người Việt Nam
Việt Nam là một trong những nước cú tỷ lệ nhiễm HBV cao nhất thế giới, ước tớnh khoảng từ 15 - 26% quần thể người khỏe mạnh cú HBsAg dương tớnh. Tỷ lệ cú dấu ấn HBV tăng dần trờn bệnh nhõn viờm gan cấp, mạn
tớnh và cú thể tới 80 - 90% trờn nhúm bệnh nhõn xơ gan và ung thư ganUTTBG [6223]. Mặc dự vậy, cho đến hiện nay vẫn chưa cú một nghiờn cứu nào tiến hành khảo sỏt một cỏch hệ thống về sự phõn bố kiểu gen của HBV ở nước ta. Một số nghiờn cứu trước đõy của cỏc tỏc giả nước ngoài ở Thụy Điển cho thấy trờn số lượng bệnh nhõn hạn chế gốc Việt kiểu gen B và C là chủ yếu và một số cụng bố khỏc thờm cỏc kiểu gen A, D và tỏi tổ hợp hoặc đồng/bội nhiễm cỏc kiểu gen B và C với cỏc kiểu gen A, D, E và G [8840]; [xx]. Gần đõy, Trần T. Tuấn Huy và cs (2004) đó tiến hành nghiờn cứu trờn 115 bệnh nhõn là người miền Nam Việt Nam bao gồm 39 bệnh nhõn viờm gan cấp và 76 bệnh nhõn viờm gan mạn tớnh. Cỏc tỏc giả thấy rằng, ở nhúm viờm gan cấp chủ yếu là kiểu gen B chiếm 74,3%. Trong khi đú trờn nhúm viờm gan mạn tớnh kiểu gen C là chủ yếu chiếm 81% [4347]. Một nghiờn cứu khỏc ở Huế của Trần Xuõn Chương trờn 80 bệnh nhõn viờm gan virus B cấp cho thấy cú 56 trường hợp mang kiểu gen B, 22 trường hợp mang kiểu gan C, 1 trường hợp mang kiểu gen A và 1 trường hợp mang kiểu gen hỗn hợp B và C [5]. Ở khu vực mMiền Bắc, nghiờn cứu của Bựi Xuõn Trường trờn cỏc nhúm bệnh nhõn khỏc nhau cũng cho kết quả tương tự là kiểu gen B chiếm tỷ lệ 71,9%, kiểu gen C là 29,1%, trong đú kiểu gen B phổ biến hơn hẳn kiểu gen C ở nhúm người mang virus và nhúm bệnh nhõn viờm gan mạn [18]. Người nhiễm HBV kiểu gen C cú nguy cơ bị cỏc bệnh gan mạn tớnh núi chung cao hơn so với người nhiễm HBV kiểu gen B [18] . Một nghiờn cứu khỏc gần đõy trờn 375 bệnh nhõn khỏ đầy đủ cỏc nhúm bệnh nhõn như nhúm người mang HBV khụng triệu chứng, viờm gan B cấp, viờm gan B mạn, xơ gan và UTTBG liờn quan HBV cho thấy cỏc kiểu genegen của HBV phổ biến được tỡm thấy là kiểu genegen A, B, C và D. Đi sõu phõn tớch cho thấy kiểu genegen A thường gặp hơn ở nhúm người mang HBV khụng triệu chứng so với nhúm cú triệu chứng và ở nhúm khụng ung thư so với nhúm UTTBG.
Ngược lại, kiểu genegen C tỡm thấy nhiều ở nhúm UTTBG hơn là ở nhúm khụng UTTBG. Ngoài ra, ở nhúm ung thư kiểu genegen C cũng được tỡm thấy nhiều hơn kiểu genegen B và A [Song Le H, Toan NL và cs, 200688]. Như vậy, với những nghiờn cứu gần đõy nờu trờn chỳng ta cú thể thấy rằng HBV lưu hành ở Việt Nam khụng chỉ cú cỏc kiểu genegen B và C như những thụng bỏo trước đõy mà cũn cú cỏc kiểu genegen khỏc đó biếtMột số tỏc giả cũng nhận thấy cú sự tỏi tổ hợp giữa hai kiểu gen B và C ở nước ta [40]. Như vậy, chỳng ta cú thể thấy rằng HBV lưu hành ở Việt Nam chủ yếu là mang cỏc kiểu gen B và C [1], [9], [18]. Đõy là một hạn chế mà trong thời gian gần chỳng ta cần phải đỏnh giỏ để gúp phần tiờn lượng, lựa chọn điều trị bệnh nhõn.
1.3. Cỏc phương phỏp xỏc định kiểu gen HBV 1.3.1. Phương phỏp đọc trỡnh tự và phõn tớch loài
Đõy là phương phỏp chớnh xỏc nhất cho phộp xỏc định kiểu gen của HBV dựa trờn sự khuyếch đại cỏc đoạn gen của HBV và đọc trỡnh tự toàn bộ bộ gen của HBV sau đú sử dụng phõn tớch loài cũng như sử dụng cụng cụ Blast và viral genotyping để so sỏnh với cỏc kiểu gen đó được cụng bố trờn GenBank.
Phõn tớch loài là phương phỏp đỏnh giỏ và sự liờn quan về tiến húa của cỏc trỡnh tự với loài khỏc và trỡnh tự chuẩn. Sự xỏc thực của phương phỏp dựng cõy phõn tớch loài và phõn tớch thống kờ phải được thực hiện bằng phõn tớch dữ liệu của khoảng 1000 cỏc trỡnh tự. Đọc trỡnh tự và phõn tớch loài cũng được thực hiện đối với từng gen riờng biệt, đặc biệt là gen S.
Phuơng phỏp đọc trỡnh tự và phõn tớch loài đó được Okamoto và CS sử dụng năm 1988 khi phõn tớch 18 trỡnh tự bộ gen của HBV đó phỏt hiện hiện ra 4 kiểu gen đầu tiờn và được ký hiệu từ A - D. Năm 1994, Norder và CS khi phõn tớch 6 trỡnh tự bộ gen HBV phỏt hiện thờm hai kiểu gen mới là E và F.
Cũng bằng phương phỏp đọc trỡnh tự và phõn tớch loài năm 2000, Stuyver phỏt hiện thờm kiểu gen G. Arauz-Ruiz và cộng sự CS (2002) đó phỏt hiện thờm kiểu gen H và đề nghị cú 8 kiểu gen từ A - H của HBV được phỏt hiện cho đến nay. Chớnh vỡ vậy phương phỏp đọc trỡnh tự và phõn tớch loài được coi là phương phỏp chuẩn khi xỏc định một kiểu gen của HBV cũng như xỏc chẩn một phương phỏp khỏc [232].
Phương phỏp đọc trỡnh tự và phõn tớch loài cú ưu điểm là phương phỏp chớnh xỏc nhất cho phộp xỏc định được sự khỏc biệt của cỏc trỡnh tự Nu., rất phự hợp cho xỏc định cỏc kiểu gen mới hay xỏc định sự tỏi tổ hợp của cỏc kiểu gen khỏc nhau. Tuy nhiờn phương phỏp này đũi hỏi phải cú cỏc trang thiết bị đồng bộ hiện đại, khi tiến hành tốn khỏ nhiều thời gian, chi phớ cao cũng như nhõn viờn được đào tạo chuyờn sõu. Bờn cạnh đú phương phỏp này cú hạn chế là khụng xỏc định được sự pha trộnđồng/bội nhiễm của nhiều kiểu gen khỏc nhau, do đú độ nhạy sẽ khụng cao. Kỹ thuật PCR cloning cũng chỉ cú thể xỏc định được kiểu gen trội và chiếm ưu thế hơn và phải sàng lọc nhiều clones, mất nhiều thời gian và chi phớ rất khỏ tốn kộm khụng thể dựng cho chẩn đoỏn thường qui được.
1.3.2. Phương phỏp Multiplex - PCR và PCR với cỏc cặp mồi đặc hiệu hiệu
PCR là một trong những kỹ thuật phổ biến nhất hiện nay được sử dụng trong nghiờn cứu và đó được ứng dụng rộng rói trong chẩn đoỏn. Tuy nhiờn khi phải chẩn đoỏn nhiều tỏc nhõn thỡ cựng một lỳc phải thực hiện nhiều phản ứng PCR với cỏc cặp mồi đặc hiệu, do đú dẫn đến chi phớ cho một xột nghiệm cao. Để tăng cường hiệu quả chẩn đoỏn và vượt qua những thiếu sút của PCR, Chamberlin và cộng sự CS là những người đầu tiờn mụ tả và phỏt triển kỹ thuật multiplex - PCR vào năm 1988, tiếp đến là Ballabio và cộng sự CS (1990) cũng phỏt triển kỹ thuật này cho việc xỏc định nhiều căn nguyờn gõy
bệnh cựng một lỳc. Trong kỹ thuật multiplex - PCR, nhiều gen đớch được khuyếch đại cựng một lỳc bằng nhiều cặp mồi trong cựng một phản ứng. Kỹ thuật multiplex - PCR tiết kiệm thời gian, cụng sức và đúng vai trũ rất quan trọng trong chẩn đoỏn phõn tử bao gồm phõn tớch đột biến gen, tớnh đa hỡnh DNA, phõn tớch định lượng, phõn tớch đột biếntớnh và phỏt hiện RNA. Trong lĩnh vực bệnh truyền nhiễm kỹ thuật này rất cú giỏ trị cao trong chẩn đoỏn xỏc định virus, vi khuẩn, nấm và ký sinh trựng. Ngoài ra kỹ thuật này cũn được sử dụng trong phõn tớch cỏc sinh vật chuyển gen, phõn tớch microsatelite và xỏc định kiểu gen. Naito và cộng sựCS (2001) đó phỏt triển kỹ thuật multiplex - PCR xỏc định 6 kiểu gen từ A - F của HBV nhưng lại chia thành 2 hỗn hợp phản ứng là hỗn hợp A cho cỏc kiểu gen A, B và C; hỗn hợp B cho cỏc kiểu gen D, E và F [441]. Kirschberg và cộng sựCS (2003) đó ứng dụng kỹ thuật này cho phộp phõn biệt 6 kiểu gen từ A - F nhưng chỉ thực hiện trong cựng một phản ứng với độ nhạy là từ 103 - 105 copies/ml [7268]. Năm 2006, Jinsong Chen và cộng sựCS [47] đó phỏt triển thờm kỹ thuật này cho phộp xỏc định được cả cỏc dưới kiểu gen B1, B2 và C1, C2. Ở nước ta cỏc tỏc giả như Đụng Thị Hoài An, Trần Xuõn Chươngmột số tỏc giả cũng đó ứng dụng kỹ thuật này xỏc định kiểu gen HBV ở cỏc nhúm bệnh nhõn khỏc nhau [5].
Phương phỏp multiplex - PCR và PCR với cỏc cặp mồi đặc hiệu cú ưu điểm là tiết kiệm thời gian, chi phớ thấp và dễ thực hiện. Cho đến nay cũng đó cú một số thụng bỏo phương phỏp này cú thể phỏt hiện được sự đồng bội nhiễm của nhiều kiểu gen khỏc nhau. Tuy nhiờn với multiplex - PCR việc tối ưu húa phản ứng cũng mất nhiều cụng đoạn, độ nhạy khụng cao chỉ đạt 83% so với đọc trỡnh tự gen (Ren Zhang và CS, 2007) [74] và khi HBV đột biến thỡ phương phỏp này khụng thể xỏc định được.
1.3.3. Phương phỏp sử dụng kỹ thuật lai đầu dũ (INNO - LiPA)
Phương phỏp xỏc định kiểu gen của HBV bằng kỹ thuật lai đầu dũ trờn thanh INNO - LiPA được phỏt triển bởi Innogenegentics N.V., Ghent, Belgium (Bỉ). Cỏc mẫu HBV - DNA của bệnh nhõn được khuyếch đại bằng cỏc cặp mồi bổ sung với vựng cú tớnh bảo tồn cao trong vựng preS1 của genome HBV. Sau đú sản phẩm PCR được lai với cỏc vạch dũ đặc hiệu của từng kiểu gen mà đó được gắn trờn thanh INNO - LiPA. Trong nghiờn cứu của Teles và cộng sựCS thỡ chỉ cú kiểu gen A, D và F được xỏc định. Carla Osiowy và cộng sựCS (2003) cũng sử dụng kỹ thuật này cho xỏc định cỏc 7 kiểu gen của HBV trờn 188 mẫu đó phỏt hiện được 7 kiểu gen bệnh phẩm và sự phự hợp giữa phương phỏp lai đầu dũ vàso với đọc trỡnh tự gen và phõn tớch loài là 81%. Ngoài ra, Pphương phỏp lai đầu dũ cũn xỏc định được 19 trường hợp nhiễm kiểu gen hỗn hợp mà phương phỏp giải trỡnh tự phõn tớch loài khụng xỏc định được. Cú 4 mẫu cho kết qủa trỏi ngược nhau giữa 2 phương phỏp và 5 mẫu cho kết quả khụng rừ ràng khi sử dụng phương phỏp lai đầu dũ [3028]. Ở nước ta phương phỏp lai đầu dũ cũng được tỏc giả Phạm Hựng Võn ứng dụng cho xỏc định kiểu gen của HCV [19].
Phương phỏp lai đầu dũ cú ưu điểm là đơn giản dễ thực hiện và đó phỏt triển thành bộ kit thương mại. Tuy nhiờn giỏ thành cũn caođắt và khi HBV đột biến sẽ ảnh hưởng tới quỏ trỡnh gắn và kết quả lai.
1.3.4. Phương phỏp Realtime - PCR kết hợp với phõn tớch Tm
Phương phỏp realtime - PCR và realtime - PCR kết hợp phõn tớch đường cong núng chảy (melting curve) dựa trờn nguyờn lý đếm thời gian thực (realtime). Chỳng ta biết rằng cú sự khỏc nhau rừ rệt về nhiệt độ núng chảy của cỏc sản phẩm PCR khỏc nhau vỡ vậy thời điểm xuất hiện nhiệt độ núng chảy tối ưu của cỏc sản phẩm PCR khỏc nhau là khụng giống nhau. Đõy là nguyờn lý chớnh của phương phỏp này. Năm 2004, S. Payungporn và cộng sự
CS ứng dụng cho xỏc định kiểu gen của HBV trờn 52 mẫu lõm sàng phỏt hiện được 11 mẫu là kiểu B và 41 mẫu là kiểu gen C. Khi so sỏnh với phương phỏp PCR - RFLP thỡ cú 3 mẫu là kiểu gen A, 11 mẫu kiểu gen B và 37 mẫu kiểu gen C. Kết quả đọc trỡnh tự và phõn tớch loài cho thấy chỉ cú 1 mẫu là kiểu gen A, 14 mẫu kiểu gen B và 37 mẫu kiểu gen C. Như vậy độ chớnh xỏc của phương phỏp này theo tỏc giả là 92,31% [851].
1.3.5. Phương phỏp dot blot ngược dũng (FT - RDB)
Phương phỏp dot blot ngược dũng là kỹ thuật lai phõn tử dựa trờn việc thiết kế cỏc probe cho từng kiểu gen dựa vào việc phõn tớch trỡnh tự cỏc bộ gen thu được từ GenBank sau đú gắn lờn một màng lai chuyờn biệt. Tiếp theo là tỡm nhiệt độ lai tối ưu bằng việc lai với sản phẩm PCR nhõn đoạn gen của tất cả cỏc kiểu gen HBV đó được miễn dịch húa. Cuối cựng kiểm tra trờn HBV - DNA cỏc plasmide tỏi tổ hợp của cỏc kiểu gen HBV khỏc nhau. Phương phỏp này đó được Ren Zhang và cộng sự CS (2007) phỏt triển xỏc định kiểu gen HBV trờn 101 mẫu lõm sàng cho kết quả phự hợp với đọc trỡnh tự là 96% (97/101) [784].
Phương phỏp này cú ưu điểm là tiến hành nhanh, khụng cần đũi hỏi cỏc trang thiết bị hiện đại và cho phộp xỏc định khỏ chớnh xỏc cỏc kiểu gen đó biết. Tuy nhiờn, để thực hiện được phương phỏp này đũi hỏi nhõn viờn phải cú hiểu biết nhất định về thiết kế cỏc probe, việc tối ưu húa xỏc định nhiệt độ lai và khụng xỏc định được cỏc kiểu gen mới cũng như khi cú đột biến xảy ra.
1.3.6. Phương phỏp sử dụng oligonucleotide microassay
Kỹ thuật DNA microassay là kỹ thuật lai cỏc đoạn DNA mạch đơn ngắn đó được đỏnh dấu huỳnh quang, với tập hợp (mảng - assay) cỏc đoạn oligonucleotide đó biết trỡnh tự được gắn ở cỏc vị trớ xỏc định trờn genegenchip, để kiểm tra và phỏt hiện một trỡnh tự nào đú.
Kỹ thuật DNA miroassay dựa trờn cơ sở cỏc đoạn DNA mạch đơn cần nghiờn cứu cú thể bắt cặp với cỏc mẫu dũ cú trỡnh tự tương đồng nhau theo nguyờn lý Shargaff (A liờn kết với T, G liờn kết với C) tạo nờn cỏc phõn tử lai.
Dựa vào kỹ thuật phỏt hiện huỳnh quang, với cỏc mỏy quột scanner chuyờn dụng cú thể xỏc định được vị trớ cỏc phõn tử lai, từ đú xỏc định được trỡnh tự của cỏc đoạn DNA mạch đơn, hoặc trỡnh tự gen.
Phương phỏp này đó được Yajun Song và cộng sự CS (2005) ứng dụng xỏc định kiểu gen của HBV trờn 96 mẫu lõm sàng cho kết quả phự hợp 100 % so với đọc trỡnh tự [9286].
Phương phỏp này cú ưu điểm là cho phộp xỏc định chớnh xỏc cỏc kiểu gen của HBV đó biết dựa trờn cỏc probe đặc hiệu cho từng kiểu gen. Tuy nhiờn phương phỏp này đũi hỏi phải cú cỏc trang thiết bị hiện đại và đội ngũ nhõn viờn được đào tạo chuyờn sõu về kỹ thuật cũng như chi phớ cho một xột nghiệm rất cao và khụng xỏc định được cỏc kiểu gen mới.
1.3.7. Phương phỏp huyết thanh học (ELISA)
Để phõn biệt cỏc kiểu gen khỏc nhau, xột nghiệm huyết thanh học với cỏc khỏng thể đơn clone đó được phỏt triển [22]. Trong nghiờn cứu của Usuda và cộng sự CS (1999) một panel cỏc khỏng thể đơn clone của vựng preS2 và vựng S đó được phỏt triển cho phộp phõn biệt cỏc kiểu gen HBV từ A - F. Cỏc khỏng thể đơn clone đú cũng cú thể được sử dụng trong nghiờn cứu sàng lọc dịch tễ lớn. Xỏc định kiểu gen bằng phương phỏp huyết thanh học được khẳng định bằng phõn tớch trỡnh tự Nu. của gen S với panel của 68 chủng HBV đó chỉ ra 100% phự hợp giữa hai phương phỏp.
Phương phỏp này cú ưu điểm là dễ thực hiện, giỏ thành khụng cao do đú rất hữu ớch cho cỏc nghiờn cứu dịch tễ với số lượng mẫu lớn. Tuy nhiờn nú cũng cú hạn chế là khụng phõn biệt được cỏc kiểu gen mới và khi HBV đột
biến hay sự tỏi tổ hợp với cỏc kiểu gen khỏc thỡ phương phỏp này khụng phỏt hiện được. Cũng như độ đặc hiệu khụng cao nờn cú thể xẩy ra dương tớnh giả.
1.3.8. Phương phỏp PCR - RFLP (PCR - restriction fragment length polymorphism) polymorphism)
Phương phỏp PCR - RFLP dựa trờn sự khuyếch đại một đoạn gen bằng phản ứng PCR, sau đú tiến hành phản ứng RFLP bằng việc sử dụng cỏc enzyme giới hạn, cuối cựng điện di phõn tớch tớnh đa hỡnh dựa vào kớch thước của cỏc đoạn giới hạn. Sự lựa chọn cỏc enzyme giới hạn bằng việc dựa vào phõn tớch trỡnh tự của cỏc kiểu gen khỏc nhau đó được cụng bố trờn GenBank. Phương phỏp này đó được Mizokami và cộng sự CS (1999) phỏt triển cho phộp phõn biệt cỏc kiểu gen của HBV bằng bốn enzyme là NciI, AlwI, EarI và
NlaIV [2281]. Lindh và cộng sựCS (1998) cũng ứng dụng kỹ thuật này nhưng
chỉ sử dụng hai emzyme là AvaII và DpnII cho phộp xỏc định cỏc kiểu gen từ A - F trờn 99 mẫu lõm sàng thỡ 95 mẫu xỏc định được kiểu gen trong đú kiểu gen A: 23, kiểu gen B: 20, kiểu gen C: 20, kiểu gen D: 22 và kiểu gen E: 3, kiểu gen F là 5. Khi so sỏnh với đọc trỡnh tự và phõn tớch loài thỡ chỉ cú 1