polymorphism)
Phương phỏp PCR - RFLP dựa trờn sự khuyếch đại một đoạn gen bằng phản ứng PCR, sau đú tiến hành phản ứng RFLP bằng việc sử dụng cỏc enzyme giới hạn, cuối cựng điện di phõn tớch tớnh đa hỡnh dựa vào kớch thước của cỏc đoạn giới hạn. Sự lựa chọn cỏc enzyme giới hạn bằng việc dựa vào phõn tớch trỡnh tự của cỏc kiểu gen khỏc nhau đó được cụng bố trờn GenBank. Phương phỏp này đó được Mizokami và cộng sự CS (1999) phỏt triển cho phộp phõn biệt cỏc kiểu gen của HBV bằng bốn enzyme là NciI, AlwI, EarI và
NlaIV [2281]. Lindh và cộng sựCS (1998) cũng ứng dụng kỹ thuật này nhưng
chỉ sử dụng hai emzyme là AvaII và DpnII cho phộp xỏc định cỏc kiểu gen từ A - F trờn 99 mẫu lõm sàng thỡ 95 mẫu xỏc định được kiểu gen trong đú kiểu gen A: 23, kiểu gen B: 20, kiểu gen C: 20, kiểu gen D: 22 và kiểu gen E: 3, kiểu gen F là 5. Khi so sỏnh với đọc trỡnh tự và phõn tớch loài thỡ chỉ cú 1 trường hợp là khụng phự hợp [57]. Hannoun và cộng sựCS (2002) đó phỏt triển kỹ thuật này nhưng chỉ sử dụng một enzyme là TasI cho phộp phõn biệt
cỏc kiểu gen khỏc nhau. Tuy nhiờn đoạn khuyếch đại lại nằm trờn vựng preCore [4239]. Ở nước ta Bựi Xuõn Trường và cộng sựCS (2008) cũng ứng dụng phương phỏp PCR - RFLP xỏc định kiểu gen của HBV trờn 182 đối tượng của 16 tỉnh phớa Bắc bao gồm 76 người lành mang virus và 106 bệnh nhõn mắc bệnh gan mạn tớnh. Kết quả cho thấy chỉ cú 2 kiểu gen B và C được phỏt hiện với tỷ lệ lần lượt là 129/182 (70,9%) và 53/182 (29,1%) [18].
Phương phỏp PCR - RFLP cú nhiều ưu điểm như khụng cần nhiều cỏc trang thiết bị đắt tiền, tiến hành đơn giản và khụng mất nhiều thời gian do đú chi phớ cho một xột nghiệm khụng cao. Ở Việt Nam phổ biến hiện nay sử
dụng phương phỏp giải trỡnh tự gen, phương phỏp lai đầu dũ và multiplex - PCR [5], [15], [19]. Trong nghiờn cứu này chỳng tụi nghiờn cứu phỏt triển phương phỏp PCR - RFLP xỏc định kiểu gen HBV cú ý nghĩa gúp phần làm giảm giỏ thành xột nghiệm, phổ biến rộng kỹ thuật, tiết kiệm thời gian, chi phớ xột nghiệm và điều trị cho người bệnh.
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.1. Đối tượng nghiờn cứuĐối tượng nghiờn cứu
Trỡnh tự bộ gen (Genome) HBV chủng hoang dại đại diện cho 8 kiểu gen HBV thu được trờn Genbank (70 chủng) được sử dụng để thiết kế mồi và lựa chọn enzyme giới hạn. Ngoài ra cũn sử dụng 46 chủng HBV phõn lập từ bệnh nhõn người Việt Nam đó cụng bố trờn Ngõn hàng gen [1], [651] Cỏc chủng HBV hoang dại được sử dụng nghiờn cứu cú ký hiệu quốc tế là V00866 – A, M57663 – A, X02763 – A, X51970 – A, Z35717 – A, E00010 – A, X70185 – A, Z72478 – A, L13994 – A, S50225 – A, D23677 – B, D23678 – B, D23679 – B, D00330 – B, D00331 – B, D50521 – B, D50522 – B, D54923 – B, D00329 – B, X98077 – B, X97850 – B, X97851 – B, D00630 – C, D12980 – C, D16665 – C, D16666 – C, D16667 – C, D23680 – C, D23681 – C, D23682 – C, D23683 – C, D23684 – C, D28880 – C, D54089 – C, D50517 – C, D50519 – C, D50520 – C, L08805 – C, M12906 – C, M38454 – C, V00867 – C, X01587 – C, X04615 – C, X14193 – C, X75665 – C, X52939 – C, V01460 – D, L27106 – D, U95551 – D, M32138 – D, X02496 – D, X59975 – D, X68292 – D, X72702 – D, Z35716 – D, X97848 – D, X97849 – D, X80924 – D, X80925 – D, X80926 – D, Y07587 – D, X65257 – D, X65258 – D, X65259 – D, X75657 – E, X75664 – E, X75658 – F, X75663 – F, X69798 – G.
Ngoài ra, 95 mẫu huyết thanh của bệnh nhõn cú HBsAg và HBV - DNA dương tớnh tại Phũng Vi sinh vật và cỏc mầm bệnh sinh học thuộc Trung tõm Y Dược học Quõn sự - Học viện Quõn y được dựng đỏnh giỏ độ nhạy, sự phự hợp của hai kỹ thuật PCR - RFLP với đọc trỡnh tự gen..
Cỏc mẫu plasmide tỏi tổ hợp mang toàn bộ bộ gen HBV chủng hoang dại thuộc cỏc kiểu gen A, B, C, D [15] được sử dụng để đỏnh giỏ độ nhạy của phương phỏp, ngưỡng phỏt hiờn và tớnh chớnh xỏc của kỹ thuật PCR - RFLP.
Thờm vào đú, nghiờn cứu sử dụng 30 mẫu DNA tỏch chiết từ huyết thanh của cỏc .bệnh nhõn cú HCV - RNA (+) (6 mẫu) và HIV -– DNA (+) (24 mẫu) xột nghiệm tại Phũng Vi sinh vật và cỏc mầm bệnh sinh học, Trung tõm Y Dược học Quõn sự - Học viện Quõn y được dựng đỏnh giỏ độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR - RFLP.
2.2. Vật liệu và dụng cụ nghiờn cứu 2.2.1. Cỏc sinh phẩm hoỏ chất chớnh
Tờn húa chất Hóng sản xuất
1. Hoỏ chất dựng tỏch triết DNA, phản ứng
PCR, và điện di gel agarose
Qiagen DNA amp mini kit Qiagen (Đức)
dNTPs Fermentas (Đức)
Agarose Fermentas (Đức)
Loading Dye Fermentas (Đức)
TBE Sigma (Mỹ)
Thang chuẩn ADN Fermentas (Đức)
Taq - DNA - polymerase New England (Anh)
HBV - Realtime PCR kits PG Qiagen (Trung Quốc)
2. Hoỏ chất phục vụdựng cho đọc trỡnh tự gen
Big Dye Terminator V3.1 Applied BioSystems (Mỹ)
HiDi Formamid Applied BioSystems (Mỹ)
EDTA Merck (Mỹ)
3. Húa chất cho thực hiện phản ứng RFLP (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Enzyme SspI
Fermentas (Đức)
Enzyme TasI Fermentas (Đức)
2.2.2. Cỏc mỏy và thiết bị chớnh
Tờn mỏy, thiết bị Hóng sản xuất
Tủ ấm ổn nhiệt
Mỏy PCR (GeneGenAmp PCR System 9700)
Mỏy PCR (Thermo cycler)
Mỏy Realtime - PCR LightCycler 2.0 Mỏy ly tõm (Biofuge Primo R)
Mỏy đo pH (Digital pH Meter Delta 320)_ Mỏy chụp ảnh Gel-Doc Tủ lạnh –200C, –800C. Lũ vi súng Tủ an toàn sinh học cấp II Bể ổn nhiệt Tủ lắc ấm Gyromax 737R Mỏy lắc ngang reciprocating
Mỏy quang phổ tử ngoại khả kiến Specord Mỏy phõn tớch trỡnh tự ADN ABI 3130 XL
Sanyo (Nhật Bản) Applied BioSystems Bio-rad (Phỏp) Roche (Thụy Sỹ) Haeraus (Đức) Thommas Scientitic Bio - Rad (Mỹ) Nuaire (Mỹ) Sanyo (Nhật Bản) Shelab (Mỹ) Memmert (Đức) Amerex Instrument (Đức) Jeio -– Tech (Hàn Quốc) Analytika (Đức)
Applied BioSystems
2.2.3. Trỡnh tự Ccỏc cặp mồi dựng trong nghiờn cứu
+ Cỏc primer đặc hiệu cho nhõn đoạn genegen vựng preCcore của HBV cú trỡnh tự tương ứng là:
- Cặp primer cho phản ứng PCR thứ nhất để tăng độ nhạy của phản ứng PCR (Song, le h,, Toaàn NL và CS, 2006) [88]:
HB_-pre1F6: 5’_CACCTCTGCCAATCATCTCT_3’
HB-590as_2R: 5’_CTGCGAGGCGAGGGAGTT_3’; 58975 bp
- Cỏc primer cho phản ứng PCR thứ hai (nested - nPCR) (Hannoun và
CS, 2002) [42]. HB-_2F: 5’_CAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGT_3’ HB-_2R: 5’_TTCTTCTTCTAGGGGACCTGCCTCAGTCC_3’; 51521bp HB-_2aR: 5’_TTCTTCTTCTAGGGGACCTGCCTCATCGT_3’; 51521 bp
+ Cỏc primer đặc hiệu dựng cho nhõn đoạn gen vựng S của HBV cú trỡnh tự tương ứng là:
- Cặp primer cho phản ứng PCR thứ nhất:
HB-_3F: 5’_TGCTGCTATGCCTCATCTTC_3’
HB-_3R: 5’_CAGAGACAAAAGAAAATTGG_3’; 409 bp - Cặp primer cho phản ứng PCR thứ hai (nested - n-PCR): HB-_4F: 5’_CAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCT_3’ HB-_4R: 5’_GGTATAAAGGGACTCACGATG_3’; 341 bp
2.3. Phương phỏp nghiờn cứu 2.3.1. Thiết kế nghiờn cứu
- Theo phương phỏp dịch tễ học mụ tả cắt ngang cú phõn tớch so sỏnh - Nghiờn cứu thực nghiệm Labo cú phõn tớch đối chứng
2.3.2. Sơ đồ nghiờn cứu
2.3.3. Quy trỡnh nghiờn cứu
2.3.3.1. Lấy mẫu bệnh phẩm
Mỏu tĩnh mạch được lấy vào buổi sỏng, khụng chống đụng, ly tõm tỏch huyết thanh sau đú cho vào ống Eppendorf cú nắp khoỏ, mỗi mẫu lấy 2 ống, cho ngay vào tủ -70 0C. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Genome HBV cỏc chủng hoang
dại, HBV plasmide tỏi tổ hợp Mẫu huyểt thanh của bệnh nhõn cú HBsAg dương tớnh
Thiết kế mồi và Phõn tớch lựa chọn enzyme giới hiạn phõn biệt được cỏc kiểu gen HBV bằng cho
phản ứng PCR-RFLP
Tỏch chiết, tinh sạch DNA từ cỏc mẫu huyết thanh
Thực hiện phản ứng Nested - PCR lồng Thưc hiện phản ứng PCR-RFLP trờn cỏc HBV plasmid tỏi tổ hợp Thưc hiện phản ứng PCR- RFLP trờn cỏc mẫu lõm sàng
Đỏnh giỏ sự phự hợp, độ nhạy và độ đặc hiệu phương phỏpkỹ thuật PCR - RFLP so với đọc trỡnh tự gen xỏc định kiểu gen của HBV với cỏc
2.3.3.2. Kỹ thuật tỏch và tinh sạch DNA
Tỏch chiết và tinh sạch DNA tổng số theo qui trỡnh hướng dẫn của nhà sản xuất, chỳng tụi sử dụng bộ kớt QIA amp DNA Mini Kit , Hóng QIAGEN Cộng hũa Liờn bang Đức. Qui trỡnh túm tắt như sau:
1. Cho 20àl Protease K vào tube eppendorf 1,5 ml. Sau đú cho 200àl huyết thanh mẫu vào.
2. Cho 200àl buffer AL vào mẫu sau đú lắc trộn trong 15 giõy. 3. Ủ ở nhiệt độ 56 0C trong 10 phỳt, ly tõm ngắn.
4. Cho 200àl cồn tuyệt đối vào mẫu sau đú lắc trộn 15 giõy, rồi ly tõm 15”.
5. Chuyển toàn bộ sang cột lọc và đựng trong ống đi kốm (tube QIAamp spin column). Ly tõm 8000 vũng/phỳt trong 1 phỳt, bỏ dịch lọc và giữ lại cột.
6. Cho 500àl Buffer AW1 để rửa cột. Ly tõm 8000 vũng/phỳt trong 1 phỳt sau đú bỏ dịch lọc và giữ lại cột.
7. Cho 500àl Buffer AW2. Ly tõm 14000 vũng/phỳt trong 3 phỳt sau đú bỏ dịch lọc, giữ lại cột. Tiếp tục ly tõm 14000 vũng/phỳt trong 1 phỳt.
8. Chuyển cột sang một tube eppendorf 1.5 ml vụ trựng. Sau đú thờm 200àl Buffer AE hoặc nước cất khử ion. Ủ nhiệt phũng trong 1 phỳt rồi ly tõm 8000 rpm trong 1 phỳt.
9. Thu DNA trong tube và bảo quản ở - 200C.
2.3.3.3. Phản ứng polymerase chain reaction (PCR)+ Nguyờn tắc chung của phản ứng PCR + Nguyờn tắc chung của phản ứng PCR
PCR là một kỹ thuật cho phộp nhõn nhanh một đoạn gen mong muốn lờn hàng triệu lần trong một thời gian ngắn nhờ hai cặp mồi (primer) oligonucleotit tương hợp với hai đầu 3’ ở cả 2 sợi của đoạn DNA đớch (target sequence) với sự tham gia của enzyme DNA polymerase. Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ khộp kớn nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước [7].
Bước 1: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm cỏc thành phần cần thiết cho sự sao chộp, phõn tử DNA được biến tớnh ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ núng chảy (Tm) của phõn tử, thường là ở 94OC ữ 95OC trong vũng 30 giõy đến 1 phỳt. Đõy là giai đoạn biến tớnh DNA (denaturation).
Bước 2: Nhiệt độ được hạ thấp ( thấp hơn Tm của cỏc mồi) cho phộp cỏc mồi bắt cặp với khuụn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 ữ 70o C tuỳ thuộc Tm của cỏc mồi sử dụng kộo dài từ 30 giõy ữ 60 giõy. Đõy là giai đoạn bắt mồi (annealing).
Bước 3: Nhiệt độ được tăng lờn đến 72OC giỳp cho DNA polymerase hoạt động tổng hợp tốt nhất, thời gian tuỳ thuộc vào độ dài của trỡnh tự DNA cần khuyếch đại. Thường kộo dài từ 30 giõy đến vài phỳt. Đõy là giai đoạn tổng hợp (extension).
Một chu kỳ bao gồm 3 bước trờn sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần sẽ làm tăng gấp đụi lượng mẫu của lần trước. Đõy là sự khuyếch đại theo cấp số nhõn, sau 30 chu kỳ kết qủa quả thu được sẽ là 106 lần so với ban đầu.
+ Kỹ thuật Realtime - PCR.
Kỹ thuật Realtime - PCR hay cũn gọi là PCR định lượng, là kỹ thuật được sử dụng để đồng thời khuyếch đại và định lượng một đoạn DNA đặc hiệu từ DNA của mẫu. DNA được khuyếch đại bằng phản ứng chuỗi trựng hợp và được định lượng sau mỗi chu kỳ. Phương phỏp sử dụng cỏc chất phỏt huỳnh quang được bổ sung vào trong phản ứng PCR. Những chất phỏt huỳnh quang này bao gồm thuốc nhuộm liờn kết DNA và những trỡnh tự gắn huỳnh quang liờn kết đặc hiệu với primer gọi là mẫu dũ “probe”. Sau mỗi chu kỳ thỡ số luợng DNA tăng lờn sẽ tỷ lệ thuận với tớn hiệu huỳnh quang đo được nhờ đầu đọc của cỏc mỏy Realtime - PCR. Trong nghiờn cứu này chỳng tụi sử
dụng mẫu dũ là Taqman probe cho phản ứng Realtime - PCR xỏc định nồng độ HBV - DNA cỏc mẫu nghiờn cứu [17].
+ Kỹ thuật nested - PCR (PCR lồng)
Kỹ thuật nNested - PCR nhõn đoạn genegen vựng preCore của HBV được thực hiện tương tự như ở cỏc labo sinh học phõn tử khỏc trờn thế giới [7]. hai lần liờn tiếp, sản phẩm của phản ứng PCR thứ nhất là mẫu (template) cho phản ứng PCR thứ hai. Đoạn gen được tổng hợp lần thứ hai ngắn hơn (nằm trong) so với đoạn gen đó tổng hợp ở phản ứng PCR thứ nhất. Đõy gọi là phỏn ứng PCR lồng hay nested - PCR.
Bảng 2.1. Tớnh toỏn cỏc tThành phần hỗn hợp cho phản ứng PCR
Phản ứng PCR vũng 1thứ nhất Phản ứng PCR vũng 2thứ hai (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nước khử ion 16.,3 Nước khử ion 35.,8
PCR bufer (10X) 2.,5 1x PCR bufer (10X) 5 1x dNTP mix (5 mM) 2 0.,2 mM dNTP mix (5 mM) 4 0.,2 mM Mồi PrimerHB-
pre16Fhoặc HB-3F ( 0.,5 0.,5 àM Primer Mồi HB-2F hoặc HB- 1 0.,5 àM PrimerMồi1R HB-
590as hoặc HB-3R (10pmol/l)
0.,5 0.,5 àM Primer Mồi HB-2R và HB-2aR
hoặc HB-
1 0.,5 àM Taq Polymerase
(5U/àl) 0.,2 1 unit (5U/àl)Taq Polymerase 0.,2 1 unit
DNA template 3 DNA template 3
Tổng số 25 Tổng số 50
Chu trỡnh luõn nhiệt cho phản ứng PCR lồng (nested - PCR)
- Sau chu kỳ đầu tiờn biến tớnh DNA ở nhiệt độ 95 0C trong 5 phỳt - Thực hiện chu trỡnh gồm 40 chu kỳ, mỗi chu kỳ 3 bước như sau: Bước 1: Duỗi xoắn DNA cưỡng bức ở 940 C trong 30 giõy.
PHẦN NÀY LẦN TRƯỚC TễI ĐÃ SỬA MỘT LẦN RỒI. ANH KIỂM TRA LẠI. TễI SỬA CHO ANH NẾU KHễNG ĐỒNG í PHẢI GIẢI TRèNH LẠI!!!!!
Bước 2: Hạ nhiệt độ xuống 580 C trong 40 giõy để gắn mồi vào gen đớch. Bước 3: Nõng nhiệt độ lờn 720 C trong 45 giõy để Taq DNA - polymerase xỳc tỏc phản ứng nối dài primer theo nguyờn lý bổ xung với gen đớch của HBV để tổng hợp nờn đoạn DNA mới giống hệt đoạn DNA của gen đớch ban đầu.
- Cuối cựng là bước kộo dài duy trỡ trong 7 phỳt.
- Điện di sản phẩm PCR trờn Agarose 1,5%, nhuộm Ethidium bromide và đọc trờn mỏy đọc Gel - Doc. Lưu giữ hỡnh ảnh kết quả thử nghiệm.
2.3.3.4. Thực hiện phản ứng RFLP xỏc định kiểu gen của HBV
Sử dụng enzyme giới hạn để cắt sản phẩm PCR thứ 2. Kết quả thu được dựng để phõn tớch kiểu genegen của HBV.
Phản ứng RFLP dựng enzyme lựa chọn phự hợp phõn biệt cỏc kiểu gen của HBV (sẽ được mụ tả kỹ ở phần kết quả). Qui trỡnh thực hiện phản ứng theo hướng dẫn của nhà sản xuất để đảm bảo hiệu suất tối đa và đạt kết quả tốt nhất. Sản phẩm PCR sau khi thực hiện phản ứng RFLP được đĐiện di trờn thạch agarose 1,5%, phõn tớch và xỏc định kiểu gen HBV dựa vào tớnh đa hỡnh của cỏc đoạn giới hạn.
Phản ứng RFLP dựng enzyme TasI, theo qui trỡnh của nhà sản xuất và mụ tả của một số cụng trỡnh cụng bố gần đõy (Hannoun và cs, 2002) [3942]. Để tăng hiệu suất và nhanh chỳng tụi sử dụng enzyme giới hạn FastDigest TasI [640]:
Hỗn hợp phản ứng RFLP dựng FastDigest TasI. - FastDigest buffer B: 2μl
- FastDigest Enzyme: 1μl
- Sản phẩm PCR product: 15μl
Ủ ở 650C lắc 650 vũng/phỳt trong 15 phỳt. Điện di trờn thạch agarose 1,5% kiểm tra, phõn tớch và xỏc định kiểu gen HBV dựa vào tớnh đa hỡnh của cỏc đoạn giới hạn.
2.3.3.5. Phương phỏp đọc trỡnh tự DNA (Sequencing)
Đọc trỡnh tự chuỗi (DNA sequencing) là phương phỏp xỏc định trỡnh tự sắp xếp cỏc nucleotid trong phõn tử DNA [6], [8], [17]. Nguyờn lý của phương phỏp này là: tổng hợp cỏc mạch đơn DNA mới cú độ dài ngắn hơn mạch khuụn; nhờ kỹ thuật đỏnh dấu và ngắt đoạn trong quỏ trỡnh tổng hợp mạch DNA, thu được cỏc mạch đơn hơn kộm nhau một base; từ đú cú được sơ đồ trật tự mạch DNA khuụn mẫu. So sỏnh trật tự mạch của mẫu thớ nghiệm với trỡnh tự DNA chuẩn ta biết được cỏc kiểu gen khỏc nhau cũng như phõn tớch cỏc đột biến cú thể xảy ra. Đọc trỡnh tự gen HBV vựng preCore và S gen được tiến hành theo phương phỏp của Sanger trờn mỏy đọc trỡnh tự tự động ABI 3130 XL, phõn tớch kết quả bằng phần mềm sinh tin học chuyờn dụng BioEdit 7.01..
Sơ đồ qui trỡnh:
Thứ tự cỏc bước thực hiện bao gồm:
Chạy PCR gắn BigDye
Tinh sạch BigDye (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Biến tớnh HiDi
Giải trỡnhĐọc trỡnh tự genegen
* Chạy phản ứng PCR gắn BigDye:
Thành phần phản ứng:
+ BigDye Buffer 5X: 1 μl + BigDye terminator: 2 μl
+ PrimerMồi Primer HB-2RF hoặc HB-2R hoặc HB-4F hoặc HB-4R: 0,5 μl
+ DNA template: 0,4 μg + Nước cất khử ion: vừa đủ 10 μl.