Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu xác định 4 tổ hợp gen TEL/AML1, BCR/ABL, MLL/AF4, E2A/PBX1 trong bạch cầu cấp dòng lymphô (BCCDL). Nghiên cứu được tiến hành trên bệnh nhân BCCDL tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM từ ngày 01 tháng 03 năm 2010 đến 31 tháng 7 năm 2011.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học XÁC ĐỊNH TỔ HỢP GEN TEL/AML1, BCR/ABL, MLL/AF4, E2A/PBX1 TRONG BẠCH CẦU CẤP DỊNG LYMPHƠ TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC TP HỒ CHÍ MINH Phan Nguyễn Thanh Vân* Nguyễn Tấn Bỉnh* Nguyễn Thị Kim Định* Phan Thị Xinh** TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Xác định tổ hợp gen TEL/AML1, BCR/ABL, MLL/AF4, E2A/PBX1 bạch cầu cấp dòng lymphơ (BCCDL) Phương pháp nghiên cứu: Mơ tả cắt ngang Sử dụng phản ứng khuếch đại gen phiên mã ngược với mồi thiết kế phát tất kiểu tổ hợp gen Nghiên cứu tiến hành bệnh nhân BCCDL Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM từ ngày 01 tháng 03 năm 2010 đến 31 tháng năm 2011 Kết quả: 17 BN biểu TEL/AML1(9,5%), 16 BN biểu BCR/ABL (8,9%), BN biểu MLL/AF4 (2,8%), BN biểu E2A/PBX1 (4,5%), số 179 BN BCCDL Kết luận: Kỹ thuật RT-PCR đơn giản, có độ nhạy cao nên triển khai sở chuyên khoa Huyết học Việt Nam để giúp phát nhanh chuyển vị NST thường gặp khơng BCCDL mà bệnh lý máu ác tính khác Từ khóa: Bạch cầu cấp dòng lymphơ (BCCDL), Phản ứng khuếch đại gen phiên mã ngược (RT-PCR: Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) ABSTRACT DETECTION OF FUSION GENES TEL/AML1, BCR/ABL, MLL/AF4, E2A/PBX1 IN ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA PATIENTS AT BLOOD TRANSFUSION HEMATOLOGY HOSPITAL HO CHI MINH CITY Phan Nguyen Thanh Van, Nguyen Tan Binh, Nguyen Thi Kim Dinh, Phan Thi Xinh * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 493 - 497 Objective: To detect fusion genes TEL/AML1, BCR/ABL, MLL/AF4, E2A/PBX1 in Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) patients Method: Case series - descriptive research Using RT-PCR (reverse transcriptase-polymerase chain reaction) with primer sets that can amplify all possible transcripts of each fusion gene From March 01, 2010 to July 31, 2011, we analysed Acute Lymphoblastic Leukemia patients at Blood Transfusion Hematology Hospital Results: 17 patients expressing TEL/AML1(9.5%), 16 patients expressing BCR/ABL (8.9%), patients expressing MLL/AF4 (2.8%), patients expressing E2A/PBX1 (4.5%) among 179 newly diagnosed patients with ALL Conclusion: RT-PCR is simple and highly sensitive technique that should apply to detect the frequent chromosome translocations not only in ALL but also in other hematologic malignancies in hematology centers in * Bệnh Viện Truyền Máu Huyết Học Thành Phố Hồ Chí Minh ** Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS BS Phan Nguyễn Thanh Vân Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học ĐT: 0919 691 770 Email: 493 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Vietnam Keywords: Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL), Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RTPCR) đốn xác định bệnh bạch cầu cấp dòng lympho, ĐẶT VẤN ĐỀ dựa vào huyết đồ, tủy đồ dấu ấn miễn dịch tế BCCDL rối loạn ác tính tế bào bào đầu dòng lymphơ B T, đặc trưng tăng Phương pháp sinh tích tụ tế bào non tủy xương gây Tồn RNA ly trích cách sử suy giảm dòng tế bào máu bình thường dụng Sepazol-I (Nacalai Tesque Inc., Nhật Bản) Cũng giống bệnh máu ác tính khác, theo qui trình kỹ thuật công ty cung cấp Sau khảo sát bất thường NST gen thời ly trích RNA, cDNA tổng hợp điểm chẩn đoán quan trọng cho phân nhóm cách sử dụng kít iScript cDNA synthesis (Công tiên lượng, giúp lựa chọn phác đồ điều trị thích ty Biorad, Mỹ), tn thủ qui trình kỹ thuật hợp dấu ấn để theo dõi tồn lưu tế bào ác (5) cơng ty tính trình điều trị BCCDL Một số chuyển vị NST tạo tổ hợp gen đặc trưng bệnh BCCDL t(9;22) tạo tổ hợp gen BCR/ABL; t(1;19), t(4;11), t(12;21) tạo tổ hợp gen E2A/PBX1, MLL/AF4 TEL/AML1 tương ứng Từ đầu năm 2010 đến nay, Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP HCM sử dụng phương pháp RT-PCR để khảo sát tổ hợp gen thường gặp TEL/AML1, BCR/ABL, MLL/AF4, E2A/PBX1 BCCDL lúc chẩn đoán Với phương pháp này, kết xác định vòng tuần góp phần phân nhóm tiên lượng vào ngày thứ phác đồ điều trị, giúp lựa chọn hướng điều trị phù hợp cho bệnh nhân ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế nghiên cứu Mô tả loạt ca Đối tượng Nghiên cứu tiến hành 179 bệnh nhân BCCDL Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM từ ngày 01 tháng 03 năm 2010 đến 31 tháng năm 2011 Bệnh nhân chẩn Thành phần phản ứng PCR gồm có μL cDNA trộn với 0,1 μL (0,5 U) iTaq Polymerase (Biorad), μL (10 pmol) cặp mồi xuôi ngược 20 μL hỗn hợp Để khuếch đại tổ hợp gen TEL/AML1, BCR/ABL, MLL/AF4, E2A/PBX1, cặp mồi cho tổ hợp gen sử dụng Riêng tổ hợp gen cần khảo sát qua hai giai đoạn phản ứng PCR lần thứ hai sử dụng μL sản phẩm phản ứng PCR lần thứ làm mạch khuôn Nhiệt độ bắt cặp thời gian phản ứng thay đổi tùy theo loại tổ hợp gen, cặp mồi, tùy theo trường hợp cụ thể Phản ứng PCR thực cách sử dụng máy luân nhiệt iCycler (Công ty Biorad) Sản phẩm phản ứng PCR điện di thạch 2% chứa 0,5 μg/mL ethidium bromide 0,5 x TBE, quan sát hệ thống Gel Doc EQ (Công ty Biorad) Kết dương tính biểu kích thước băng tương ứng cặp mồi mơ tả bảng 1(7) Kết xử lý phần mềm Excell Medicalc Bảng 1: Danh sách sản phẩm tương ứng tổ hợp gen BCCDL STT Tên mồi 7700-F Trình tự nucleotide 5’ GAT GCT GAC CAA CTC GTG TGT G 3’ 7700-R 5’ TGG CCA CAA AAT CAT ACA GTG C 3’ 494 Tên gen kích thước sản phẩm Major BCR/ABL (7700) Type b2a2: 212 bp Type b3a2: 278 bp Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 STT Tên mồi MB-A 1stF Trình tự nucleotide 5' CAA GGC TAC GGA GAG GC 3' MB-A 1stR 5' ATG GTA CCA GGA GTG TTT CTC 3' MB-A 2ndF 5' GGA GCT GCA GAT GCT GAC C 3' MB-A 2ndR 5' TTC CTT GGA GTT CCA ACG AGC 3' 10 11 mB-A 2ndF mB-A 2ndR TEL-C AML1-D AF4-D 5' CAG TGC CAT AAG CGG CAC C 3' 5' TTC CTT GGA GTT CCA ACG AGC 3' 5' AAG CCC ATC AAC CTC TCT CAT C 3' 5' TGG AAG GCG GCG TGA AGC 3' 5' CGT TCC TTG CTG AGA ATT TG 3' 12 MLL-E5 5' AAG CCC GTC GAG GAA AAG 3' 13 14 E2A-A PBX1-B 5' CAC CAG CCT CAT GCA CAA C 3' 5' TCG CAG GAG ATT CAT CAC G 3' KẾT QUẢ Từ 01/03/2010 đến 31/07/2011, 179 bệnh nhân BCCDL chọn vào nhóm nghiên cứu, để xác định tổ hợp gen nêu Tuổi trung vị tuổi, giá trị bách phân thứ 25 (25%) giá trị bách phân thứ 75 (75%) 15,5 Trong đó, tuổi trung vị giới nam 6, giới nữ Sự phân bố tuổi thể bảng Bảng Sự phân phối nhóm bệnh BCCDL theo tuổi Nhóm tuổi Số lượng Tỉ lệ% Từ đến tuổi 47 26,3% Từ đến 10 tuổi 57 31,8% Từ 10 đến 15 tuổi 30 16,8% Từ 15 tuổi trở lên 45 25,1% Tổng số 179 100,0% Tỉ lệ nam (55,9%) cao nữ (44,1%) Chẩn đốn tủy đồ gồm nhóm chính: L1 (2,2%) L2 (97,8%); đó, phân bố dòng tế bào theo dấu ấn miễn dịch tế bào tập trung dòng lymphơ B (81,6%), bao gồm thể BCCDL Precursor B, Pro B, common B B (Bảng 3) Bảng 3: Sự phân phối nhóm bệnh BCCDL theo chẩn đoán dấu ấn miễn dịch tế bào Dấu ấn miễn dịch tế bào Số lượng Nghiên cứu Y học Tên gen kích thước sản phẩm Major BCR/ABL Type b2a2: 592 bp Type b3a2: 667 bp Major BCR/ABL Type b2a2: 154 bp Type b3a2: 229 bp Minor BCR/ABL 198 bp TEL/AML1 TEL exon 5/ AML1 exon 3: 298 bp 259 bp MLL/AF4 Type exon 8/ exon 7: 270 bp Type exon 8/ exon 4: 439 bp (hiếm gặp) Type exon 9/ exon 5: 468 bp Type exon 9/ exon 4: 513 bp (hiếm gặp) Type exon 10/ exon 6: 513 bp (hiếm gặp) Type exon 10/ exon 5: 600 bp Type exon 10/ exon 4: 645 bp E2A/PBX1 E2A exon 13/ PBX1 exon 2: 372 bp Dấu ấn miễn dịch tế bào Số lượng Tỉ lệ% Precursor B 5,0% Pro B 3,4% Common B 4,5% B 123 68,7% T 33 18,4% Tổng số 179 100,0% Kết xác định gen mô tả bảng Trong đó, nhóm tiên lượng tốt (TEL/AML1) chiếm tỉ lệ 9,5%, nhóm lại chiếm tỉ lệ cao 90,5% Bảng 4: Kết tổ hợp gen BCCDL Loại gen Số lượng Tỉ lệ% TEL/AML1 17 9,5% BCR/ABL 16 8,9% MLL/AF4 2,8% E2A/PBX1 4,5% Không phát bất thường gen 133 74,3% Tổng số 179 100,0% Hình thái học tế bào khơng có liên quan với tổ hợp gen (Bảng 5), dấu ấn miễn dịch tế bào liên quan với tổ hợp gen có ý nghĩa thống kê với P = 0,0248 (Bảng 6) Tỉ lệ% Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 495 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Bảng 5: Phân phối nhóm bệnh BCCDL theo chẩn đoán tủy đồ tổ hợp gen (P = 0,3164) Chẩn đoán tủy đồ Tổng số Loại gen L1 L2 TEL/AML1 17 17 (9,5%) BCR/ABL 16 16 (8,9%) MLL/AF4 5 (2,8%) E2A/PBX1 (4,5%) Không phát bất thường gen 130 133 (74,3%) Tổng số (2,2%) 175 (97,8%) 179 Bảng 6: Phân phối nhóm bệnh BCCDL theo chẩn đốn dấu ấn miễn dịch tế bào tổ hợp gen (P = 0,0248) Dấu ấn miễn dịch tế bào Loại gen Dòng B Dòng T Tổng số TEL/AML1 17 17 (9,5%) BCR/ABL 15 16 (8,9%) MLL/AF4 5 (2,8%) E2A/PBX1 8 (4,5%) Không phát bất thường gen 101 32 133 (74,3%) Tổng số 146 (81,6%) 33 (18,4%) 179 BÀN LUẬN Chẩn đốn tủy đồ gồm nhóm chính: L1 (2,2%) L2 (97,8%); khác với nghiên cứu tác giả C.H.Pui(4) có tỉ lệ L1 cao Có khác biệt phân loại hình thái học theo FAB thường dựa vào chủ quan người đọc tủy đồ khơng có tiêu chuẩn rõ ràng để phân biệt L1 L2 Song phân biệt L1 L2 khơng có ý nghĩa nhiều việc tiên lượng điều trị Với L3, tế bào gần giống tế bào lymphôm Burkitt thường tế bào B trưởng thành nghiên cứu chúng tơi loại bỏ khơng đưa vào nhóm nghiên cứu Trong nghiên cứu chúng tơi, khơng có mối liên quan hình thái tế bào đột biến NST, điều phù hợp với kết tác giả C.H.Pui cộng sự(4) 496 Trong đó, phân bố dòng tế bào theo dấu ấn miễn dịch tế bào tập trung dòng lymphơ B (81,6%), bao gồm thể BCCDL Precursor B, Pro B, common B B (Bảng 3) Dấu ấn miễn dịch tế bào yếu tố tiên lượng độc lập tiêu chuẩn để phân nhóm nguy Tỷ lệ bệnh nhân có dấu ấn miễn dịch tế bào dòng B chiếm tỷ lệ cao tỷ lệ tương tự so với kết tác giả C.H.Pui(4) Khi khảo sát mối tương quan dấu ấn miễn dịch tế bào bất thường gen đặc trưng, chúng tơi nhận thấy khác biệt có ý nghĩa thống kê với P = 0,0248 (Bảng 6) Điều phù hợp với y văn đột biến khác gặp tế bào dòng lymphơ T chưa khảo sát nên nhầm lẫn nhóm có NST bình thường Đối với BCCDL, bất thường NST lúc chẩn đốn có ý nghĩa tiên lượng rõ ràng Có kiểu chuyển vị NST thường gặp BCCDL t(12;21), t(9;22), t(4;11), t(1;19) tạo kiểu tổ hợp gen TEL/AML1, BCR/ABL, MLL/AF9 E2A/PBX1 tương ứng Trong chuyển vị NST trên, t(12;21) thuộc nhóm tiên lượng tốt kiểu chuyển vị NST lại thuộc nhóm tiên lượng khơng tốt Bốn kiểu bất thường chiếm từ 30% đến 40% BCCDL trẻ em, chúng tơi sử dụng kỹ thuật RT-PCR để khảo sát tổ hợp gen tất bệnh nhân chẩn đoán Từ 01/03/2010 đến 31/07/2011, khảo sát 179 bệnh nhân (BN) BCCDL chẩn đốn kỹ thuật RT-PCR, chúng tơi phát 17 BN biểu TEL/AML1 (9,5%), 16 BN biểu BCR/ABL (8,9%), BN biểu MLL/AF4 (2,8%), BN biểu E2A/PBX1 (4,5%), số 179 BN BCCDL Tỉ lệ tổ hợp gen E2A/PBX1, MLL/AF4, BCR/ABL tương đương với nghiên cứu khác Tuy nhiên, tỉ lệ TEL/AML1 9,5% thấp so với nghiên cứu khác(1,2,3,6) Trong nghiên cứu này, với kỹ thuật RTPCR, phát 46 bệnh nhân Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 có mang kiểu tổ hợp gen thường gặp trên, chiếm tỷ lệ 25,7% giúp phân nhóm tiên lượng bệnh nhân BCCDL Căn vào kết xác định gen mơ tả bảng 4, nhóm tiên lượng tốt (TEL/AML1) chiếm tỉ lệ 9,5%, nhóm lại chiếm tỉ lệ cao 90,5% Tuy nhiên, nhóm khơng thể xếp loại nhóm tiên lượng khơng tốt chưa loại trừ trường hợp đa bội nhóm Kỹ thuật RT-PCR có nhiều ưu điểm việc khảo sát tổ hợp gen thường gặp BCCDL, nhạy hơn, phát chuyển vị NST thể ẩn t(12;21), mà khảo sát nhiều tổ hợp gen thường gặp lúc chẩn đoán thời gian ngắn (trong vòng 24 giờ) giúp phân nhóm tiên lượng kịp thời vào ngày thứ trình điều trị Ngồi ra, RT-PCR thực lúc nhiều mẫu cần lượng nhỏ tế bào ung thư đủ để khuếch đại Tuy nhiên, với 90,5% số bệnh nhân lại mang bất thường NST khác đa bội, thiểu bội, đoạn, thêm đoạn chuyển vị NST khác gặp phải cần kết NST đồ Mỗi kỹ thuật có ưu điểm riêng mà kỹ thuật khác thay Kỹ thuật RT-PCR sử dụng để khảo sát riêng lẻ mà phải bổ sung với kỹ thuật NST đồ Đây nghiên cứu với cỡ mẫu tương đối lớn phân tích đầy đủ với tổ hợp gen E2A/PBX1, MLL/AF4, BCR/ABL, TEL/AML1 người Việt Nam Chúng chuẩn hóa thành cơng sử dụng kỹ thuật cách thường quy khảo sát bất thường NST gen cho bệnh nhân BCCDL Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP Hồ Chí Minh Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học Nghiên cứu Y học KẾT LUẬN Nhóm bệnh BCCDL có nhóm tiên lượng tốt (TEL/AML1) chiếm tỉ lệ 9,5% Mặc dù với số mẫu khảo sát chưa nhiều, khảo sát liên hệ hình thái học, dấu ấn miễn dịch đột biến NST, dấu ấn miễn dịch đột biến NST có liên hệ chặt chẽ chẩn đoán nhóm bệnh bạch cầu cấp dòng lympho Kỹ thuật RT-PCR phát tổ hợp gen thường gặp BCCDL cách nhanh chóng, có độ nhạy độ đặc hiệu cao, giúp phân nhóm tiên lượng xác góp phần nâng cao chất lượng hiệu điều trị Kỹ thuật đơn giản nên dễ dàng triển khai phòng xét nghiệm sinh học phân tử chuyên ngành Huyết học TÀI LIỆU THAM KHẢO Ariffin H, Chen SP, Wong HL, et al (2003) Validation of a multiplex RT-PCR assay for screening significant oncogene fusion transcripts in children with acute lymphoblastic leukaemia Singapore Med J, 44 (10): 517-536 Elia L, Mancini M, Moleti L, et al (2003) A multiplex reverse transcriptase-polymerase chain reaction strategy for the diagnostic molecular screening of chimeric genes: a clinical evaluation on 170 patients with acute lymphoblastic leukemia Haematologica, 88 (3): 275-283 Liang DC, Shih LY, Yang CP, et al (2002) Multiplex RT-PCR assay for the detection of major fusion transcripts in Taiwanese children with B-lineage acute lymphoblastic leukemia Med Pediatr Oncol, 39 (1): 12-18 Pui CH, Robison LL, Look AT (2008) Acute lymphoblastic leukaemia Lancet, 371 (9617): 1030-1072 Raimondi CS (2006) Cytogenetics of acute leukemias In: PUI (Eds.) Childhood Leukemias, 2nd edition: 235-237 Cambrigde University Press, UK Scurto P, Hsu RM, Kane JR, et al (1998) A multiplex RT-PCR assay for the detection of chimeric transcripts encoded by the risk-stratifying translocations of pediatric acute lymphoblastic leukemia Leukemia, 12 (12): 1994-2005 van Dongen JJ, Macintyre EA, Gabert JA, et al (1999) Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease Report of the BIOMED-1 Concerted Action: investigation of minimal residual disease in acute leukemia Leukemia, 13 (12): 1901-1928 497 ... tạo tổ hợp gen đặc trưng bệnh BCCDL t(9;22) tạo tổ hợp gen BCR/ABL; t(1;19), t (4; 11), t(12;21) tạo tổ hợp gen E2A/PBX1, MLL/AF4 TEL/AML1 tương ứng Từ đầu năm 2010 đến nay, Bệnh viện Truyền máu Huyết. .. với tổ hợp gen (Bảng 5), dấu ấn miễn dịch tế bào liên quan với tổ hợp gen có ý nghĩa thống kê với P = 0,0 248 (Bảng 6) Tỉ lệ% Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 49 5 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh. .. cứu khác(1,2,3,6) Trong nghiên cứu này, với kỹ thuật RTPCR, phát 46 bệnh nhân Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 có mang kiểu tổ hợp gen thường gặp trên,