kiểu gen của HBV
Để phõn biệt cỏc kiểu gen HBV từ A - G, Hannoun và cộng sự CS (2002) sử dụng enzyme TasI. Sơ đồ cắt của enzyme TasI cho phộp phõn biệt kiểu gen của HBV đó được xỏc định như sau [3942].
Hỡnh 3.4. Sơ đồồ và sản phẩm PCR cắt bởi enzyme TasI(Song và CS, 2006)
Mặc dự đó được nhiều tỏc giả trờn thế giới sử dụng enzyme này TasI trong nghiờn cứu xỏc định kiểu gen của HBV. Tuy nhiờn, khi phõn tớch trỡnh tự gen đối với cỏc chủng HBV ở Việt Nam đó cụng bố thấy rằng cỏc chủng HBV kiểu gen B và C cú cựng vị trớ cắt của enzyne TasI, dẫn đến khụng phõn biệt được cỏc chủng HBV cú kiểu gen B và C ở Việt Nam và thực nghiệm cũng chứng minh điều đú (Hỡnh 3.54).
Hỡnh 3.54. Hỡnh điện di sản phẩm PCR cắt bởi TasI kiểu gen B và C.
Cột M: Thang DNA chuẩn 50bp; Cột từ 1 - 4: sản phẩm PCR cắt bởi TasI của kiểu gen B; Cột từ 5 - 8: sản phẩm PCR cắt bởi TasI của kiểu gen C
Vỡ vậy, chỳng tụi đó nghiờn cứu sử dụng thờm một enzyme khỏc bổ sung để cú thể phõn biệt được tất cả cỏc kiểu gen B và C của HBV ở Việt Nam.
SSPI
Tập hợp 70 chủng HBV hoang dại được cụng bố trờn ngõn hàng gen (Genbank) và cỏc chủng HBV nguồn gốc từ bệnh nhõn người Việt Nam mang kiểu gen B và C, sử dụng chương trỡnh GeneGen Runner và BioEdit 7.01 phõn tớch chỳng tụi đó rỳt ra được chỉ cú một vị trớ duy nhất trờn vựng preCore (nu.1865 - 2386, EcoRI = 1, X02763, HBV serotype adw2, kiểu gen A) của HBV enzyme SspI cắt với trỡnh tự AATATT (nu. 2250 - 2254, EcoRI
=1 ) thuộc về kiểu gen A và B của HBV. Vỡ vậy,Tức là, khi thực hiện phản ứng RFLP với enzyme SspI đối với tất cả cỏc kiểu gen A hoặc và B của HBV sẽ bị cắt thành hai đoạn mảnh DNA cú kớch thước là 388 bp và 137 bp, ngược lại đối với cỏc kiểu gen cũn lại (từ C đến G) thỡ trờn đoạn nàytrỡnh tự
AATATT chuyển thành AGTATT nờn SspI khụng thể cắt mảnh DNA trờn được
kết quả là chỉ cú một mảnh DNA duy nhất đỳng bằng sản phẩm PCR thứ hai (515bp) (Hhỡnh 3.65. và 3.76). Chớnh vỡ vậy, sử dụng hai enzyme SspI và TasI cho phộp phõn biệt được cỏc kiểu gen từ A đến G của HBV đặc biệt cỏc chủng HBV mang kiểu gen B và C phổ biến ở Việt Nam.
Hỡnh 3.65. Hỡnh xỏc định Vvị trớ cắt của enzyme SspI trờn vựng preCore
(Nu. 1865-2378) của HBV (Nu. 1865-2378) cho phộp phõn biệt kiểu gen A
và B với cỏc kiểu gen cũn lại từ C -– G
Hỡnh 3.76. Sơ đồ và sản phẩm PCR cắt bởi enzyme SspI. Kiểu gen A hoặc
B enzyme SspI cắt ở vị trớ nu. 2253 (EcoR=1) cho hai đoạn giới hạn của sản phẩm PCR (388bp và 133bp hoặc 127bp), kiểu gen từ C đến G enzyme SspI khụng cắt nờn giữ nguyờn một sản phẩm PCR của gốc ban đầu 515bp hoặc 549bp (HBV-G).
Thực nghiệm trờn cỏc HBV - plasmide kiểu gen A, B, C, D và cỏc mẫu huyết thanh bệnh nhõn nhiễm HBV khẳng định chớnh xỏc với kết quả đó phõn
D E FG Kiểu gen của HBV genotype s 1865 2414 515 bp 1865 A 2253 B 133 bp 388 bp 2386 127 bp 237423 80 HBV-ADN CẮT BỞI ENZYME SSPI
237423 80 388 bp 1865 515 bp 237423 80 186599 54915 bp C 1865 515 bp 237423 80 1865 515 bp 237423 80 1865
tớch trờn cỏc trỡnh tự gen của HBV của cỏc chủng hoang dại đó cụng bố trờn Genbank (Hhỡnh 3.6 và 3.7). Cỏc thớ nghiệm phõn biệt kiểu gen tiếp theo chỳng tụi sử dụng cả hai enzyme là SspI và TasI trong qui trỡnh thực hiện phản ứng PCR - RFLP xỏc định kiểu gen HBV ở Việt Nam.
Hỡnh 3.87. Hỡnh điện di sản phẩm PCR cắt bởi enzyme SspI (A) và TasI
(B).
(A) khi thực hiện phản ứng RFLP với SspI cho thấy kiểu gen A (cột số 1) bị cắt thành hai mảnh DNA kớch thước 388bp và 133bp, kiểu gen B (cột số 2) bị cắt làm hai mảnh kớch thước 388bp và 127bp, cỏc kiểu gen C và D (cột số 3 -
4) khụng bị cắt bởi SspI nờn chỉ cú một mảnh DNA kớch thước bằng 515bp. (B ); M: thang DNA chuẩn 50 bp; Cột từ 1 - 4 tương ứng cỏc kiểu gen A, B, C
và bị cắt bởi SspI và TasI.