Đánh giá độ đặc hiệu và sự phù hợp của kỹ thuật PCR - RFLP xác định kiểu gen HBV so với kỹ thuật đọc trình tự gen

Nhiễm virus viêm gan B (Hepatitis B virus, HBV) là một trong những nhiễm trùng phổ biến ở loài người và là một vấn đề y tế lớn của nhiều quốc gia trên thế giới trong đó có Việt Nam. Mặc dù đã có vaccine phòng nhiễm HBV đặc hiệu nhưng tỷ lệ nhiễm virus này đến nay vẫn còn rất cao. Theo ước tính hiện nay trên thế giới có khoảng 2 tỷ người đã nhiễm HBV, trong đó có gần 400 triệu người đang nhiễm HBV mạn tính, chiếm 6% dân số thế giới. Nhiễm HBV có thể gây nên nhiều thể bệnh khác nhau từ người mang virus không triệu chứng, viêm gan cấp tính tự hồi phục, viêm gan tối cấp đến viêm gan mạn, xơ gan và ung thư tế bào gan (UTTBG) 8, 24. Ước tính mỗi năm có hơn một triệu người chết do hậu quả của nhiễm HBV mạn tính 57. Vậy câu hỏi đặt ra là tại sao cùng nhiễm HBV mà lại gây các bệnh cảnh lâm sàng khác nhau. Một trong nhiều lý do của sự khác nhau đó là do đáp ứng miễn dịch của vật chủ, đặc điểm di truyền tế bào và chính bản thân virus như sự khác biệt về kiểu gen (genotype), đột biến vùng gen S, preCore, Core của HBV cũng có liên quan nhất định đến bệnh sinh và đáp ứng điều trị của các thuốc kháng virus cũng như tiên lượng bệnh 90.

- BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y HOÀNG XUÂN SỬ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR - RFLP XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CỦA VIRUS VIÊM GAN B LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC Chuyên ngành : Vi sinh y học Mã số : 62.72.68.05 Hướng dẫn khoa học: TS. BS. NGUYỄN LĨNH TOÀN Hà Nội 2009 2 - ĐẶT VẤN ĐỀ Nhiễm virus viêm gan B (Hepatitis B virus, HBV) là một trong những nhiễm trùng phổ biến nhất ở loài người và là một vấn đề y tế lớn của nhiều quốc gia trên thế giới trong đó có Việt Nam. Mặc dù đã có vaccine phòng nhiễm HBV đặc hiệu nhưng tỷ lệ nhiễm virus này đến nay vẫn còn rất cao. Theo ước tính hiện nay trên thế giới đã có khoảng 2 tỷ người đã nhiễm HBV, trong đó đang có gần 400 triệu người đang nhiễm HBV mạn tính, chiếm 6% dân số thế giới [23]. Nhiễm HBV có thể gây nên nhiều thể bệnh khác nhau từ người mang virus không triệu chứng, viêm gan cấp tính tự hồi phục, viêm gan tối cấp đến viêm gan mạn, xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan (UTBMTBGUTTBG) [8], [243] [53], [72]. Ước tính mỗi năm có hơn một triệu người chết do hậu quả của nhiễm HBV mạn tính [Lee57, 1997]. Vậy câu hỏi đặt ra là tại sao cùng nhiễm HBV mà lại gây các bệnh cảnh lâm sàng khác nhau. Một trong nhiều lý do của sự khác nhau đó là do đáp ứng miễn dịch của vật chủ, đặc điểm di truyền tế bào và chính bản thân virus như sự khác biệt về kiểu gen (genotype), đột biến vùng gen S, preCore, Core của HBV cũng có liên quan nhất định đến bệnh sinh và đáp ứng điều trị của các thuốc kháng virus cũng như tiên lượng bệnh [Song và CS, 200590]. Kiểu gen của HBV được mô tả lần đầu bởi Okamoto và CScs năm 1988. Các tác giả thấy rằng giữa các kiểu gen khác nhau có số lượng các nucleotide khác nhau tối thiểu là 8% trên toàn bộ bộ gen (genome) của chúng. Cho đến nay có ít nhất là 8 kiểu gen khác nhau của HBV đã được phát hiện và ký hiệu từ A đến H (HBV - A đến - H) [22], [35], [64], [67], [86]. Gần đây, Tran và CS đã chứng minh ở Việt Nam HBV có thể tồn tại thêm một kiểu genegen mới là kiểu gen I [Tran và cs, 200889]. Nhiều nghiên cứu cho thấy các kiểu gen khác nhau của HBV đều có ảnh hưởng khác nhau đối với diễn biến lâm sàng bệnh lý gan do HBV. Nghiên 3 - cứu của Suzuki và cộng sựCS (2005) thấy rằng kiểu gen B thường gặp ở bệnh nhân viêm gan mạn, trong khi kiểu gen A lại thường thấy ở trong viêm gan cấp [8286]. Trong khi đó nhiều nghiên cứu khác gần đây cho thấy kiểu gen C thường gây tổn thương gan nặng nề hơn so với kiểu gen B, kiểu gen A thường gây viêm gan mạn hơn kiểu gen D. Người mang HBV mạn tính có nguy cơ phát triển thành xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan thường gặp hơn ở kiểu gen C so với kiểu gen B và kiểu gen C khó điều trị hơn kiểu gen B cũng được quan sát thấy ở nhiều nghiên cứu [3235], [46], [48], [49], [50], [52], [58], [6670]. Hiện nay, có nhiều phương pháp xác định kiểu gen của HBV đang được áp dụng. trên thế giới. Như phương pháp chuẩn là đọc trình tự gen và phân tích loài (Sequencing and Phylogenetic analysis) [2223],, [64]; tiếp đến là phương pháp realtime - PCR hoặc realtime - PCR kết hợp phân tích đường cong nóng chảy (melting curve) dựa vào trên nguyên lý đếm thời gian thực và phân tích sự khác nhau về nhiệt độ nóng chảy của các sản phẩm PCRDNA [8185], rồi đến các phương pháp lai đầu dò (line probe assay, LiPA) [2830], PCR đa mồi (Multiplex - PCR) [4144], [68], phản ứng dot blot ngược dòng (FT - RDB: flow through reverse dot blot ) [7478], oligonucleotide microarray [8692] và đặc biệt là phương pháp PCR - RFLP (PCR - restriction fragment length polymorphism) [38], [39], [57]. Ở Việt Nam phổ biến hiện nayđang sử dụng phương pháp đọc trình tự gen, lai đầu dò và multiplex - PCR [5], [8], [19]. Tuy nhiên, các phương pháp này giá thành khá cao, cần nhiều trang thiết bị đắt tiền và mất khá nhiều thời gian. Vì vậy, nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR - RFLP xác định kiểu gen HBV có ý nghĩa quan trọng góp phần làm giảm giá thành xét nghiệm, phổ biến kỹ thuật, tiết kiệm thời gian và đầu tư trang thiết bị cũng như mang lại 4 - lợi ích về kinh tế và tiết kiệm chi phí điều trị cho người bệnh. Chính vì những lý do đó chúng tôi tiến hành đề tài này với mục tiêu: 1. Xác định điều kiện tối ưu và lựa chọn enzyme giới hạn thích hợp cchoủa kỹ thuật PCR - RFLP xác định kiểu gen HBV. 2. Đánh giá độ đặc hiệu và sự phù hợp của kỹ thuật PCR - RFLP xác định kiểu gen HBV so với kỹ t huật đọc trình tự gen. CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình nhiễm virus viêm gan B 1.1.1. Tình hình nhiễm HBV trên thế giới và Việt Nam 1.1.1.1. Tình hình nhiễm HBV trên thế giới Mặc dù đã có vaccine phòng nhiễm virus viêm gan B (hepatitis B virus, HBV) đặc hiệu, nhưng nhiễm HBV vẫn đang là vấn đề mang tính toàn cầu. Nhiễm HBV có thể gây nên nhiều thể bệnh khác nhau từ người mang virus không triệu chứng, viêm gan cấp tính tự hồi phục đến viêm gan mạn, xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan (UTBMTBGUTTBG) [Acharya SK và CS, 200021], [23], [5357]. HBV có thể lây qua đường tình dục, đường máu, từ mẹ sang con. Ước tính hiện nay trên thế giới đã có khoảng 2 tỷ người đã nhiễm HBV, trong đó đang có gần 400 triệu người đang nhiễm HBV mạn tính. Khoảng ba phần tư số người mang HBV mạn tính đang sống ở Châu Á và khu vực Sub - Sahara của Châu pPhi với tỷ lệ cao số người mang virus trong cộng đồng. Tỷ lệ lưu hành HBV ở mức trung bình tại vùng Ðịa Trung Hải, Nhật Bản và một phần Ðông Âu. Trong khi đó tỷ lệ này tương đối thấp dưới 2% dân số tại phần lớn các nước Tây Âu, Châu Úc và Bắc Mỹ. Các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng những người nhiễm HBV mạn tính có nguy cơ tiến 5 - triển UTBMTBGUTTBG cao hơn 100 lần so với người bình thường. Trung bình mỗi năm có hơn 1 1 triệu người chết do nhiễm HBV gây nên [23], [5357]. Sự khác nhau về tỷ lệ lưu hành toàn cầu có khả năng là do có sự khác biệt về các đường lây truyền HBV chính, điều kiện kinh tế và khả năng chăm sóc y tế. Ở các vùng bệnh lưu hành địa phương như Châu Á và Tây Phi, lây truyền HBV thường xảy ra trong thời kỳ chu sinh, với tỷ lệ lây truyền cho trẻ sơ sinh cao đến 90% từ các bà mẹ có HBsAg và HBeAg (+). Người ta thấy rằng có trên 95% các trường hợp trẻ lây nhiễm HBV từ mẹ trở thành người mang HBV mạn tính [23], [5357]. Căn cứ vào các số liệu điều tra dịch tễ học WHO đã chia các khu vực nhiễm HBV trên thế giới thành 3 khu vực dịch lưu hành. Bảng 1.1. Các khu vực nhiễm HBV trên thế giới [xx] (E.PILLY - 1998) Khu vực lưu hành thấp Khu vực lưu hành trung bình Khu vực lưu hành cao Tỷ lệ HBbsAg (+) 0,1 - 0,5% 2 - 7% 8 - 15% Tỷ lệ aAnti - HBs (+) 3 - 5% 20 - 50% 70 - 95% Nhiễm HBV ở trẻ sơ sinh Hiếm Không phổ biến Phổ biến Phân bố Tây Âu, Bắc Mỹ, Australia Địa Trung Hải, Liên Xô cũ, Đông Âu, Trung Đông, Nam Mỹ, Nhật Bản Trung Quốc, Đông Nam Á, Hạ Sahara, Châu Phi 1.1.1.2. Tình hình nhiễm HBV ở Việt Nam Ở Việt Nam rất nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng tỷ lệ nhiễm HBV đứng hàng cao nhất thế giới. Tần suất có HBsAg (+) ở người lớn từ 15 đến 21% 6 - thậm chí có nơi lên đến 26% và ước tính chúng ta đang có hơn 10 triệu người mang HBV mạn tính [3], [4], [16], [20], [6266]. Tỷ lệ mang anti - HBs trên 60%. Tuy vậy, tỷ lệ nhiễm HBV ở từng nhóm đối tượng, từng vùng theo từng tác giả cũng khác nhau [6266]. Theo Phạm Song và cộng sự CS thấy tỷ lệ nhiễm HBsAg ở 6 - 14%, anti - HBs ở 35 - 37% số người không mắc bệnh gan và tăng theo lứa tuổi. Nguyễn Anh Tuấn bằngvới kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA: Radioimmunoassay) đã phát hiện 11% số người khỏe mạnh có HBsAg (+) [3], [16]. Tình hình nhiễm HBV ở Việt Nam được các nghiên cứu công bố gần đây tóm tắt ở bảng 1.2. Bảng 1.2. Tỷ lệ HBsAg (+) ở một số quần thể dân cư nước ta Địa phương Tác giả Cộng đồng Tỷ lệ % HBsAg(+) Năm Miền Bắc Lê Hồng Quang Công nhân 13, 62 1993 Hà Nội Lê Vũ Anh Trần Thị Chính Phan Thị Phi Phi và CS. Dân cư 35 - 59 tuổi Người lớn khỏe mạnh 11, 35 14, 4 13, 9 1988 1993 1993 Hồ Chí Minh Trần Văn Bé, Trương Xuân Liên Người lớn khỏe mạnh Công nhân viên 9, 3 16, 6 1994 1994 Tiền Giang Trần Minh Phụng Người tự nguyện và công nhân 21, 28 1995 Lâm Đồng Hoàng Công Long Số liệu của phòng xét nghiệm 16, 74 1994 Bình Thuận Lê Khai Thọ Số liệu của phòng xét nghiệm 17, 68 1994 An Giang Châu Hữu Hầu Cộng đồng Bệnh viện 11, 0 16, 2 1995 1995 7 - Thanh Hóa David B. Hipgrave, Nguyen Thu Van và CS. Cộng đồng (n=1579) Sơ sinh Trẻ em Thanh niên Người lớn 18 ± 2,4 12,5 ± 2,8 18,4 ± 5 20,5 ± 5,3 16,8 ± 1,8 1995 1.1.2. Đường lây nhiễm của HBV HBV có ở trong máu và các chế phẩm từ máu, các dịch tiết như tinh dịch, dịch âm đạo, nước bọt, nước mắt, sữa mẹ [20], [4246]. Khi tiếp xúc với các nguồn bệnh trên thì sẽ có nguy cơ cao nhiễm HBV. Có 3 con đường lây nhiễm cơ bản HBV [20], [23]. + Lây truyền từ máu và các chế phẩm từ máu thông qua tiêm, truyền, các thủ thuật, phẫu thuật, lọc máu Hiện nay, những người sử dụng ma túy đường tiêm chích là đối tượng có nguy cơ nhiễm HBV cao nhất. + Lây truyền từ mẹ sang con: Đây là con đường truyền bệnh nguy hiểm bởi vì có từ 90 - 95% số trẻ bị nhiễm theo con đường này có nguy cơ tiến triển thành nhiễm HBV mạn tính. Tỷ lệ lây nhiễm cho trẻ cao khi người mẹ nhiễm HBV cấp ở 3 tháng cuối của thai kỳ và, xung quanhgần thời gian đẻ đối với người mẹ nhiễm HBV mạn tính. Nếu người mẹ có đồng thời HBsAg (+) và HBeAg (+) thì nguy cơ nhiễm cho con lên tới 90% [23]. + Lây truyền qua đường tình dục: Sinh hoạt tình dục với người nhiễm HBV, dù khác giới hay đồng giới bằng các đường âm đạo, hậu môn hay đường miệng đều có khả năng nhiễm bệnh. Khả năng lây bệnh cao khi người nhiễm có HBeAg (+), hoặc khi nồng độ HBV - DNA trên 10 5 copies/ml. 8 - 1.1.3. Cấu trúc của HBV 1.1.3.1. Hình thể và cấu trúc của HBV HBV là một thành viên thuộc họ Hepadnaviridae, là một loại virus hướng gan (hepatotropic) có bộ gen (genome) là chuỗi xoắn kép DNA đóng vòng không kín, có capside và quá trình nhân lên không gây tan tế bào gan nhiễm virus [3639]. Dưới kính hiển vi điện tử (Hình 1.1A) quan sát thấy HBV tồn tại dưới 3 loại tiểu thể khác nhau: + Tiểu thể hình cầu nhỏ (small particle) có đường kính 22 nm. + Tiểu thể hình ống (tubular particle) kích thước 22nm dài 40 - 400nm. + Tiểu thể hình cầu lớn (large particle) có kích thước 42 - 45 nm. Đây chính là hạt virus hoàn chỉnh (Tiểu thể Dane) có cấu tạo gồm 2 lớp [3336]: - Bao ngoài: Lớp bao ngoài có bản chất là Lipoprotein. Lớp này có các kháng nguyên bề mặt (HBsAg). - Lớp lõi: Capside đối xứng hình hộp có chứa các kháng nguyên lõi HBcAg. Bên trong lõi có chứa bộ gen HBV gồm 2 sợi DNA đóng vòng không kín, enzyme DNA phiên mã ngược- polymerase và protein kinase (A) (B) 9 - Hình 1.1. (A) HBV nhìn dưới kính hiển vi điện tử (ABock CT & Zentgraf, 1992) và (B) mô hình hóa cấu trúc (BLee, 1997), Tiểu thể Dane (C) 10 [...]... kiu gen HBV 1.2.1 Kiu gen ca HBV T nm 1988 Okamoto v CS khi phõn tớch 18 trỡnh t b gen ca HBV ó phỏt hin ra cỏc chng HBV cú b gen khỏc nhau trờn cỏc bnh nhõn nghiờn cu ch khụng phi nh trc õy chỳng ta vn nhn nh [671] Cỏc tỏc gi ó qui c gi kiu gen A l kiu gen c in v cỏc kiu gen khỏc cũn li cú hn 8% nucleotide (Nu.) khỏc so vi kiu gen A Nh vy, kiu gen B s cú hn 8% Nu khỏc bit so vi kiu gen A; kiu gen. .. HBV cho thy cỏc kiu genegen ca HBV ph bin c tỡm thy l kiu genegen A, B, C v D i sõu phõn tớch cho thy kiu genegen A thng gp hn nhúm ngi mang HBV khụng triu chng so vi nhúm cú triu chng v nhúm khụng ung th so vi nhúm UTTBG 30 Ngc li, kiu genegen C tỡm thy nhiu nhúm UTTBG hn l nhúm khụng UTTBG Ngoi ra, nhúm ung th kiu genegen C cng c tỡm thy nhiu hn kiu genegen B v A [Song Le H, Toan NL v cs, 200688]... (INNO - LiPA) Phng phỏp xỏc nh kiu gen ca HBV bng k thut lai u dũ trờn thanh INNO - LiPA c phỏt trin bi Innogenegentics N.V., Ghent, Belgium (B) Cỏc mu HBV - DNA ca bnh nhõn c khuych i bng cỏc cp mi b sung vi vựng cú tớnh bo tn cao trong vựng preS1 ca genome HBV Sau ú sn phm PCR c lai vi cỏc vch dũ c hiu ca tng kiu gen m ó c gn trờn thanh INNO - LiPA Trong nghiờn cu ca Teles v cng sCS thỡ ch cú kiu gen. .. nhim HBV mn v cỏc kiu gen HBV 27 1.2.3 Tỏc ng ca kiu genegen HBV trờn lõm sng bnh lý gan tỡm hiu sõu nhng c tớnh sinh hc ca cỏc kiu gen HBV ngi ta ó kho sỏt mi liờn quan ca chỳng i vi tin trin ca bnh do nhim HBV ny Qua nghiờn cu trờn nhiu cỏc nhúm i tng, nhiu trung tõm nghiờn cu ngi ta thy rng: nhng kiu gen ny cú nh hng ti c tớnh sinh hc ca virus v din bin bnh cnh lõm sng ca nhim HBV Vớ d: So vi kiu gen. .. qun th cú t l ngi nhim HBV cao nh i Loan ni phõn b ch yu ca 2 kiu gen B v C nguy c tin trin thnh x gan v ung th gan bnh nhõn nhim HBV kiu gen C thng cao hn so vi kiu gen B Thờm vo ú ngi ta cng thy rng, trờn bnh nhõn mang kiu gen C t l dng tớnh ca HBeAg cng nh mc nhõn lờn ca HBV cng cao hn l nhúm mang kiu gen B Thi gian chuyn o huyt thanh nhúm cú kiu gen C lõu hn so vi kiu gen B, t l t bin im vựng... lng, la chn iu tr bnh nhõn 1.3 Cỏc phng phỏp xỏc nh kiu gen HBV 1.3.1 Phng phỏp c trỡnh t v phõn tớch loi õy l phng phỏp chớnh xỏc nht cho phộp xỏc nh kiu gen ca HBV da trờn s khuych i cỏc on gen ca HBV v c trỡnh t ton b b gen ca HBV sau ú s dng phõn tớch loi cng nh s dng cụng c Blast v viral genotyping so sỏnh vi cỏc kiu gen ó c cụng b trờn GenBank Phõn tớch loi l phng phỏp ỏnh giỏ v s liờn quan... gen C l 29,1%, trong ú kiu gen B ph bin hn hn kiu gen C nhúm ngi mang virus v nhúm bnh nhõn viờm gan mn [18] Ngi nhim HBV kiu gen C cú nguy c b cỏc bnh gan mn tớnh núi chung cao hn so vi ngi nhim HBV kiu gen B [18] Mt nghiờn cu khỏc gn õy trờn 375 bnh nhõn khỏ y cỏc nhúm bnh nhõn nh nhúm ngi mang HBV khụng triu chng, viờm gan B cp, viờm gan B mn, x gan v UTTBG liờn quan HBV cho thy cỏc kiu genegen... núng chy ca cỏc sn phm PCR khỏc nhau vỡ vy thi im xut hin nhit núng chy ti u ca cỏc sn phm PCR khỏc nhau l khụng ging nhau õy l nguyờn lý chớnh ca phng phỏp ny Nm 2004, S Payungporn v cng s 34 CS ng dng cho xỏc nh kiu gen ca HBV trờn 52 mu lõm sng phỏt hin c 11 mu l kiu B v 41 mu l kiu gen C Khi so sỏnh vi phng phỏp PCR - RFLP thỡ cú 3 mu l kiu gen A, 11 mu kiu gen B v 37 mu kiu gen C Kt qu c trỡnh t... (1999) phỏt trin cho phộp phõn bit cỏc kiu gen ca HBV bng bn enzyme l NciI, AlwI, EarI v NlaIV [2281] Lindh v cng sCS (1998) cng ng dng k thut ny nhng ch s dng hai emzyme l AvaII v DpnII cho phộp xỏc nh cỏc kiu gen t A - F trờn 99 mu lõm sng thỡ 95 mu xỏc nh c kiu gen trong ú kiu gen A: 23, kiu gen B: 20, kiu gen C: 20, kiu gen D: 22 v kiu gen E: 3, kiu gen F l 5 Khi so sỏnh vi c trỡnh t v phõn tớch loi... kiu gen HBV cỏc nhúm bnh nhõn khỏc nhau [5] Phng phỏp multiplex - PCR v PCR vi cỏc cp mi c hiu cú u im l tit kim thi gian, chi phớ thp v d thc hin Cho n nay cng ó cú mt s thụng bỏo phng phỏp ny cú th phỏt hin c s ng bi nhim ca nhiu kiu gen khỏc nhau Tuy nhiờn vi multiplex - PCR vic ti u húa phn ng cng mt nhiu cụng on, nhy khụng cao ch t 83% so vi c trỡnh t gen (Ren Zhang v CS, 2007) [74] v khi HBV