phẩm PCR. rừ nột và ổn định là nhiệt độ gắn mồi 580 C, thời gian gắn mồi 45 giõy, thực hiện 40 chu kỳ.
4.1.2. Lựa chọn enzyme giới hạn cho phản ứng RFLP xỏc định kiểu gen của HBV của HBV
Cho đến nay việc ứng dụng phương phỏp PCR - RFLP xỏc định kiểu gen của HBV đó được nhiều tỏc giả cụng bố. Lindh và cộng sự CS (1998) đó sử dụng hai enzyme là AvaII và DpnII cho phản ứng RFLP xỏc định kiểu gen của HBV từ A - F; kết quả so với đọc trỡnh tự gen thỡ chỉ cú duy nhất một trường hợp là khụng phự hợp [5761]. Một tỏc giả khỏc là Mizokami và cộng sự CS (1999) cũng sử dụng phương phỏp này xỏc định kiểu gen của HBV với 4 enzyme là NciI, AlwI, EarI và NlaIV. Tuy nhiờn cỏc tỏc giả này thực hiện trờn vựng S và nhiều enzyme giới hạn nờn qui trỡnh thực hiện khỏ phức tạp.
Phương phỏp PCR - RFLP của Hannoun và cộng sự CS cụng bố năm 2002 đó được nhiều tỏc giả nghiờn cứu ỏp dụng xỏc định kiểu gen của HBV. Cỏc tỏc giả đó sử dụng enzyme TasI cho phản ứng RFLP. Enzyme này cắt sản phẩm PCR thu được theo trỡnh tự AATT và khi điện di cú thể phõn biệt cỏc kiểu gen dựa vào kớch thước của cỏc đoạn cắt. Tuy nhiờn, khi phõn tớch trỡnh tự gen đối với cỏc chủng HBV ở Việt Nam đó cụng bố thấy rằng cỏc chủng HBV kiểu gen B và C cú cựng vị trớ cắt của enzyne TasI, dẫn đến khụng phõn biệt được cỏc chủng HBV cú kiểu gen B và C ở Việt Nam và thực nghiệm cũng chứng minh điều đú (hỡnh 3.54). Hơn nữa HBV kiểu gen B và C là hai kiểu gen phổ biến ở nước ta [1], [18]. Phõn tớch bộ gen của cỏc chủng HBV ở Việt Nam cho thấy cú sự khỏc biệt khỏ lớn về gen của virus so với cỏc chủng HBV chủng hoang dại khỏc trờn thế giới. Sở dĩ cú hiện tượng này chỳng tụi cho rằng do quỏ trỡnh tiến húa lõu đời của virus ỏ cỏc khu vực địa lớ khỏc nhau sẽ cú những thay đổi trong bộ gen của chỳng, Đặc biệt ở Việt Nam nơi cú tỷ lệ nhiễm HBV rất cao từ 10 - 26% vỡ vậy đồng/bội nhiễm hơn một chủng trờn một bệnh nhõn khả năng xẩy ra là cú thể. Hậu quả của đồng/bội nhiễm cỏc kiểu gen khỏc nhau HBV đó được nhiều tỏc giả chứng minh cú tỏc động nhất định đến bệnh cảnh lõm sàng bệnh lý gan [Hannoun và CS (2002),42 Toan NL, Song Le H và CS. 2006], [88].. Mặt khỏc, Đđõy cũng là cơ sở hỡnh thành nờn cỏc chủng HBV tỏi tổ hợp cỏc kiểu gen khỏc nhau và cú thể thành biến chủng mới đó được ghi nhận gần đõy ở Việt Nam [Tran và CS, 200889].
Vỡ vậy, cần nghiờn cứu sử dụng thờm một enzyme khỏc để cú thể phõn biệt được tất cả cỏc kiểu gen B và C của HBV khụng những ở Việt Nam mà trờn thế giới. Tập hợp 70 chủng HBV hoang dại được cụng bố trờn ngõn hàng gen (Genbank) và cỏc chủng HBV nguồn gốc từ bệnh nhõn người Việt Nam mang kiểu gen B và C, sử dụng chương trỡnh GeneGen Runner và BioEdit phõn tớch chỳng tụi đó rỳt ra được chỉ cú một vị trớ duy nhất trờn vựng
preCore (nu.1865-2386, EcoRI=1, X02763, HBV serotype adw2, kiểu gen A) của HBV enzyme SspI cắt với trỡnh tự AATATT (nu. 2250-2254, EcoRI=1, X02763) thuộc về tất cả cỏc kiểu gen A và B của HBV. Vỡ vậy, khi thực hiện phản ứng RFLP với enzyme SspI đối với kiểu gen A hoặc B của HBV sẽ bị cắt thành hai đoạn DNA cú kớch thước là 388 bp và 137 bp, ngược lại đối với cỏc kiểu gen cũn lại (từ C đến G) thỡ trờn đoạn này trỡnh tự AATATT chuyển thành AGTATT nờn SspI khụng thể cắt mảnh DNA trờn được. kKết quả là chỉ cú một mảnh DNA duy nhất đỳng bằng sản phẩm PCR thứ hai (515bp) (Hỡnh 3.65. và 3.76). Chớnh vỡ vậy, sử dụng hai enzyme SspI và TasI cho phộp phõn biệt được cỏc kiểu gen từ A đến G của HBV đặc biệt cỏc chủng HBV mang kiểu gen B và C ở Việt Nam. Đõy là một thành cụng trong việc ứng dụng và phỏt triển kỹ thuật ỏp dụng trong điều kiện thực tế Việt Nam khi xỏc định kiểu gen của HBV.
4.2. Độ đặc hiệu và sự phự hợp của kỹ thuật PCR - RFLP xỏc định kiểu gen của HBV so với đọc trỡnh tự gen.