Để xỏc định điều kiện tối ưu cho kỹ thuật PCR - RFLP xỏc định kiểu gen của HBV điều trước tiờn cần phải tối ưu được qui trỡnh nhõn đoạn gen vựng preCore của HBV. Chỳng tụi đó tham khảo điều kiện luõn nhiệt của Song và CS (2006) cho phản ứng PCR thứ nhất và của Hannoun và cộng sự CS (2002) [3942], cho phản ứng PCR thứ hai. Trong nghiờn cứu này tỡm điều kiện chuẩn tối ưu cho phản ứng nested - PCR nhõn đoạn gen vựng preCore của HBV.
Để tối ưu húa phản ứng PCR thứ hai chỳng tụi tiến hành tối ưu nhiệt độ gắn mồi, sử dụng chương trỡnh Gradient nhiệt của mỏy PCR iCycler với khoảng nhiệt độ gắn mồi lựa chọn từ 510C đến 620C. Sau khi cài đặt thụng số, mỏy cho dải phổ nhiệt độ như sau: 510C; 51,90C; 53,30C; 55,20C, 58,10C; 60,10C; 61,40C và 620C. Với 8 phản ứng PCR giống hệt nhau về thành phần được chuẩn bị và đặt vào mỏy thực hiện phản ứng PCR tương ứng với cỏc mốc nhiệt độ ở trờn và, tiến hành chạy chương trỡnh luõn nhiệt đồng thời trong cựng một điều kiện chỉ khỏc nhau về nhiệt độ gắn mồi như nờu trờn sau đú điện di trờn agarose 1,5 %, soi trờn mỏy soi gel Gel - Doc.
Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy ở nhiệt độ 58,10 C xuất hiện sản phẩm PCR với kớch thước rừ nột nhất (bảng 3.1). So với nhiệt độ gắn mồi theo cụng bố của Hannoun và CS (2002) là 62 độ [3942]. Trong thớ nghiệm của chỳng tụi ở nhiệt độ này kết quả cho thấy sản phẩm PCR khụng thật rừ
nột. Sở dĩ cú sự khỏc biệt này khả năng do cú sự khỏc nhau trong thành phần phản ứng cũng như nguồn gốc của enzyme Taq Polymerase...
Sau khi tỡm được nhiệt độ gắn mồi chỳng tụi tiến hành tối ưu thời gian gắn mồi bằng cỏch chạy PCR ở nhiệt độ gắn mồi là 58,10 C (làm trũn số) với cỏc mốc thời gian lần lượt là 30s, 35s, 40s, 45s, 50s, 55s , và 60 giõys. Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy tất cả cỏc mẫu đều xuất hiện băng đỳng kớch thước rừ, khụng cú băng phụ và mẫu cho băng rừ nhất tương ứng với mốc thời gian gắn mồi là 45s giõy. Với phản ứng nested - PCR nhõn đoạn gen vựng preCore đó được tối ưu chỳng tụi tiến hành nhõn gen vựng preCore trờn cỏc mẫu HBV - DNA plasmide của cỏc kiểu gen A, B, C, D và 30 mẫu huyết thanh của bệnh nhõn cú HBsAg (+). Kết quả cho thấy tất cả cỏc mẫu đều xuất hiện sản phẩm PCR đỳng kớch thước. 521 hoặc 515bp (hỡnh 3.3). Như vậy, kết quả thực nghiệm cho thấy chu trỡnh luõn nhiệt của chỳng tụi đó tối ưu