chứng minh cỏc sự phự hợp giữa cỏc kiểu gen bằng kỹ thuật giải trỡnh tự gen và PCR - RFLP. Vựng gen preCore (A): phõn tớch đại diện 9 chủng HBV thuộc về kiểu gen C (HBV-C) và 2 chủng thuộc kiểu gen B (HBV-). Trờn vựng gen S: phõn tớch đại diện 10 chủng HBV thuộc kiểu gen B (HBV-B) và 2 chủng HBV (S710 và S705) nằm giữa kiểu gen B và C thuộc chủng HBV tỏi tổ hợp kiểu gen B và C (HBV-B+C).
3.2.3. Ngưỡng phỏt hiện của phản ứng PCR - RFLP xỏc định kiểu gen của HBV của HBV
Để đỏnh giỏ ngưỡng phỏt hiện của phương phỏp chỳng tụi tiến hành chạy phản ứng nested - PCR trờn cỏc mẫu plasmide mang bộ gen HBV tỏi tổ hợp với cỏc độ pha loóng từ 101 - 106 copies. Kết quả cho thấy phản ứng cú độ nhạy đến 101 vẫn cú thể phỏt hiện được (Hhỡnh 3.132). Cỏc phản ứng được lặp lại 3 lần trong cựng một điều kiện đều cho kết quả tương tự.
Hỡnh 3.123. Hỡnh điện di ngưỡng phỏt hiện của phản ứng nested -
PCR trờn cỏc mẫu HBV - DNA plasmide.
M: Marker 100 bp; Cỏc cột từ 1 đến 6 lần lượt tương ứng với cỏc độ pha loóng từ 106 - 101 copies
Đối với cỏc mẫu lõm sàng chỳng tụi tiến hành chạy phản ứng nested - PCR trờn cỏc mẫu được xỏc định nồng độ HBV - DNA bằng Realtime - PCR từ 5,0 x 102 - 106 copies. Kết quả cho thấy phản ứng cú độ nhạy đến 5,0 x 102 vẫn cú thể phỏt hiện được (Hhỡnh 3.143). Cỏc phản ứng được lặp lại 3 lần trong cựng một điều kiện đều cho kết quả tương tự nhau.
Hỡnh 3.143. Hỡnh điện di xỏc định ngưỡng phỏt hiện của kỹ thuật PCR-
RFLP trờn HBV - DNA mẫu nghiờn cứu. M: Marker 100 bp; Cỏc cột từ 1
đến 6 lần lượt tương ứng với cỏc độ pha loóng từ 107 - 102 copies.
3.3. Ứng dụng kỹ thuật PCR - RFLP xỏc định kiểu gen HBV trờn lõm sàng
3.3.1. Kết quả tỏch HBV - DNA cỏc mẫu lõm sàng
Chỳng tụi sử dụng bộ kớt của Qiagen Amp DNA mini kit tỏch và tinh sạch HBV - DNA virus từ cỏc mẫu huyết thanh thu thập của 95 bệnh nhõn cú HBsAg (+). Qui trỡnh tỏch DNA theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA bằng hệ thống Nanodrop (Bảng 3.12 và Hỡnh 3.154).
Bảng 3.12. Nồng độ của HBV - DNA mẫu nghiờn cứu
Số mẫu (n=95) Nồng độ (ng/μl ) Kết quả đo OD
30 Từ 50 - 100 Từ 1,6 - 1,8
55 Từ 100 - 150 Từ 1,8 - 2,0
10 Từ 150 - 200 Từ 2,0 - 2,2
95 Cộng Cộng
Hỡnh 3.154. Hỡnh ảnh minh họa một số kết quả Đđo nồng độ và độ tinh sạch HBV - DNA một sốcỏc mẫu nghiờn cứu
Nhận xột: Nồng độ DNA cỏc mẫu chủ yếu là từ 100 - 150 ng/μl, Cỏc mẫu cú độ tinh sạch chủ yếu ở OD (260/280) = 1,8 - 2,0.
3.3.2. Nồng độ HBV - DNA xỏc định bằng Realtime - PCR
Bảng 3.13. Bảng kết quả nồng độ HBV - DNA mẫu nghiờn cứu.
Nồng độ Số mẫu (n=95) Tỷ lệ (%) < 5 x 102 1 1,07 102 - 103 2 2,10 103 – 104 13 13,68 104 – 105 23 24,21 > 105 56 58,94
Nhận xột: Nồng độ HBV - DNA mẫu nghiờn cứu chủ yếu trờn 105 copies chiếm 56/95 (58,94%), từ 104 - 105 chiếm 23/95 (24,21%).
3.3.3. Phõn bố của kiểu gen của HBV
Bảng 3.14. Tỷ lệ phõn bố kiểu gen của HBV nhúm nghiờn cứu
Kiểu gen HBV Số lượng Tỷ lệ (%)
B 55 57,9
C 36 37,9
D 2 2,1
Tỏi tổ hợp B+C 2 2,1
Tổng số 95 100
Nhận xột: Tỷ lệ kiểu gen B là 55/95 (57,9%), kiểu gen C là 36/95 (37,9%), Kiểu gen D là 2/95 (2,1%) và kiểu gen tỏi tổ hợp B và C là 2/95 (2,1%)
3.3.4. Mối liờn quan giữa kiểu gen và nồng độ HBV - DNA nhúm nghiờn cứu cứu
Bảng 3.15. Mối liờn quan giữa kiểu gen và nồng độ HBV - DNA
Kiểu gen Số lượng Nồng độ HBV - DNA
trung bỡnh
SD p
B 55 1,01 x 108 5,42e+08 >0..05
C 36 2,8 x 107 9,39e+07
Nhận xột: Khụng cú sự liờn quan giữa kiểu gen của HBV với nồng độ HBV - DNA (p > 0,05).
CHƯƠNG 4
BÀN LUẬN
4.1. Xỏc định điều kiện tối ưu cho kỹ thuật PCR - RFLP xỏc định kiểu gen của HBV.
4.1.1. Tối ưu phản ứng nested - PCR nhõn đoạn gen vựng preCore của HBV.
Để xỏc định điều kiện tối ưu cho kỹ thuật PCR - RFLP xỏc định kiểu gen của HBV điều trước tiờn cần phải tối ưu được qui trỡnh nhõn đoạn gen vựng preCore của HBV. Chỳng tụi đó tham khảo điều kiện luõn nhiệt của Song và CS (2006) cho phản ứng PCR thứ nhất và của Hannoun và cộng sự CS (2002) [3942], cho phản ứng PCR thứ hai. Trong nghiờn cứu này tỡm điều kiện chuẩn tối ưu cho phản ứng nested - PCR nhõn đoạn gen vựng preCore của HBV.
Để tối ưu húa phản ứng PCR thứ hai chỳng tụi tiến hành tối ưu nhiệt độ gắn mồi, sử dụng chương trỡnh Gradient nhiệt của mỏy PCR iCycler với khoảng nhiệt độ gắn mồi lựa chọn từ 510C đến 620C. Sau khi cài đặt thụng số, mỏy cho dải phổ nhiệt độ như sau: 510C; 51,90C; 53,30C; 55,20C, 58,10C; 60,10C; 61,40C và 620C. Với 8 phản ứng PCR giống hệt nhau về thành phần được chuẩn bị và đặt vào mỏy thực hiện phản ứng PCR tương ứng với cỏc mốc nhiệt độ ở trờn và, tiến hành chạy chương trỡnh luõn nhiệt đồng thời trong cựng một điều kiện chỉ khỏc nhau về nhiệt độ gắn mồi như nờu trờn sau đú điện di trờn agarose 1,5 %, soi trờn mỏy soi gel Gel - Doc.
Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy ở nhiệt độ 58,10 C xuất hiện sản phẩm PCR với kớch thước rừ nột nhất (bảng 3.1). So với nhiệt độ gắn mồi theo cụng bố của Hannoun và CS (2002) là 62 độ [3942]. Trong thớ nghiệm của chỳng tụi ở nhiệt độ này kết quả cho thấy sản phẩm PCR khụng thật rừ
nột. Sở dĩ cú sự khỏc biệt này khả năng do cú sự khỏc nhau trong thành phần phản ứng cũng như nguồn gốc của enzyme Taq Polymerase...
Sau khi tỡm được nhiệt độ gắn mồi chỳng tụi tiến hành tối ưu thời gian gắn mồi bằng cỏch chạy PCR ở nhiệt độ gắn mồi là 58,10 C (làm trũn số) với cỏc mốc thời gian lần lượt là 30s, 35s, 40s, 45s, 50s, 55s , và 60 giõys. Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy tất cả cỏc mẫu đều xuất hiện băng đỳng kớch thước rừ, khụng cú băng phụ và mẫu cho băng rừ nhất tương ứng với mốc thời gian gắn mồi là 45s giõy. Với phản ứng nested - PCR nhõn đoạn gen vựng preCore đó được tối ưu chỳng tụi tiến hành nhõn gen vựng preCore trờn cỏc mẫu HBV - DNA plasmide của cỏc kiểu gen A, B, C, D và 30 mẫu huyết thanh của bệnh nhõn cú HBsAg (+). Kết quả cho thấy tất cả cỏc mẫu đều xuất hiện sản phẩm PCR đỳng kớch thước. 521 hoặc 515bp (hỡnh 3.3). Như vậy, kết quả thực nghiệm cho thấy chu trỡnh luõn nhiệt của chỳng tụi đó tối ưu được phản ứng nested - PCR nhõn đoạn gen vựng preCore của HBV cho sản phẩm PCR. rừ nột và ổn định là nhiệt độ gắn mồi 580 C, thời gian gắn mồi 45 giõy, thực hiện 40 chu kỳ.
4.1.2. Lựa chọn enzyme giới hạn cho phản ứng RFLP xỏc định kiểu gen của HBV của HBV
Cho đến nay việc ứng dụng phương phỏp PCR - RFLP xỏc định kiểu gen của HBV đó được nhiều tỏc giả cụng bố. Lindh và cộng sự CS (1998) đó sử dụng hai enzyme là AvaII và DpnII cho phản ứng RFLP xỏc định kiểu gen của HBV từ A - F; kết quả so với đọc trỡnh tự gen thỡ chỉ cú duy nhất một trường hợp là khụng phự hợp [5761]. Một tỏc giả khỏc là Mizokami và cộng sự CS (1999) cũng sử dụng phương phỏp này xỏc định kiểu gen của HBV với 4 enzyme là NciI, AlwI, EarI và NlaIV. Tuy nhiờn cỏc tỏc giả này thực hiện trờn vựng S và nhiều enzyme giới hạn nờn qui trỡnh thực hiện khỏ phức tạp.
Phương phỏp PCR - RFLP của Hannoun và cộng sự CS cụng bố năm 2002 đó được nhiều tỏc giả nghiờn cứu ỏp dụng xỏc định kiểu gen của HBV. Cỏc tỏc giả đó sử dụng enzyme TasI cho phản ứng RFLP. Enzyme này cắt sản phẩm PCR thu được theo trỡnh tự AATT và khi điện di cú thể phõn biệt cỏc kiểu gen dựa vào kớch thước của cỏc đoạn cắt. Tuy nhiờn, khi phõn tớch trỡnh tự gen đối với cỏc chủng HBV ở Việt Nam đó cụng bố thấy rằng cỏc chủng HBV kiểu gen B và C cú cựng vị trớ cắt của enzyne TasI, dẫn đến khụng phõn biệt được cỏc chủng HBV cú kiểu gen B và C ở Việt Nam và thực nghiệm cũng chứng minh điều đú (hỡnh 3.54). Hơn nữa HBV kiểu gen B và C là hai kiểu gen phổ biến ở nước ta [1], [18]. Phõn tớch bộ gen của cỏc chủng HBV ở Việt Nam cho thấy cú sự khỏc biệt khỏ lớn về gen của virus so với cỏc chủng HBV chủng hoang dại khỏc trờn thế giới. Sở dĩ cú hiện tượng này chỳng tụi cho rằng do quỏ trỡnh tiến húa lõu đời của virus ỏ cỏc khu vực địa lớ khỏc nhau sẽ cú những thay đổi trong bộ gen của chỳng, Đặc biệt ở Việt Nam nơi cú tỷ lệ nhiễm HBV rất cao từ 10 - 26% vỡ vậy đồng/bội nhiễm hơn một chủng trờn một bệnh nhõn khả năng xẩy ra là cú thể. Hậu quả của đồng/bội nhiễm cỏc kiểu gen khỏc nhau HBV đó được nhiều tỏc giả chứng minh cú tỏc động nhất định đến bệnh cảnh lõm sàng bệnh lý gan [Hannoun và CS (2002),42 Toan NL, Song Le H và CS. 2006], [88].. Mặt khỏc, Đđõy cũng là cơ sở hỡnh thành nờn cỏc chủng HBV tỏi tổ hợp cỏc kiểu gen khỏc nhau và cú thể thành biến chủng mới đó được ghi nhận gần đõy ở Việt Nam [Tran và CS, 200889].
Vỡ vậy, cần nghiờn cứu sử dụng thờm một enzyme khỏc để cú thể phõn biệt được tất cả cỏc kiểu gen B và C của HBV khụng những ở Việt Nam mà trờn thế giới. Tập hợp 70 chủng HBV hoang dại được cụng bố trờn ngõn hàng gen (Genbank) và cỏc chủng HBV nguồn gốc từ bệnh nhõn người Việt Nam mang kiểu gen B và C, sử dụng chương trỡnh GeneGen Runner và BioEdit phõn tớch chỳng tụi đó rỳt ra được chỉ cú một vị trớ duy nhất trờn vựng
preCore (nu.1865-2386, EcoRI=1, X02763, HBV serotype adw2, kiểu gen A) của HBV enzyme SspI cắt với trỡnh tự AATATT (nu. 2250-2254, EcoRI=1, X02763) thuộc về tất cả cỏc kiểu gen A và B của HBV. Vỡ vậy, khi thực hiện phản ứng RFLP với enzyme SspI đối với kiểu gen A hoặc B của HBV sẽ bị cắt thành hai đoạn DNA cú kớch thước là 388 bp và 137 bp, ngược lại đối với cỏc kiểu gen cũn lại (từ C đến G) thỡ trờn đoạn này trỡnh tự AATATT chuyển thành AGTATT nờn SspI khụng thể cắt mảnh DNA trờn được. kKết quả là chỉ cú một mảnh DNA duy nhất đỳng bằng sản phẩm PCR thứ hai (515bp) (Hỡnh 3.65. và 3.76). Chớnh vỡ vậy, sử dụng hai enzyme SspI và TasI cho phộp phõn biệt được cỏc kiểu gen từ A đến G của HBV đặc biệt cỏc chủng HBV mang kiểu gen B và C ở Việt Nam. Đõy là một thành cụng trong việc ứng dụng và phỏt triển kỹ thuật ỏp dụng trong điều kiện thực tế Việt Nam khi xỏc định kiểu gen của HBV.
4.2. Độ đặc hiệu và sự phự hợp của kỹ thuật PCR - RFLP xỏc định kiểu gen của HBV so với đọc trỡnh tự gen.
4.2.1. Kết quả đỏnh giỏ độ đặc hiệu của phản ứng nested --– PCR.
Sau khi hoàn thiện được qui trỡnh PCR - RFLP xỏc định kiểu gen của HBV chỳng tụi tiến hành xỏc định kiểu gen của HBV trờn cỏc mẫu HBV - DNA plasmide của 4 kiểu gen A, B, C, D và trờn 30 HBV - DNA của bệnh nhõn đó được chạy Realtime xỏc định nồng độ virus. Kết quả nghiờn cứu cú cho thấy độ đặc hiệu là 100% (bảng 3. 10). Kết quả này phự hợp với cỏc nghiờn cứu của cỏc tỏc giả khỏc cũng sử dụng phương phỏp PCR - RFLP xỏc định kiểu gen của HBV như Lindh và cộng sự CS (1998) [5761], Guo - Bing - Zeng và cộng sự CS (2004) [3841].
4.2.2. Đỏnh giỏ sự phự hợp của kỹ thuật PCR – RFP xỏc định kiểu gen HBV so với kỹ thuật đọc trỡnh tự gen HBV so với kỹ thuật đọc trỡnh tự gen
Như chỳng ta đó biết phương phỏp đọc trỡnh tự acid nucleic (sequencing) là phương phỏp chuẩn, cú nhiều ưu điểm nổi bật vỡ bờn cạnh việc xỏc định được chớnh xỏc trỡnh tự cỏc nucleotide trong chuỗi genegen của HBV để xỏc định được genotype HBV mà cũn dựa giỳp chỳng ta xỏc định được cỏc dạng virus đột biến khỏng thuốc điều trị đối với cỏc thuốc khỏng virus của HBV để từ đú cú phỏc đồ điều trị tối ưu. Tuy nhiờn, phương phỏp này chi phớ khỏ cao, đầu tư thờm trang thiết bị như hệ thống đọc trỡnh tự gen (Sequencer) nờn chưa khụng dễ phổ biến kỹ thuật này và trang bị. Hơn nữa, đọc trỡnh tự gen cú thờm một nhược điểm nữa cú thể gặp đú là khụng xỏc định được đồng nhiễm cỏc kiểu gen khỏc nhau trờn một bệnh nhõn. Ngược lại, phương phỏp PCR - RFLP sử dụng cỏc enzyme giới hạn cắt đặc hiệu sản phẩm PCR nhõn đoạn gen của HBV và phõn tớch tớnh đa hỡnh của cỏc đoạn giới hạn. Dựa vào khỏc biệt về kớch thước cỏc đoạn giới hạn cho phộp phõn biệt kiểu gen của HBV. Đõy là một phương phỏp khỏ đơn giản dễ thực hiện, cho kết quả chớnh xỏc do đú cú thể thực hiện thường qui trong cỏc phũng thớ nghiệm cú trang bị mỏy PCR thụng thường.
Để khẳng định sự chớnh xỏc và phự hợp của phương phỏp chỳng tụi tiến hành xỏc định kiểu gen của HBV trờn 30 mẫu HBV - DNA đó được xỏc định nồng độ virus đồng thời bằng cả hai phương phỏp PCR - RFLP và đọc trỡnh tự gen. Kết quả cho thấy phương phỏp PCR - RFLP sử dụng 02 enzyme cắt SspI và TasI thỡ 93,33% cho kết quả phự hợp với phương phỏp Sequencing và phõn tớch loài. Hai trường hợp khụng xỏc định được kiểu gen bằẵng kỹ thuật PCR -RFLP thỡ kết quả đọc trỡnh tự gen cho kết quả là kiểu gen tỏi tổ hợp B và C (Hhỡnh 3.120). Điều này cú thể lý giải là khi HBV mang kiểu gen tỏi tổ hợp B và C thỡ vị trớ cắt của enzyme SspI thay đổi do đú enzyme SspI cắt khụng
đỳng (Hhỡnh 3.109 (A), cột 4). Như vậy phương phỏp đọc trỡnh tự gen vẫn được coi là phương phỏp chuẩn xỏc định kiểu gen HBV và xỏc chẩn cỏc phương phỏp khỏc. Phương phỏp trong nghiờn cứu này cũng phự hợp với cỏc phương phỏp khỏc như multiplex - PCR, INNO - LiPA, FT - RDB ...(bảng 4.1).
Kết quả phõn tớch loài cũng khẳng định thờm sự phự hợp của phương phỏp PCR - RFLP xỏc định kiểu gen HBV (Hhỡnh 3.121).
Bảng 4.1. So sỏnh sự phự hợp cỏc phương phỏp với đọc trỡnh tự gen
Tỏc giả (n=30) Số
mẫu
Phương phỏp Tỷ lệ phự
trỡnh tự (%)
Naito và CS (2001) 40 Multiplex - PCR 100
S. Payungporn và CS (2004) 52 Realtime - PCR 92,31 Carla Osiowy và CS (2003) 188 INNO - LiPA 81
Ren – Zhang và CS (2007) 59 FT - RDB 96
Yajun Song và CS (2005) 96 Oligonucleotide Microassay
100
Sadakazu Usuda và CS (1999) 514 ELISA 98,6
Guo-Bing Zeng và CS (2004) 11 RFLP vựng S 97,5 Phương phỏpKết quả trong
nghiờn cứu này
30 RFLP vựng PreCore
93,33
4.2.3. Kết quả đỏnh giỏ ngưỡng phỏt hiện của phương phỏpkỹ thuật PCR -RFLP -RFLP
Khi tiến hành đỏnh giỏ ngưỡng phỏt hiện của phương phỏp PCR - RFLP xỏc định kiểu gen HBV trong nghiờn cứu này chỳng tụi đó lần lượt xỏc định trờn cỏc HBV - DNA plasmide và HBV - DNA mẫu bệnh nhõn. Kết quả cho thấy với HBV - DNA plasmide ngưỡng phỏt hiện là 101, cũn với HBV - DNA mẫu bệnh nhõn là 5,0 x 102. Sự khỏc biệt này cú thể giải thớch là do mẫu HBV - DNA plasmide cú độ tinh sạch cao hơn và thuần hơn so với mẫu bệnh nhõn. So sỏnh ngưỡng phỏt hiện ở cỏc mẫu bệnh nhõn với một số tỏc giả khỏc (Jingsong Chen và O. Kirschberg ) [4751], [6872] thấy rằng ngưỡng phỏt hiện thường từ 2,0 x 102 đến 105 copies/ml. Trong tổng số mẫu nghiờn cứu của chỳng tụi chỉ cú 1 trường hợp nồng độ là < 5,0 x 102 được phỏt hiện là kiểu