen Thị Phương Mui Lý Thị Thanh Hả vã cộng (2009) Sàng lục đột biến thưởng gặp ưẽn gen SLC25A13 bàng kỹ thuật sinh học phàn tư Tạp Chi Nhỉ Khoa 2, 201-205 8.Yasuda T Yamaguchi N Kobayashi K et al (2000) Identification of two novel mutations in the SLC25A13 gene and detection of seven mutations in 102 patients with adult-onset type II citrullinemia Hum Genet, 107 (6) 537-545 Yamaguchi N Kobayashi K Yasuda T et al (2002) Screening of SLC25A13 mutations in early and late onset patients with citrin deficiency and in the Japanese population: Identification of two novel mutations and establishment of multiple DNA diagnosis methods for nine mutations Hum Mil tat 19 (2) 122-130 10 Cliaãn w J (2011) Relating form and function of EF-hand calcium binding proteins Ace Chem Res 44 (3) 171-179 11 Palmieri L Pardo B Lasorsa F M et al (2001) Citrin and aralarl are Ca(2-)stimulated aspartate/glutamate transporters in mitochondria EMBOJ 20 (18) 5060-5069 12 Del Arco A Satrustegui J (1998) Molecular cloning of Aralar a new member of the mitochondrial carrier superfamily that binds calcium and is present in human muscle and brain J Biol chem, 273 (36) 23327- 23334 13 Oishi K (2008) Citrm Deficiency Kagoshima University’ 14 Ah Mew N Simpson K L Gropman A L et al (1993) Urea Cycle Disorders Overview 15 Hayasaka K Numakura c (2018) Adult-onset type II citrullinemia: Current insights and therapy Appl Clin Genet 11 163-170 16 Hashimoto T Cook w s Qi c et al (2000) Defect in peroxisome prdiferatoractivated receptor alpha-inducible fatty acid oxidation determines the severity' of hepatic steatosis in response to fasting J Biol Client, 275 (37) 2891S-28928 17 Yeh J N Jeng Y M Ch?n H L et al (2006) Hepatic steatosis and neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency (NICCD) in Taiwanese infants JPediatr 148 (5) 642-646 18 Ben-Shalom E, Kobayashi K Shaag A et al (2002) Infantile citrullinemia caused by citrin deficiency with increased dibasic amino acids, -W/ Genet Metab 11 (3), 202-208 19 Kimura A Kage M Nagata I et al (2010) Histological findings in the livers of patients with neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency Hepatol Res 40 (4) 295-303 20 Treepongkaruna s Jitramch s Kođcharin p et al (2012) Neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency: prevalence and SLC25A13 mutations among Thai infants BMC Gastroenterol, 12 141 21 Ko J s Song J H Park s s et al (2007) Neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency in Korean infants J Korean Med Sei 22 (6) 952-956 22 Nguyen Phạm Anh Hoa (2013) Nghiên cứu dặc diểm làm sáng, cợn làm sàng theo dôi sau diều trị bệnh thiểu citrin tre em Luận ăn Tien sf Y học Trưởng Đại học Y Hã Nội 23 Hayasaka K Numakura c Watanabe H (2015) [Treatment and Patbomechanism of Citrin Deficiency] Brain Nerve 67 (6) 739-747 24 Hayasaka K Numakura c Toyota K et al (2012) Treatment with lactose (galactose)-restricted and medium-chain triglyceride-supplemented formula for neonatal intrahepatic cholestasis caused by citiin deficiency JIMD Rep 2,37-44 25 Zhang z H Lin w X Deng M et al (2014) Clinical, molecular and functional investigation on an infant with neonatal intrahepatic cholestasis caused by ci trill deficiency (NICCD) PLoS One (2) e89267 26 Yazaki M Takei Y Kobayashi K et al (2005) Risk of worsened encephalopathy after intravenous glycerol therapy in patients with adultonset type II citiullinemia (CTLN2) Intern Med 44 (3) S3-195 27 Takahashi H Kagawa T Kobayashi K et al (2006) A case of adult-onset type II citrullinemia-deterioration of clinical course after infusion of hyperosmotic and high sugar solutions Med Sci Monit 12 (2) CS13-15 28 Ikeda s, Yazaki M Takei Y et al (2001) Type II (adult onset) citrullinaemia: clinical pictures and the therapeutic effect of liver transplantation JNeurol Neurosurg Psychiatry 71 (5), 663-670 29 Yazaki M Hashikura Y Takei Y et al (2004) Feasibility of auxiliary partial orthotopic liver transplantation from living donors for patients with adult-onset type II citrullinemia Liver Transpl 10 (4) 550-554 30 Hirai I Kimura w Suto K et al (2008) Living donor liver transplantation for type II citrull inemia from a heterozygous donor Hepatogastroenterology 55 (88) 221 12216 31 Kobayashi K Saheki T (2004) [Molecular basis of citrin deficiency) Seikagaku 76(12) 1543-1559 32 Zhao X J Tang X M Zha Q B et al (2011) Prenatal diagnosis of citrin 2.608 deficiency in a Chinese family with a fatal proband Tohokti J Exp Med 225 (4) 273-276 33 Ohura T Kobayashi K Abukawa D et al (2003) A novel inborn error of metabolism detected by elevated methionine and'or galactose in newborn screening: neonatal intrahepatic cholestasis caused by ci trill deficiency Fur J Ped/orr 162(5) 317-322 34 Tamamori A Fujimoto A Okano Y et al (2004) Effects of citrin deficiency in the perinatal period: feasibility of newborn mass screening for citrin deficiency Pediatr Res 56 (4) 60S-614 35 Schaller L, Lauschke V M (2019) The genetic landscape of the human solute carrier (SLC) transporter superfamily Hum Genet, 138 (11-12), 1359-1377 36 Lin w X Zeng H s Zhang z H et al (2016) Molecular diagnosis of pediatric patients with citrin deficiency in China: SLC25A13 mutation spectrum and the geographic distribution Sci Rep 29732 37 Phạm Hùng Vàn (2009) PCR real-time PCR Các vẩn đề bán áp dụng thường gặp, Nhả xuẩt bán Y học Hồ Chi Minh, 10 38 Lorenz T c (2012) Polymerase Chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies J Vis Exp (63) e3998 39 Tạ Thành Vân (2010) PCR vờ sổ kỳ thuật y sinh học phân tứ Nhà xuất bán Y học Hà Nội 3,47 40 Zheng Q Q Zhang z H Zeng H s et al (2016) Identification of a Large SLC25A13 Deletion via Sophisticated Molecular Analyses Using Peripheral Blood Lymphocytes in an Infant with Neonatal Intrahepatic Cholestasis Caused by Citrin Deficiency (NICCD): A Clinical and Molecular Study Biomed Res Int 2016 4124263 41 Zhang z H Lin \v X Zheng Q Q et al (2017) Molecular diagnosis of citrin deficiency in an infant with intrahepatic cholestasis: identification of a 21.7kb gross deletion that completely silences the transcriptional and translational expression of the affected SLC25A13 allele Oncotarget (50), 87182-87193 2.609 Zhang zTransl H Zhao Xof J.SLC25A13 Song Y ztranscripts et al (2012) Cloning and sequence amniocytes analysis Pediatr (2) 85-90 in human Phụ lục 55 2.610 TÁCH CHIẾT DNA TỪ MẤU MÁU TỒN PHÀN 2.611 • Sư dụng Kit QIAamp DNA bood mini Germany 2.612 •> Quy trình tách chiết DNA từ mẫu máu tồn phần : 2.613 Sir đựng Micropipet hút 200 uL máu toàn phẩn chổng dỏng EDTA vào eppendorf 1,5 mL 2.614 Thém 20 uL Proteinase K vã pL Rnase A vortex 15 giây Ú 56°c (± 1°C) 10 phút (= phút) Ly tàm ông phút tốc độ cao (13.500 vỏng/phút) dẻ loại bo giọt dọng nằp Thêm 200 uL ethanol (96 100%) vào ỗng vortex vã ly tâm ống 13.500 2.615 vòng phút phút Càn thộn chuyên toàn dịch ỗng vào cột lọc mã không làm ướt vành (tránh đê đầu côn chạm vảo mãng cùa cột lọc), ly tâm 13.500 võng phút phút Bo het dung dịch dưới, giừ lại cột lọc Thêm 700 uL WA lẽn cột lọc ly tâm 13.500 vòng phút phút Đò bo dung dịch, giừ lại cột lọc Thêm 700 uL WB lẽn cột lọc ly tàm 13.500 vỏngphút phút, dơ bó dung dịch, giừ lại cột lọc 2.616 Ly tâm 13.500 vòng phút phin dê lãm khơ mãng hỗn tồn Chun cột lọc sang ống eppendorf 1.5 mL mói Thêm 85 uL Buffer CE vảo 2.617 phút nhiệt dộ phông (15 màng, ú 25°C) Ly tâm 13.500 2.618 vỏng/phủt phút dê giái DNA 2.619 dung dịchpháp dem di quang kiêm tra chắt luựng DNA tách chiếtThu băng phương 2.620 2.621 2.622 2.37 Kct qua (lo nồng độ độ tinh cúa DNA sau tách chiết 2.16.2.17 psi TWO [LMItfed25 2.18 Cone 2.19 I 21.1 2.21 260nm 2.22 (10mm path) 422 2.24.I BLANK 280nm I REAO 2.25 2.38 MAIN I SEARCH I CAP I NUCLEK CIDS (10mm path) I 222 2.29 2.28 230nm 0215 (10mm path) 260/280 2.32 2.31 ratio I 902 2.34 260 2.35 TM/ V*: 230 ratio ị 2.36 .958 ❖ 2.20 bw 2.23 2.26 APS 2.33 Phụ lục 56 2.623 2.624 2.625 2.626 2.627 2.628 2.629 2.630 2.631 2.632 2.633 TM/ V*: Phụ lục 57 2.634 CÁC CẠP MĨI TV THI ÍT KÊ l)i NG ĐÊ KHL ỀCII ĐẠI 11 ĐOẠN GEN TRÊN SLC25AJ3 2.637 C 2.635 STT 2.636 Primer over gene 2.643 F: 2.642 GGAGAGTACAAGCTTCTGGTC 2.649 R ACTGAGTTGCCTTCTTCACCC 2.654 F TCACTCATTCCAGTGCCTTG 2.653 2.661 R CAATGCCGC.AAAGGCAACTG 2.666 F 2.665 TTGGGCTGTCAGCAATGTGCC 2.672 R CTAGCATGCCTCCAGCCTACT 2.677 F 2.676 GTGTGTCTCCCTTCTTAAGCTATTC 2.683 R CCTAGTAGACTCTGCCCTTGTG 2.688 F: 2.687 GTOAACGATTTTGTGAGGGATA 2.695 R CCTAGTAGACTCTGCCCTTG 2.700 F: 2.699 CTAGTCATACCTGTGATCTCTCCA 2.706 R GGAGTTGATACCAGTCTCATCAG 2.711 F: CTGCCTGGCCGTATCGC 2.710 2.716 R CATTTTGCTCCGCCTGTGG 2.721 F: 2.720 AGTCTTTGGATTAGGCTGGCTTT s 2.727 R TCTTTGAACTGTTGGGAGATAATGGT 2.732 F 2.731 TGTCGCGACAGGAAAAAACCACTGC 2.738 R CTAGAGAGCACGGACAGTCATCTGG 2.743 F 2.742 ATAACTGGCATTGGGA.AAGACTAGA 10 2.744 R 2.750 F 2.749 CCTCTGCAGCTTGGGTAGAACATC 11 2.756 R CCCTCCTTCAGCCTCCACATTAA TM/ V*: • -U 2.644 30690- 2.639 2.638 Cover exon intron 2.646 «7(130901 131039) 2.645 2.655 2.657 «8-9 (13247432388132567, 2.656 2.658 1327702.667 2.669 «11 (13771337473137871) 2.668 2.678 2.680 «13 (152023 51730152103) 2.679 2.689 2.691 «13(15202352023152103), 2.692 intron 2.690 2.701 2.703 «17(200403 0036S200493) 2.702 2.712 2.713 «1 (1-206) 0-315 2.722 46502.723 2.733 28704- 2.724 «3 (44S10 44952) 2.735 «6(12S965 129111) 2.734 2.745 2.747 «1O(137OSS 36S32137172) 2.746 2.751 2.753 «14(175403 75227175543) 2.752 Rich thtftk 2.640 2.647 426 2.659 55 2.670 55 2.681 50 2.693 210 2.704 30 2.714 246 2.725 26 2.736 51 2.748 509 2.754 50 Phụ Phụ lụclục 5858 2.760 QUY TRÌNH PIIA GEL VÀ ĐIỆN' DI 2.761 /• ml nước cất Pha giềng điện di cần 2.762 2.763 0.1 ga m Agarose 100 J1L đệm TAE 0.25 uL Red Safe 2.764 + Tùy vào sỗ lượng giếng điện di dê tinh lượng hõa chắt cằn thiết 2.765 Pha dung dịch diện di Ven thành phẩn nước cắt, đệm TAE thạch 2.766 agarose 2.767 Đun thạch lò vi sõng phút rỗi thêm Red Sate de on dịnh mâu Đỗ thạch vào khuôn chờ nguội 30 phút Nho DNA marker (3 pL) đoạn DNA vừa khuếch đại vào giếng, 2.768 giếng 10-20 uL Cẩm dây đũng điện cực vã điện di vói hiệu điện the 130 V thời gian 30 phút Lấy gel dã điện di dặt lẽn bàn chiêu tia uv dê quan sát kẻt TM/TC V*: V*: • -U ... do;m gen mà hóa tổng hựp protein citrin sè giúp phãt cãc đột biền gãy bệnh thicu hụt citrin xác Do dó em tiến hãnh đề tãi ? ?Tối ưu hóa quy trinh kỹ thuật PCR khuếch dại sổ exon gen SLC25A13 gây bệnh. .. gây bệnh thiếu citrin" với mục tiêu: 2.19 sổ exon Tắ gen iru SLC25AỈ3 hỏa quy trinh gáy bệnh kỳ thuật thiếuPCR citrin khuếch đại 2.20 2.21 Chương TONG QUANỉ TÀI LIỆU 1.1 Bệnh lý thiếu hụt citrin. .. dọc kết 2.4.3 Tối ưu hóa thời gian kéo dài chuồi PCR khuếch đại gen SLC25AỈ3 2.468 Kct qua tối ưu nhiệt độ gắn mồi vả sổ chu kỳ nhiệt cho PCR sè sứ dụng tất cã phím img tối ưu hóa thịi gian kéo