Đọc trỡnh tự chuỗi (DNA sequencing) là phương phỏp xỏc định trỡnh tự sắp xếp cỏc nucleotid trong phõn tử DNA [6], [8], [17]. Nguyờn lý của phương phỏp này là: tổng hợp cỏc mạch đơn DNA mới cú độ dài ngắn hơn mạch khuụn; nhờ kỹ thuật đỏnh dấu và ngắt đoạn trong quỏ trỡnh tổng hợp mạch DNA, thu được cỏc mạch đơn hơn kộm nhau một base; từ đú cú được sơ đồ trật tự mạch DNA khuụn mẫu. So sỏnh trật tự mạch của mẫu thớ nghiệm với trỡnh tự DNA chuẩn ta biết được cỏc kiểu gen khỏc nhau cũng như phõn tớch cỏc đột biến cú thể xảy ra. Đọc trỡnh tự gen HBV vựng preCore và S gen được tiến hành theo phương phỏp của Sanger trờn mỏy đọc trỡnh tự tự động ABI 3130 XL, phõn tớch kết quả bằng phần mềm sinh tin học chuyờn dụng BioEdit 7.01..
Sơ đồ qui trỡnh:
Thứ tự cỏc bước thực hiện bao gồm:
Chạy PCR gắn BigDye
Tinh sạch BigDye
Biến tớnh HiDi
Giải trỡnhĐọc trỡnh tự genegen
* Chạy phản ứng PCR gắn BigDye:
Thành phần phản ứng:
+ BigDye Buffer 5X: 1 μl + BigDye terminator: 2 μl
+ PrimerMồi Primer HB-2RF hoặc HB-2R hoặc HB-4F hoặc HB-4R: 0,5 μl
+ DNA template: 0,4 μg + Nước cất khử ion: vừa đủ 10 μl. Chu trỡnh nhiệt: 960C x 1 phỳt (960C x 10 giõy 500C x 5 giõy 600C x 4 phỳt) x 25 chu kỳ. duy trỡ ở 40C * Tinh sạch sản phẩm PCR gắn BigDye:
Tinh sạch BigDye ở sản phẩm PCR trờn bằng Ethanol và EDTA theo quy trỡnh của BigDye Terminater v3.1 [254]:
+ Cho 5 μl EDTA nồng độ 125 mg vào tận đỏy tube chứa sản phẩm PCR. + Cho thờm 600 μl ethanol tuyệt đối vào mỗi phản ứng.
+ Ủ ở nhiệt độ phũng 15 phỳt. + Ly tõm 2500g x 30 phỳt ở 40C
+ Bỏ nước nổi, thờm 600 μl ethanol 70% vào mỗi tube. + Ly tõm 1650g x15 phỳt ở 40C.
+ Bỏ nước nổi.
+ Làm khụ bằng Vacum Dry trong 15 phỳt ở 450C.
* Biến tớnh HiDi và chạy Sequening
Sản phẩm tinh sạch sau khi đó làm khụ và hả hết hơi cồnhoàn toàn, được thờm vào mỗi tube 20 μl HiDi. Để ở 950C x 5 phỳt rồi 40C x 5 phỳt. Cuối cựng đưa toàn bộ sản phẩm đó biến tớnh vào mỏy giải đọc trỡnh tự tự động ABI 3130 XL. Vận hành mỏy theo đỳng qui trỡnh phần mềm đó cài đặt.
2.3.3.6. Phương phỏp đỏnh giỏ độ đặc hiệu của phản ứng nested - PCR
Tiến hành đỏnh giỏ độ đặc hiệu về loài trờn 30 mẫu cDNA của những mẫu đó xỏc định của HCV - RNA (+) và HIVDNA của những mẫu bệnh phẩm xỏc định HIV -- DNA (+). Thực hiện nhõn đoạn gen HBV vựng preCore và S với cỏc cặp mồi đặc hiệu theo qui trỡnh nested - PCR sau khi đó tối ưu húa tỡm cỏc điều kiện phản ứng phự hợp. Chứng dương là cỏc HBV - DNA plasmide tỏi tổ hợp mang kiểu gen A.
2.3.3.7. Phương phỏp đỏnh giỏ sự phự hợp của kỹ thuật PCR - RFLP so với đọc trỡnh tự gen.
Tiến hành đỏnh giỏ trờn 30 mẫu HBV - DNA (+) được xỏc định kiểu gen đồng thời bằng cả hai kỹ thuật PCR - RFLP và đọc trỡnh tự gen. Sau đú tớnh hệ số phự hợp Kappa theo cụng thức :
K = x 100%
OA : Observed Agreement : Phự hợp quan sỏt EA : Expected Agreement : Phự hợp tớnh toỏn
100 - EA OA - EA
* Phõn tớch trỡnh tự gen: trỡnh tự gen thu được phõn tớch sẽ được mụ tả chi tiết ở phần sau.
2.4. Phõn tớch và xử lý số liệu
Trỡnh tự gen HBV được so sỏnh bằng cụng cụ CLUSTAL_W và BLAST. Cỏc trỡnh tự gen của HBV sau khi đó được so sỏnh sẽ được kiểm tra phõn tớch bằng chương trỡnh BioEdit 7.01. Khỏc biệt về gen được tớnh toỏn sử dụng phương phỏp Kimura two - parameter và phõn tớch loài (phylogenegenetic trees) được dựng bởi chương trỡnh neighbour-joining. Kết quả phõn tớch loài HBV được quan sỏt sử dụng phần mềm TreeView v.1.6.6. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Số liệu nghiờn cứu thực nghiệm labo được tổng hợp và xử lý theo phương phỏp thống kờ y học trờn mỏy tớnh sử dụng phần mềm STAT 7.0 (www.stata.com) và STAVIEW 4.57 (www.statview.com).
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIấN CỨU
3.1. Xỏc định điều kiện tối ưu cho kỹ thuật PCR - RFLP phõn biệt kiểu gen HBV
3.1.1. Tối ưu phản ứng nested - PCR nhõn đoạn gen vựng preCore HBV
Trong quy trỡnh nhõn đoạn gen vựng preCore của HBV chỳng tụi đó tham khảo quy trỡnh của Hannoun và CScộng sự, năm (20020) [3942]. Để tăng tớnh đặc hiệu của phản ứng nhõn đoạn gen preCore của HBV chỳng tụi tiến hành xỏc định cỏc điều kiện tối ưu cho phản ứng nested - PCR nhõn đoạn gen vựng preCore của HBV để cho kết quả sản phẩm PCR rừ nột nhất.
3.1.1.1. Tối ưu húa nhiệt độ gắn mồi thớch hợp
Phản ứng nested - PCR nhõn đoạn gene gen preCore của HBV để xỏc định kiểu gen của HBV được thực hiện hai lần liờn tiếp, sản phẩm của phản ứng PCR thứ nhất là mẫu (template) cho phản ứng PCR thứ hai. Mục đớch của sử dụng phản ứng nested - PCR là để tăng khả năng phỏt hiện virus trong mẫu bệnh phẩm và loại bỏ cỏc sản phẩm khụng đặc hiệu. Hơn nữa, đối với việc phỏt hiện virus thỡ với một phản ứng PCR thường rất khú phỏt hiện được ngoại trừ nồng độ virus cao trong mẫu bệnh phẩm. Chớnh vỡ vậy trong nghiờn cứu này chỉ mụ tả quỏ trỡnh xỏc định điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR thứ hai sử dụng đa mồi nhõn đoạn gen vựng preCore của HBV. Tuy nhiờn, chỳng tụi vẫn tớnh toỏn cỏc thành phần cho phản ứng PCR thứ nhất theo qui trỡnh của phản ứng PCR chung. Mẫu nghiờn cứu chỳng tụi sử dụng là cỏc plasmide mang bộ gen HBV tỏi tổ hợp của kiểu gen A, B, C và D.
Bảng 3.1. Thành phần hỗn hợp của phản ứng PCR thứ nhất
TT Thành phần Nồng độ Thể tớch (àl)
1 Nước đó khử ion DNA/RNAase free 15,3
2 Dung dịch đệm (PCR buffer 10X) 1X 2,5
4 dNTPs (2,5 mM) 0,4 mM 4
5 Primer HB-pre16 -1F (10pmoles/àl) 0,5 àM 0,5 6 Primer HB -1R-590as (10pmoles/àl) 0,5 àM 0,5
7 Taq DNA Polymerase (5u/àl) 1unit 0,2
8 DNA HBV plasmide (50 ng/àl) 100 ng 2
Tổng số 25
Chu trỡnh luõn nhiệt được xỏc định là: 950C x 5 phỳt
(960C x 30 giõy → 580C x 45 giõy → 720C x 45 phỳt) x 35 chu kỳ. 720C x 7 phỳt
duy trỡ ở 40C
Sau khi thu được sản phẩm PCR thứ nhất chỳng tụi sử dụng sản phẩm PCR này làm mẫu (template) để tối ưu phản ứng PCR thứ hai (nested - PCR). Để tỡm nhiệt độ gắn mồi phự hợp cho phản ứng PCR, chỳng tụi thực hiện chương trỡnh gradient nhiệt trờn mỏy iCycler. Dựa vào nhiệt độ núng chảy trung bỡnh của mỗi cặp mồi, nhiệt độ gắn mồi được chọn từ 510C đến 620C với cỏc điểm đặt nhiệt độ tăng dần (bảng 3.2). Thành phần phản ứng PCR hoàn toàn giống nhau cả DNA - template và tương ứng với cỏc điểm nhiệt độ đó xỏc định ở trờn mỏy chạy chương trỡnh gradient nhiệt độ. Thực
hiện phản ứng PCR đồng thời trong cựng một điều kiện chỉ khỏc nhau về nhiệt độ gắn mồi.
Kết quả cho thấy sản phẩm PCR (băng DNA) rừ nột nhất ở dóy cột số 5 (mũi tờn) tương ứng với nhiệt độ 58,10 C (Hhỡnh 3.1).
Hỡnh 3.1. Hỡnh điện di sản phẩm PCR thu được sau chạy Gradient tỡm nhiệt độ gắn mồi nhõn đoạn gen preCore của HBV.
Cột M: thang chuẩn DNA (Marker 100 bp); Cột từ 1 đến 8 theo thứ tự tương ứng với nhiệt độ là 510C; 51,90C; 53,30C; 55,20C, 58,10C, 60,10C, 61,40C và
620C.
Bảng 3.2. Kết quả tỡm nhiệt độ gắn mồi thớch hợp cho phản ứng PCR thứ hai
Thời gian Đoạn Ggen đớch T1 510C T2 51,90C T3 53,30C T4 55,20C T5 58,10C T6 60,10C T7 61,40C T8 620 C Vựng Pprecore + + + ++ +++ ++ + +
(+) Kết quả điện di hiện băng DNA cú kớch thước nhỏ và mờ; (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(++) Kết quả điện di hiện băng DNA cú kớch thước lớn nhưng mờ hoặc rừ nhưng nhỏ;
(+++) Kết quả điện di hiện băng DNA cú kớch thước lớn và rừ.
Như vậy, với dải gradient nhiệt độ từ 510C đến 620C, chỳng tụi nhận thấy nhiệt độ gắn mồi tốt nhất tương ứng với mốc nhiệt độ là 58,10C, được làm trũn số là 58 C0 . Cỏc phản ứng được chỳng tụi lặp lại 3 lần trong cựng một điều kiện đều cho kết quả tương tự.
3.1.1.2. Tối ưu hoỏ thời gian gắn mồi
Để tối ưu thời gian gắn mồi phản ứng PCR thứ hai được thực hiện với cỏc plasmide HBV tỏi tổ hợp giống hệt nhau về thành phần phản ứng và nhiệt độ gắn mồi là 58,10C (làm trũn 58 độ) với thời gian gắn mồi theo thứ tự là 30, 35, 40, 45, 50, 55 và 60 giõy. Cỏc phản ứng được thực hiện đồng thời trong cựng một điều kiện của phản ứng PCR chỉ khỏc về thời gian gắn mồi như trờn. Kết quả thu cho sản phẩm PCR rừ nột nhất ở cột số 4, tương ứng với thời gian gắn mồi là 45 giõy. Thớ nghiệm được lặp lại ớt nhất 3 lần trong cựng một điều kiện đều cho kết quả như nhautương tự (hHỡnh 3.2, bBảng 3.3.).
Bảng 3.3. Kết quả tối ưu thời gian gắn mồi cho phản ứng PCR thứ hai
(+) Kết quả điện di cho sản phẩm DNA cú kớch thước nhỏ và mờ.;
(++) Kết quả điện di cho sản phẩm DNA cú kớch thước lớn nhưng mờ hoặc rừ nhưng nhỏ;.
(+++) Kết quả điện di cho sản phẩm DNA cú kớch thước lớn và rừ nột.
Thời gian
Đoạn Ggen đớch 30s 45s 40s 45s 50s 55s 60s
Hỡnh 3.2. Hỡnh điện di sản phẩm PCR thu được sau chạy Gradient tỡm thời gian gắn mồi.
Cột M: thang chuẩn DNA (Marker 100 bp); Cột từ 1 đến 7 tương ứng với cỏc thời gian gắn mồi 30, 35, 40, 45, 50, 55 và 60 giõy.
Tiếp theo chỳng tụi tiến hành tối ưu nồng độ mồi, nồng độ dNTP, nồng độ Mg++ tương tự như trờn và tỡm ra qui trỡnh tối ưu cho phản ứng nested - PCR:
Bảng 3.4. Thành phần hỗn hợp phản ứng nested - PCR
PCR vũng 1 PCR vũng 2
Nước khử ion 17,3 Nước khử ion 34,6
PCR buffer (10X) 2,5 1x PCR buffer (10X) 5 1x dNTP mix (5 mM) 2 0,2 mM dNTP mix (5 mM) 4 0,2 mM Primer HB-pre16F HB-1F (10pmol/l) 0,5 0,5 àM Primer HB-2F(10pmol/l) 1 0,5 àM Primer HB-590as1R (10pmol/l) 0,5 0,5 àM Primer HB-2R và HB-2aR(10pmol/l mỗi primer) 2 0,5 àM Taq Polymerase (5U/àl) 0,2 1 unit Taq Polymerase (5U/àl) 0,4 1 unit
DNA template 2 DNA template 3
Tổng số 25 Tổng số 50
950C x 5 phỳt
; (960C x 30 giõy → 580C x 45 giõy → 720C x 45 phỳt) x 40 chu kỳ; . 720C x 7 phỳt
và duy trỡ ở 40C.
3.1.1.3. Thực hiện phản ứng nested - PCR trờn cỏc plasmide mang bộ gen HBV tỏi tổ hợp kiểu gen A, B, C và D HBV tỏi tổ hợp kiểu gen A, B, C và D
Sau khi xỏc định điều kiện chuẩn cho phản ứng nested - PCR nhõn đoạn gen vựng precore của HBV chỳng tụi thực hiện kiểm tra trờn cỏc plasmide mang bộ gen HBV tỏi tổ hợp cỏc kiểu gen A, B, C và D thấy rằng cả 4 kiểu gen đều xuất hiện sản phẩm rừ nột cú kớch thước là 521 bp (hỡnh 3.3).
Hỡnh 3.3. Hỡnh điện di sản phẩm nested - PCR của HBV-plasmidetrờn 4
kiểu gen HBV.
M, marker 50 bp. 1, Kiểu gen A; 2, Kiểu gen B; 3, Kiểu gen C; 4, Kiểu gen D (kiểu gen của cỏc plasmide đó được xỏc định).
3.1.2. Phõn tớch lựa chọn enzyme giới hạn cho phản ứng RFLP xỏc định kiểu gen của HBV kiểu gen của HBV (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Để phõn biệt cỏc kiểu gen HBV từ A - G, Hannoun và cộng sự CS (2002) sử dụng enzyme TasI. Sơ đồ cắt của enzyme TasI cho phộp phõn biệt kiểu gen của HBV đó được xỏc định như sau [3942].
Hỡnh 3.4. Sơ đồồ và sản phẩm PCR cắt bởi enzyme TasI(Song và CS, 2006)
Mặc dự đó được nhiều tỏc giả trờn thế giới sử dụng enzyme này TasI trong nghiờn cứu xỏc định kiểu gen của HBV. Tuy nhiờn, khi phõn tớch trỡnh tự gen đối với cỏc chủng HBV ở Việt Nam đó cụng bố thấy rằng cỏc chủng HBV kiểu gen B và C cú cựng vị trớ cắt của enzyne TasI, dẫn đến khụng phõn biệt được cỏc chủng HBV cú kiểu gen B và C ở Việt Nam và thực nghiệm cũng chứng minh điều đú (Hỡnh 3.54).
Hỡnh 3.54. Hỡnh điện di sản phẩm PCR cắt bởi TasI kiểu gen B và C.
Cột M: Thang DNA chuẩn 50bp; Cột từ 1 - 4: sản phẩm PCR cắt bởi TasI của kiểu gen B; Cột từ 5 - 8: sản phẩm PCR cắt bởi TasI của kiểu gen C
Vỡ vậy, chỳng tụi đó nghiờn cứu sử dụng thờm một enzyme khỏc bổ sung để cú thể phõn biệt được tất cả cỏc kiểu gen B và C của HBV ở Việt Nam.
SSPI
Tập hợp 70 chủng HBV hoang dại được cụng bố trờn ngõn hàng gen (Genbank) và cỏc chủng HBV nguồn gốc từ bệnh nhõn người Việt Nam mang kiểu gen B và C, sử dụng chương trỡnh GeneGen Runner và BioEdit 7.01 phõn tớch chỳng tụi đó rỳt ra được chỉ cú một vị trớ duy nhất trờn vựng preCore (nu.1865 - 2386, EcoRI = 1, X02763, HBV serotype adw2, kiểu gen A) của HBV enzyme SspI cắt với trỡnh tự AATATT (nu. 2250 - 2254, EcoRI
=1 ) thuộc về kiểu gen A và B của HBV. Vỡ vậy,Tức là, khi thực hiện phản ứng RFLP với enzyme SspI đối với tất cả cỏc kiểu gen A hoặc và B của HBV sẽ bị cắt thành hai đoạn mảnh DNA cú kớch thước là 388 bp và 137 bp, ngược lại đối với cỏc kiểu gen cũn lại (từ C đến G) thỡ trờn đoạn nàytrỡnh tự
AATATT chuyển thành AGTATT nờn SspI khụng thể cắt mảnh DNA trờn được
kết quả là chỉ cú một mảnh DNA duy nhất đỳng bằng sản phẩm PCR thứ hai (515bp) (Hhỡnh 3.65. và 3.76). Chớnh vỡ vậy, sử dụng hai enzyme SspI và TasI cho phộp phõn biệt được cỏc kiểu gen từ A đến G của HBV đặc biệt cỏc chủng HBV mang kiểu gen B và C phổ biến ở Việt Nam.
Hỡnh 3.65. Hỡnh xỏc định Vvị trớ cắt của enzyme SspI trờn vựng preCore
(Nu. 1865-2378) của HBV (Nu. 1865-2378) cho phộp phõn biệt kiểu gen A
và B với cỏc kiểu gen cũn lại từ C -– G
Hỡnh 3.76. Sơ đồ và sản phẩm PCR cắt bởi enzyme SspI. Kiểu gen A hoặc
B enzyme SspI cắt ở vị trớ nu. 2253 (EcoR=1) cho hai đoạn giới hạn của sản phẩm PCR (388bp và 133bp hoặc 127bp), kiểu gen từ C đến G enzyme SspI khụng cắt nờn giữ nguyờn một sản phẩm PCR của gốc ban đầu 515bp hoặc 549bp (HBV-G).
Thực nghiệm trờn cỏc HBV - plasmide kiểu gen A, B, C, D và cỏc mẫu huyết thanh bệnh nhõn nhiễm HBV khẳng định chớnh xỏc với kết quả đó phõn
D E FG Kiểu gen của HBV genotype s 1865 2414 515 bp 1865 A 2253 B 133 bp 388 bp 2386 127 bp 237423 80 HBV-ADN CẮT BỞI ENZYME SSPI
237423 80 388 bp 1865 515 bp 237423 80 186599 54915 bp C 1865 515 bp 237423 80 1865 515 bp 237423 80 1865
tớch trờn cỏc trỡnh tự gen của HBV của cỏc chủng hoang dại đó cụng bố trờn Genbank (Hhỡnh 3.6 và 3.7). Cỏc thớ nghiệm phõn biệt kiểu gen tiếp theo chỳng tụi sử dụng cả hai enzyme là SspI và TasI trong qui trỡnh thực hiện phản ứng PCR - RFLP xỏc định kiểu gen HBV ở Việt Nam.
Hỡnh 3.87. Hỡnh điện di sản phẩm PCR cắt bởi enzyme SspI (A) và TasI
(B).
(A) khi thực hiện phản ứng RFLP với SspI cho thấy kiểu gen A (cột số 1) bị cắt thành hai mảnh DNA kớch thước 388bp và 133bp, kiểu gen B (cột số 2) bị cắt làm hai mảnh kớch thước 388bp và 127bp, cỏc kiểu gen C và D (cột số 3 -
4) khụng bị cắt bởi SspI nờn chỉ cú một mảnh DNA kớch thước bằng 515bp. (B ); M: thang DNA chuẩn 50 bp; Cột từ 1 - 4 tương ứng cỏc kiểu gen A, B, C
và bị cắt bởi SspI và TasI.
3.1.3. Thực hiện kỹ thuật PCR - RFLP xỏc định kiểu gen HBV
3.1.3.1. Kết quả nested - PCR nhõn đoạn gen vựng preCore của HBV
Chỳng tụi tiến hành xỏc định kiểu gen bằng cả hai phương phỏp PCR - RFLP và đọc trỡnh tự gen trờn 30 mẫu huyết thanh của bệnh nhõn cú HBsAg (+) trờn cả hai vựng preCore và S gen của HBV. Kết quả thu được như sau.
Bảng 3.5. Bảng kết quả nested - PCR nhõn đoạn gen vựng preCore HBV (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sản phẩm PCR Số lượng Tỷ lệ(%)
Cú sản phẩm PCR đặc hiệu 30 100
Khụng cú sản phẩm PCR đặc hiệu 0 0
Tổng số 30 100
Nhận xột: Kết quả điện di kiểm tra cho thấy tổng số 30 mẫu cú HBsAg (+) trờn cả hai vựng preCore và S gen của HBV theo thứ tự đều xuất hiện sản