Phản ứng nested - PCR nhõn đoạn gene gen preCore của HBV để xỏc định kiểu gen của HBV được thực hiện hai lần liờn tiếp, sản phẩm của phản ứng PCR thứ nhất là mẫu (template) cho phản ứng PCR thứ hai. Mục đớch của sử dụng phản ứng nested - PCR là để tăng khả năng phỏt hiện virus trong mẫu bệnh phẩm và loại bỏ cỏc sản phẩm khụng đặc hiệu. Hơn nữa, đối với việc phỏt hiện virus thỡ với một phản ứng PCR thường rất khú phỏt hiện được ngoại trừ nồng độ virus cao trong mẫu bệnh phẩm. Chớnh vỡ vậy trong nghiờn cứu này chỉ mụ tả quỏ trỡnh xỏc định điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR thứ hai sử dụng đa mồi nhõn đoạn gen vựng preCore của HBV. Tuy nhiờn, chỳng tụi vẫn tớnh toỏn cỏc thành phần cho phản ứng PCR thứ nhất theo qui trỡnh của phản ứng PCR chung. Mẫu nghiờn cứu chỳng tụi sử dụng là cỏc plasmide mang bộ gen HBV tỏi tổ hợp của kiểu gen A, B, C và D.
Bảng 3.1. Thành phần hỗn hợp của phản ứng PCR thứ nhất
TT Thành phần Nồng độ Thể tớch (àl)
1 Nước đó khử ion DNA/RNAase free 15,3
2 Dung dịch đệm (PCR buffer 10X) 1X 2,5
4 dNTPs (2,5 mM) 0,4 mM 4
5 Primer HB-pre16 -1F (10pmoles/àl) 0,5 àM 0,5 6 Primer HB -1R-590as (10pmoles/àl) 0,5 àM 0,5
7 Taq DNA Polymerase (5u/àl) 1unit 0,2
8 DNA HBV plasmide (50 ng/àl) 100 ng 2
Tổng số 25
Chu trỡnh luõn nhiệt được xỏc định là: 950C x 5 phỳt
(960C x 30 giõy → 580C x 45 giõy → 720C x 45 phỳt) x 35 chu kỳ. 720C x 7 phỳt
duy trỡ ở 40C
Sau khi thu được sản phẩm PCR thứ nhất chỳng tụi sử dụng sản phẩm PCR này làm mẫu (template) để tối ưu phản ứng PCR thứ hai (nested - PCR). Để tỡm nhiệt độ gắn mồi phự hợp cho phản ứng PCR, chỳng tụi thực hiện chương trỡnh gradient nhiệt trờn mỏy iCycler. Dựa vào nhiệt độ núng chảy trung bỡnh của mỗi cặp mồi, nhiệt độ gắn mồi được chọn từ 510C đến 620C với cỏc điểm đặt nhiệt độ tăng dần (bảng 3.2). Thành phần phản ứng PCR hoàn toàn giống nhau cả DNA - template và tương ứng với cỏc điểm nhiệt độ đó xỏc định ở trờn mỏy chạy chương trỡnh gradient nhiệt độ. Thực
hiện phản ứng PCR đồng thời trong cựng một điều kiện chỉ khỏc nhau về nhiệt độ gắn mồi.
Kết quả cho thấy sản phẩm PCR (băng DNA) rừ nột nhất ở dóy cột số 5 (mũi tờn) tương ứng với nhiệt độ 58,10 C (Hhỡnh 3.1).
Hỡnh 3.1. Hỡnh điện di sản phẩm PCR thu được sau chạy Gradient tỡm nhiệt độ gắn mồi nhõn đoạn gen preCore của HBV.
Cột M: thang chuẩn DNA (Marker 100 bp); Cột từ 1 đến 8 theo thứ tự tương ứng với nhiệt độ là 510C; 51,90C; 53,30C; 55,20C, 58,10C, 60,10C, 61,40C và
620C.
Bảng 3.2. Kết quả tỡm nhiệt độ gắn mồi thớch hợp cho phản ứng PCR thứ hai
Thời gian Đoạn Ggen đớch T1 510C T2 51,90C T3 53,30C T4 55,20C T5 58,10C T6 60,10C T7 61,40C T8 620 C Vựng Pprecore + + + ++ +++ ++ + +
(+) Kết quả điện di hiện băng DNA cú kớch thước nhỏ và mờ;
(++) Kết quả điện di hiện băng DNA cú kớch thước lớn nhưng mờ hoặc rừ nhưng nhỏ;
(+++) Kết quả điện di hiện băng DNA cú kớch thước lớn và rừ.
Như vậy, với dải gradient nhiệt độ từ 510C đến 620C, chỳng tụi nhận thấy nhiệt độ gắn mồi tốt nhất tương ứng với mốc nhiệt độ là 58,10C, được làm trũn số là 58 C0 . Cỏc phản ứng được chỳng tụi lặp lại 3 lần trong cựng một điều kiện đều cho kết quả tương tự.