+ Cỏc primer đặc hiệu cho nhõn đoạn genegen vựng preCcore của HBV cú trỡnh tự tương ứng là:
- Cặp primer cho phản ứng PCR thứ nhất để tăng độ nhạy của phản ứng PCR (Song, le h,, Toaàn NL và CS, 2006) [88]:
HB_-pre1F6: 5’_CACCTCTGCCAATCATCTCT_3’
HB-590as_2R: 5’_CTGCGAGGCGAGGGAGTT_3’; 58975 bp
- Cỏc primer cho phản ứng PCR thứ hai (nested - nPCR) (Hannoun và
CS, 2002) [42]. HB-_2F: 5’_CAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGT_3’ HB-_2R: 5’_TTCTTCTTCTAGGGGACCTGCCTCAGTCC_3’; 51521bp HB-_2aR: 5’_TTCTTCTTCTAGGGGACCTGCCTCATCGT_3’; 51521 bp
+ Cỏc primer đặc hiệu dựng cho nhõn đoạn gen vựng S của HBV cú trỡnh tự tương ứng là:
- Cặp primer cho phản ứng PCR thứ nhất:
HB-_3F: 5’_TGCTGCTATGCCTCATCTTC_3’
HB-_3R: 5’_CAGAGACAAAAGAAAATTGG_3’; 409 bp - Cặp primer cho phản ứng PCR thứ hai (nested - n-PCR): HB-_4F: 5’_CAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCT_3’ HB-_4R: 5’_GGTATAAAGGGACTCACGATG_3’; 341 bp
2.3. Phương phỏp nghiờn cứu 2.3.1. Thiết kế nghiờn cứu
- Theo phương phỏp dịch tễ học mụ tả cắt ngang cú phõn tớch so sỏnh - Nghiờn cứu thực nghiệm Labo cú phõn tớch đối chứng
2.3.2. Sơ đồ nghiờn cứu
2.3.3. Quy trỡnh nghiờn cứu
2.3.3.1. Lấy mẫu bệnh phẩm
Mỏu tĩnh mạch được lấy vào buổi sỏng, khụng chống đụng, ly tõm tỏch huyết thanh sau đú cho vào ống Eppendorf cú nắp khoỏ, mỗi mẫu lấy 2 ống, cho ngay vào tủ -70 0C.
Genome HBV cỏc chủng hoang
dại, HBV plasmide tỏi tổ hợp Mẫu huyểt thanh của bệnh nhõn cú HBsAg dương tớnh
Thiết kế mồi và Phõn tớch lựa chọn enzyme giới hiạn phõn biệt được cỏc kiểu gen HBV bằng cho
phản ứng PCR-RFLP
Tỏch chiết, tinh sạch DNA từ cỏc mẫu huyết thanh
Thực hiện phản ứng Nested - PCR lồng Thưc hiện phản ứng PCR-RFLP trờn cỏc HBV plasmid tỏi tổ hợp Thưc hiện phản ứng PCR- RFLP trờn cỏc mẫu lõm sàng
Đỏnh giỏ sự phự hợp, độ nhạy và độ đặc hiệu phương phỏpkỹ thuật PCR - RFLP so với đọc trỡnh tự gen xỏc định kiểu gen của HBV với cỏc
2.3.3.2. Kỹ thuật tỏch và tinh sạch DNA
Tỏch chiết và tinh sạch DNA tổng số theo qui trỡnh hướng dẫn của nhà sản xuất, chỳng tụi sử dụng bộ kớt QIA amp DNA Mini Kit , Hóng QIAGEN Cộng hũa Liờn bang Đức. Qui trỡnh túm tắt như sau:
1. Cho 20àl Protease K vào tube eppendorf 1,5 ml. Sau đú cho 200àl huyết thanh mẫu vào.
2. Cho 200àl buffer AL vào mẫu sau đú lắc trộn trong 15 giõy. 3. Ủ ở nhiệt độ 56 0C trong 10 phỳt, ly tõm ngắn.
4. Cho 200àl cồn tuyệt đối vào mẫu sau đú lắc trộn 15 giõy, rồi ly tõm 15”.
5. Chuyển toàn bộ sang cột lọc và đựng trong ống đi kốm (tube QIAamp spin column). Ly tõm 8000 vũng/phỳt trong 1 phỳt, bỏ dịch lọc và giữ lại cột.
6. Cho 500àl Buffer AW1 để rửa cột. Ly tõm 8000 vũng/phỳt trong 1 phỳt sau đú bỏ dịch lọc và giữ lại cột.
7. Cho 500àl Buffer AW2. Ly tõm 14000 vũng/phỳt trong 3 phỳt sau đú bỏ dịch lọc, giữ lại cột. Tiếp tục ly tõm 14000 vũng/phỳt trong 1 phỳt. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
8. Chuyển cột sang một tube eppendorf 1.5 ml vụ trựng. Sau đú thờm 200àl Buffer AE hoặc nước cất khử ion. Ủ nhiệt phũng trong 1 phỳt rồi ly tõm 8000 rpm trong 1 phỳt.
9. Thu DNA trong tube và bảo quản ở - 200C.
2.3.3.3. Phản ứng polymerase chain reaction (PCR)+ Nguyờn tắc chung của phản ứng PCR + Nguyờn tắc chung của phản ứng PCR
PCR là một kỹ thuật cho phộp nhõn nhanh một đoạn gen mong muốn lờn hàng triệu lần trong một thời gian ngắn nhờ hai cặp mồi (primer) oligonucleotit tương hợp với hai đầu 3’ ở cả 2 sợi của đoạn DNA đớch (target sequence) với sự tham gia của enzyme DNA polymerase. Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ khộp kớn nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước [7].
Bước 1: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm cỏc thành phần cần thiết cho sự sao chộp, phõn tử DNA được biến tớnh ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ núng chảy (Tm) của phõn tử, thường là ở 94OC ữ 95OC trong vũng 30 giõy đến 1 phỳt. Đõy là giai đoạn biến tớnh DNA (denaturation).
Bước 2: Nhiệt độ được hạ thấp ( thấp hơn Tm của cỏc mồi) cho phộp cỏc mồi bắt cặp với khuụn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 ữ 70o C tuỳ thuộc Tm của cỏc mồi sử dụng kộo dài từ 30 giõy ữ 60 giõy. Đõy là giai đoạn bắt mồi (annealing).
Bước 3: Nhiệt độ được tăng lờn đến 72OC giỳp cho DNA polymerase hoạt động tổng hợp tốt nhất, thời gian tuỳ thuộc vào độ dài của trỡnh tự DNA cần khuyếch đại. Thường kộo dài từ 30 giõy đến vài phỳt. Đõy là giai đoạn tổng hợp (extension).
Một chu kỳ bao gồm 3 bước trờn sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần sẽ làm tăng gấp đụi lượng mẫu của lần trước. Đõy là sự khuyếch đại theo cấp số nhõn, sau 30 chu kỳ kết qủa quả thu được sẽ là 106 lần so với ban đầu.
+ Kỹ thuật Realtime - PCR.
Kỹ thuật Realtime - PCR hay cũn gọi là PCR định lượng, là kỹ thuật được sử dụng để đồng thời khuyếch đại và định lượng một đoạn DNA đặc hiệu từ DNA của mẫu. DNA được khuyếch đại bằng phản ứng chuỗi trựng hợp và được định lượng sau mỗi chu kỳ. Phương phỏp sử dụng cỏc chất phỏt huỳnh quang được bổ sung vào trong phản ứng PCR. Những chất phỏt huỳnh quang này bao gồm thuốc nhuộm liờn kết DNA và những trỡnh tự gắn huỳnh quang liờn kết đặc hiệu với primer gọi là mẫu dũ “probe”. Sau mỗi chu kỳ thỡ số luợng DNA tăng lờn sẽ tỷ lệ thuận với tớn hiệu huỳnh quang đo được nhờ đầu đọc của cỏc mỏy Realtime - PCR. Trong nghiờn cứu này chỳng tụi sử
dụng mẫu dũ là Taqman probe cho phản ứng Realtime - PCR xỏc định nồng độ HBV - DNA cỏc mẫu nghiờn cứu [17].
+ Kỹ thuật nested - PCR (PCR lồng)
Kỹ thuật nNested - PCR nhõn đoạn genegen vựng preCore của HBV được thực hiện tương tự như ở cỏc labo sinh học phõn tử khỏc trờn thế giới [7]. hai lần liờn tiếp, sản phẩm của phản ứng PCR thứ nhất là mẫu (template) cho phản ứng PCR thứ hai. Đoạn gen được tổng hợp lần thứ hai ngắn hơn (nằm trong) so với đoạn gen đó tổng hợp ở phản ứng PCR thứ nhất. Đõy gọi là phỏn ứng PCR lồng hay nested - PCR.
Bảng 2.1. Tớnh toỏn cỏc tThành phần hỗn hợp cho phản ứng PCR
Phản ứng PCR vũng 1thứ nhất Phản ứng PCR vũng 2thứ hai
Nước khử ion 16.,3 Nước khử ion 35.,8
PCR bufer (10X) 2.,5 1x PCR bufer (10X) 5 1x dNTP mix (5 mM) 2 0.,2 mM dNTP mix (5 mM) 4 0.,2 mM Mồi PrimerHB-
pre16Fhoặc HB-3F ( 0.,5 0.,5 àM Primer Mồi HB-2F hoặc HB- 1 0.,5 àM PrimerMồi1R HB-
590as hoặc HB-3R (10pmol/l)
0.,5 0.,5 àM Primer Mồi HB-2R và HB-2aR
hoặc HB-
1 0.,5 àM Taq Polymerase
(5U/àl) 0.,2 1 unit (5U/àl)Taq Polymerase 0.,2 1 unit
DNA template 3 DNA template 3
Tổng số 25 Tổng số 50
Chu trỡnh luõn nhiệt cho phản ứng PCR lồng (nested - PCR)
- Sau chu kỳ đầu tiờn biến tớnh DNA ở nhiệt độ 95 0C trong 5 phỳt - Thực hiện chu trỡnh gồm 40 chu kỳ, mỗi chu kỳ 3 bước như sau: Bước 1: Duỗi xoắn DNA cưỡng bức ở 940 C trong 30 giõy.
PHẦN NÀY LẦN TRƯỚC TễI ĐÃ SỬA MỘT LẦN RỒI. ANH KIỂM TRA LẠI. TễI SỬA CHO ANH NẾU KHễNG ĐỒNG í PHẢI GIẢI TRèNH LẠI!!!!!
Bước 2: Hạ nhiệt độ xuống 580 C trong 40 giõy để gắn mồi vào gen đớch. Bước 3: Nõng nhiệt độ lờn 720 C trong 45 giõy để Taq DNA - polymerase xỳc tỏc phản ứng nối dài primer theo nguyờn lý bổ xung với gen đớch của HBV để tổng hợp nờn đoạn DNA mới giống hệt đoạn DNA của gen đớch ban đầu.
- Cuối cựng là bước kộo dài duy trỡ trong 7 phỳt. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Điện di sản phẩm PCR trờn Agarose 1,5%, nhuộm Ethidium bromide và đọc trờn mỏy đọc Gel - Doc. Lưu giữ hỡnh ảnh kết quả thử nghiệm.
2.3.3.4. Thực hiện phản ứng RFLP xỏc định kiểu gen của HBV
Sử dụng enzyme giới hạn để cắt sản phẩm PCR thứ 2. Kết quả thu được dựng để phõn tớch kiểu genegen của HBV.
Phản ứng RFLP dựng enzyme lựa chọn phự hợp phõn biệt cỏc kiểu gen của HBV (sẽ được mụ tả kỹ ở phần kết quả). Qui trỡnh thực hiện phản ứng theo hướng dẫn của nhà sản xuất để đảm bảo hiệu suất tối đa và đạt kết quả tốt nhất. Sản phẩm PCR sau khi thực hiện phản ứng RFLP được đĐiện di trờn thạch agarose 1,5%, phõn tớch và xỏc định kiểu gen HBV dựa vào tớnh đa hỡnh của cỏc đoạn giới hạn.
Phản ứng RFLP dựng enzyme TasI, theo qui trỡnh của nhà sản xuất và mụ tả của một số cụng trỡnh cụng bố gần đõy (Hannoun và cs, 2002) [3942]. Để tăng hiệu suất và nhanh chỳng tụi sử dụng enzyme giới hạn FastDigest TasI [640]:
Hỗn hợp phản ứng RFLP dựng FastDigest TasI. - FastDigest buffer B: 2μl
- FastDigest Enzyme: 1μl
- Sản phẩm PCR product: 15μl
Ủ ở 650C lắc 650 vũng/phỳt trong 15 phỳt. Điện di trờn thạch agarose 1,5% kiểm tra, phõn tớch và xỏc định kiểu gen HBV dựa vào tớnh đa hỡnh của cỏc đoạn giới hạn.
2.3.3.5. Phương phỏp đọc trỡnh tự DNA (Sequencing)
Đọc trỡnh tự chuỗi (DNA sequencing) là phương phỏp xỏc định trỡnh tự sắp xếp cỏc nucleotid trong phõn tử DNA [6], [8], [17]. Nguyờn lý của phương phỏp này là: tổng hợp cỏc mạch đơn DNA mới cú độ dài ngắn hơn mạch khuụn; nhờ kỹ thuật đỏnh dấu và ngắt đoạn trong quỏ trỡnh tổng hợp mạch DNA, thu được cỏc mạch đơn hơn kộm nhau một base; từ đú cú được sơ đồ trật tự mạch DNA khuụn mẫu. So sỏnh trật tự mạch của mẫu thớ nghiệm với trỡnh tự DNA chuẩn ta biết được cỏc kiểu gen khỏc nhau cũng như phõn tớch cỏc đột biến cú thể xảy ra. Đọc trỡnh tự gen HBV vựng preCore và S gen được tiến hành theo phương phỏp của Sanger trờn mỏy đọc trỡnh tự tự động ABI 3130 XL, phõn tớch kết quả bằng phần mềm sinh tin học chuyờn dụng BioEdit 7.01..
Sơ đồ qui trỡnh:
Thứ tự cỏc bước thực hiện bao gồm:
Chạy PCR gắn BigDye
Tinh sạch BigDye
Biến tớnh HiDi
Giải trỡnhĐọc trỡnh tự genegen
* Chạy phản ứng PCR gắn BigDye:
Thành phần phản ứng:
+ BigDye Buffer 5X: 1 μl + BigDye terminator: 2 μl
+ PrimerMồi Primer HB-2RF hoặc HB-2R hoặc HB-4F hoặc HB-4R: 0,5 μl
+ DNA template: 0,4 μg + Nước cất khử ion: vừa đủ 10 μl. Chu trỡnh nhiệt: 960C x 1 phỳt (960C x 10 giõy 500C x 5 giõy 600C x 4 phỳt) x 25 chu kỳ. duy trỡ ở 40C * Tinh sạch sản phẩm PCR gắn BigDye:
Tinh sạch BigDye ở sản phẩm PCR trờn bằng Ethanol và EDTA theo quy trỡnh của BigDye Terminater v3.1 [254]:
+ Cho 5 μl EDTA nồng độ 125 mg vào tận đỏy tube chứa sản phẩm PCR. + Cho thờm 600 μl ethanol tuyệt đối vào mỗi phản ứng.
+ Ủ ở nhiệt độ phũng 15 phỳt. + Ly tõm 2500g x 30 phỳt ở 40C
+ Bỏ nước nổi, thờm 600 μl ethanol 70% vào mỗi tube. + Ly tõm 1650g x15 phỳt ở 40C.
+ Bỏ nước nổi.
+ Làm khụ bằng Vacum Dry trong 15 phỳt ở 450C.
* Biến tớnh HiDi và chạy Sequening
Sản phẩm tinh sạch sau khi đó làm khụ và hả hết hơi cồnhoàn toàn, được thờm vào mỗi tube 20 μl HiDi. Để ở 950C x 5 phỳt rồi 40C x 5 phỳt. Cuối cựng đưa toàn bộ sản phẩm đó biến tớnh vào mỏy giải đọc trỡnh tự tự động ABI 3130 XL. Vận hành mỏy theo đỳng qui trỡnh phần mềm đó cài đặt. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.3.6. Phương phỏp đỏnh giỏ độ đặc hiệu của phản ứng nested - PCR
Tiến hành đỏnh giỏ độ đặc hiệu về loài trờn 30 mẫu cDNA của những mẫu đó xỏc định của HCV - RNA (+) và HIVDNA của những mẫu bệnh phẩm xỏc định HIV -- DNA (+). Thực hiện nhõn đoạn gen HBV vựng preCore và S với cỏc cặp mồi đặc hiệu theo qui trỡnh nested - PCR sau khi đó tối ưu húa tỡm cỏc điều kiện phản ứng phự hợp. Chứng dương là cỏc HBV - DNA plasmide tỏi tổ hợp mang kiểu gen A.
2.3.3.7. Phương phỏp đỏnh giỏ sự phự hợp của kỹ thuật PCR - RFLP so với đọc trỡnh tự gen.
Tiến hành đỏnh giỏ trờn 30 mẫu HBV - DNA (+) được xỏc định kiểu gen đồng thời bằng cả hai kỹ thuật PCR - RFLP và đọc trỡnh tự gen. Sau đú tớnh hệ số phự hợp Kappa theo cụng thức :
K = x 100%
OA : Observed Agreement : Phự hợp quan sỏt EA : Expected Agreement : Phự hợp tớnh toỏn
100 - EA OA - EA
* Phõn tớch trỡnh tự gen: trỡnh tự gen thu được phõn tớch sẽ được mụ tả chi tiết ở phần sau.
2.4. Phõn tớch và xử lý số liệu
Trỡnh tự gen HBV được so sỏnh bằng cụng cụ CLUSTAL_W và BLAST. Cỏc trỡnh tự gen của HBV sau khi đó được so sỏnh sẽ được kiểm tra phõn tớch bằng chương trỡnh BioEdit 7.01. Khỏc biệt về gen được tớnh toỏn sử dụng phương phỏp Kimura two - parameter và phõn tớch loài (phylogenegenetic trees) được dựng bởi chương trỡnh neighbour-joining. Kết quả phõn tớch loài HBV được quan sỏt sử dụng phần mềm TreeView v.1.6.6.
Số liệu nghiờn cứu thực nghiệm labo được tổng hợp và xử lý theo phương phỏp thống kờ y học trờn mỏy tớnh sử dụng phần mềm STAT 7.0 (www.stata.com) và STAVIEW 4.57 (www.statview.com).
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIấN CỨU
3.1. Xỏc định điều kiện tối ưu cho kỹ thuật PCR - RFLP phõn biệt kiểu gen HBV
3.1.1. Tối ưu phản ứng nested - PCR nhõn đoạn gen vựng preCore HBV
Trong quy trỡnh nhõn đoạn gen vựng preCore của HBV chỳng tụi đó tham khảo quy trỡnh của Hannoun và CScộng sự, năm (20020) [3942]. Để tăng tớnh đặc hiệu của phản ứng nhõn đoạn gen preCore của HBV chỳng tụi tiến hành xỏc định cỏc điều kiện tối ưu cho phản ứng nested - PCR nhõn đoạn gen vựng preCore của HBV để cho kết quả sản phẩm PCR rừ nột nhất.
3.1.1.1. Tối ưu húa nhiệt độ gắn mồi thớch hợp
Phản ứng nested - PCR nhõn đoạn gene gen preCore của HBV để xỏc định kiểu gen của HBV được thực hiện hai lần liờn tiếp, sản phẩm của phản ứng PCR thứ nhất là mẫu (template) cho phản ứng PCR thứ hai. Mục đớch của sử dụng phản ứng nested - PCR là để tăng khả năng phỏt hiện virus trong mẫu bệnh phẩm và loại bỏ cỏc sản phẩm khụng đặc hiệu. Hơn nữa, đối với việc phỏt hiện virus thỡ với một phản ứng PCR thường rất khú phỏt hiện được ngoại trừ nồng độ virus cao trong mẫu bệnh phẩm. Chớnh vỡ vậy trong nghiờn cứu này chỉ mụ tả quỏ trỡnh xỏc định điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR thứ hai sử dụng đa mồi nhõn đoạn gen vựng preCore của HBV. Tuy nhiờn, chỳng tụi vẫn tớnh toỏn cỏc thành phần cho phản ứng PCR thứ nhất theo qui trỡnh của phản ứng PCR chung. Mẫu nghiờn cứu chỳng tụi sử dụng là cỏc plasmide mang bộ gen HBV tỏi tổ hợp của kiểu gen A, B, C và D.
Bảng 3.1. Thành phần hỗn hợp của phản ứng PCR thứ nhất
TT Thành phần Nồng độ Thể tớch (àl)
1 Nước đó khử ion DNA/RNAase free 15,3
2 Dung dịch đệm (PCR buffer 10X) 1X 2,5
4 dNTPs (2,5 mM) 0,4 mM 4
5 Primer HB-pre16 -1F (10pmoles/àl) 0,5 àM 0,5 6 Primer HB -1R-590as (10pmoles/àl) 0,5 àM 0,5
7 Taq DNA Polymerase (5u/àl) 1unit 0,2
8 DNA HBV plasmide (50 ng/àl) 100 ng 2
Tổng số 25
Chu trỡnh luõn nhiệt được xỏc định là: 950C x 5 phỳt
(960C x 30 giõy → 580C x 45 giõy → 720C x 45 phỳt) x 35 chu kỳ. 720C x 7 phỳt (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
duy trỡ ở 40C
Sau khi thu được sản phẩm PCR thứ nhất chỳng tụi sử dụng sản phẩm PCR này làm mẫu (template) để tối ưu phản ứng PCR thứ hai (nested - PCR). Để tỡm nhiệt độ gắn mồi phự hợp cho phản ứng PCR, chỳng tụi thực hiện chương trỡnh gradient nhiệt trờn mỏy iCycler. Dựa vào nhiệt độ núng chảy trung bỡnh của mỗi cặp mồi, nhiệt độ gắn mồi được chọn từ 510C đến 620C với cỏc điểm đặt nhiệt độ tăng dần (bảng 3.2). Thành phần phản ứng PCR hoàn toàn giống nhau cả DNA - template và tương ứng với cỏc điểm nhiệt độ đó xỏc định ở trờn mỏy chạy chương trỡnh gradient nhiệt độ. Thực
hiện phản ứng PCR đồng thời trong cựng một điều kiện chỉ khỏc nhau về nhiệt độ gắn mồi.
Kết quả cho thấy sản phẩm PCR (băng DNA) rừ nột nhất ở dóy cột số 5 (mũi tờn) tương ứng với nhiệt độ 58,10 C (Hhỡnh 3.1).
Hỡnh 3.1. Hỡnh điện di sản phẩm PCR thu được sau chạy Gradient tỡm