1. Trang chủ
  2. » Giáo Dục - Đào Tạo

Bước đầu khảo sát đột biến gen TP53 và IGHV trên bệnh bạch cầu mạn dòng lympho tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học

7 20 0

Đang tải... (xem toàn văn)

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Định dạng
Số trang 7
Dung lượng 574,84 KB

Nội dung

Bạch cầu mạn dòng lympho là một bệnh lý ác tính được đặc trưng bởi sự tăng sinh và tích tụ đơn dòng của các tế bào lympho B trưởng thành đồng biểu hiện CD5 và CD23. Bài viết bước đầu khảo sát đột biến gen TP53 và IGHV trên bệnh bạch cầu mạn dòng lympho tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học.

TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 520 - THÁNG 11 - SỐ ĐẶC BIỆT - 2022 BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN TP53 VÀ IGHV TRÊN BỆNH BẠCH CẦU MẠN DÒNG LYMPHO TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC Nguyễn Quốc Dũng1, Cao Văn Động1, Cao Sỹ Luân1, Nguyễn Tấn Bỉnh1, Phan Thị Xinh1 TÓM TẮT 51 Mục tiêu: Bước đầu khảo sát đột biến gen TP53 tình trạng đột biến gen IGHV người bệnh (NB) BCMDL chẩn đoán Bệnh viện Truyền máu Huyết học (BVTMHM) Phương pháp nghiên cứu: Mô tả loạt ca Chúng tơi sử dụng kỹ thuật PCR, giải trình tự (GTT) Sanger phân tích trình tự gen TP53 IGHV phần mềm SeqScape IMGT để xác định đột biến gen TP53 tình trạng đột biến gen IGHV BN chẩn đoán BCMDL BVTMHH Kết quả: Từ tháng 12/2021 đến tháng 6/2022, thu thập mẫu máu ngoại vi NB BCMDL để tiến hành giải trình tự chuỗi DNA xác định đột biến gen TP53, nhiên chưa ghi nhận trường hợp có đột biến gen TP53 Tiếp theo, chúng tơi tiến hành khảo sát tình trạng đột biến gen IGHV NB có trường hợp khơng có đột biến gen IGHV (≥ 98% tương đồng với trình tự dịng mầm) trường hợp có đột biến gen IGHV (< 98% tương đồng với trình tự dịng mầm) Kết luận: Với kết xác định đột biến gen TP53 tình trạng đột biến gen IGHV Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học Chịu trách nhiệm chính: Phan Thị Xinh Điện thoại: 0932.728.115 Email: bsphanthixinh92@gmail.com Ngày nhận bài: 01/8/2022 Ngày phản biện khoa học: 01/8/2022 Ngày duyệt bài: 15/9/2022 giúp bác sĩ phân nhóm tiên lượng xác lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp cho NB BCMDL Từ khóa: Bạch cầu mạn dịng lympho, đột biến gen TP53, tình trạng đột biến gen IGHV SUMMARY DETECTION OF TP53 GENE MUTATION AND IGHV GENE MUTATION STATUS IN CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKEMIA AT BLOOD TRANSFUSION HEMATOLOGY HOSPITAL Objective: We initially investigated TP53 gene mutation and IGHV gene mutation status in patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL) diagnosed at the Blood Transfusion and Hematology Hospital (BTH) Method: A case series We used PCR techniques, Sanger sequencing and analyse TP53 and IGHV gene sequences by SeqScape and IMGT software to identify TP53 gene mutations and IGHV gene mutation status in patients diagnosed with CLL at BTH Results: From December 2021 to June 2022, peripheral blood samples from cases of CLL were collected and performed DNA sequencing to identify mutations in the TP53 gene, but no cases of TP53 gene mutations were found Next, we determined the mutation status of IGHV gene on these patients, there were cases without IGHV gene mutation (≥ 98% identity to the germline sequence) and cases with IGHV 423 KỶ YẾU CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU gene mutation (< 98% identity to the germline sequence) Conclusions: Thus, the TP53 gene mutation and the IGHV gene mutation status are useful markers for prognostic classification more accurately and guide for an appropriate treatment decision for each CLL patient Keywords: Chronic lymphocytic leukemia, TP53 gene mutation, IGHV gene mutation status I ĐẶT VẤN ĐỀ Bạch cầu mạn dòng lympho (BCMDL) bệnh lý ác tính đặc trưng tăng sinh tích tụ đơn dịng tế bào lympho B trưởng thành đồng biểu CD5 CD23 [6] Đây thể bệnh không đồng diễn tiến, đáp ứng điều trị thời gian sống tồn (OS: Overal survival) Tình trạng bất thường di truyền tế bào phân tử sở để giúp phân nhóm tiên lượng xác BCMDL Trong đó, đột biến gen TP53 tình trạng đột biến gen IGHV nhiều nhóm nghiên cứu giới chứng minh yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới tiên lượng kết điều trị bệnh BCMDL [7] Gen TP53 nằm NST 17p13.1, có kích thước 22 kb, bao gồm 11 exon 10 intron Gen mã hoá cho phân tử protein p53 tham gia vào nhiều đường truyền tín hiệu quan trọng tế bào xem gen ức chế khối u quan trọng người Trong bệnh BCMDL, đột biến TP53 tìm thấy khoảng 10% người bệnh (NB) chưa điều trị 25-50% NB tiến triển kháng trị [1] NB BCMDL bị bất hoạt gen TP53 nhánh ngắn nhiễm sắc thể (NST) số 17 [del(17p)] hay đột biến gen TP53 có thời gian sống không tiến triển (PFS: Progression-free survival) thời gian sống toàn (OS: Overal survival) 424 so với NB khơng có bất thường gen TP53 [4] Các đột biến gen TP53 đa dạng gồm thêm nucleotide (insertion), bớt nucleotide (deletion), đột biến vùng ghép nối (splice Site), đột biến sai nghĩa (missense), đột biến vô nghĩa (nonsense) đột biến xảy tồn vùng mã hóa từ exon đến exon 11 gen Gen IGH mã hóa cho trình tự chuỗi nặng phân tử Immunoglobulin, nằm NST 14q32.3 với chiều dài khoảng 1250 kb cấu tạo đoạn V, D, J C Tình trạng đột biến vùng VH gen IGH (IGHV) dấu ấn tiên lượng quan trọng BCMDL, ổn định theo thời gian bệnh tiến triển; độc lập với dấu ấn lâm sàng thông số sinh học khác [8] Dựa vào tình trạng đột biến gen IGHV, xác định NB BCMDL thuộc nhóm “Unmutated CLL” (UCLL, ≥ 98% tương đồng với trình tự dịng mầm) hay “Mutated CLL” (M-CLL, < 98% tương đồng với trình tự dịng mầm) [9] Việc xác định tình trạng đột biến gen IGHV giúp bác sỹ lâm sàng phân nhóm tiên lượng xác xác định phác đồ điều trị phù hợp NB BCMDL Trong nghiên cứu này, sử dụng kỹ thuật PCR, giải trình tự (GTT) Sanger phân tích trình tự gen TP53 IGHV để xác định đột biến gen TP53 tình trạng đột biến gen IGHV BN chẩn đoán BCMDL Bệnh viện Truyền máu Huyết học (BVTMHH) Kết thu cung cấp thông tin hai dấu ấn phân tử có ý nghĩa quan trọng, giúp việc phân nhóm tiên lượng định điều trị cho NB BCMDL bệnh viện xác hiệu TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 520 - THÁNG 11 - SỐ ĐẶC BIỆT - 2022 II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu: Nghiên cứu khảo sát NB chẩn đoán BCMDL BVTMHH từ tháng 12/2021 đến tháng 6/2022 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu mô tả hàng loạt ca 2.2.2 Phương pháp tiến hành Tách chiết genomic DNA: Tiến hành lấy ml máu ngoại vi, cho vào ống chống đông EDTA DNA gen (gDNA) tách chiết kit ReliaPrep TM Blood gDNA Miniprep System (Promega, Mỹ) theo hướng dẫn sử dụng nhà sản xuất Phản ứng PCR khuếch đại gen TP53: Mỗi tube PCR tích 15 l chứa thành phần gồm PCR buffer, dNTP (250 M cho loại), mồi xuôi ngược (0,5 M cho loại), 1,25U TaKaRa TaqTM HotStart Polymerase (Takara, Nhật Bản) 50-100 ng gDNA Phản ứng thực máy luân nhiệt Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler (Life Technologies, Hoa Kỳ) với chương trình luân nhiệt bao gồm 980C phút; theo sau 42 chu kỳ 980C 10 giây, 600C 20 giây 720C 1,5 phút, sau kết thúc giai đoạn kéo dài sản phẩm 720C phút Sản phẩm PCR điện di thạch agarose 1,5 %, nhuộm ethidium bromide quan sát hệ thống chụp ảnh Geldoc-ItTM (UVP, Mỹ) Bảng 1: Kích thước sản phẩm PCR khuếch đại exon gen TP53 tương ứng theo cặp mồi Kích thước sản phẩm PCR STT Cặp mồi sử dụng Vùng khuếch đại (bp) TP53-g2F1/g4R1 Exon 2-4 1076 TP53-g5F2/g6R1 Exon 5-6 696 TP53-g7F1/g9R1 Exon 7-9 1175 TP53-g10F1/g11R3 Exon 10-11 1470 Phản ứng Multiplex-PCR khuếch đại điện di thạch agarose 2%, nhuộm vùng gen IGHV: Mỗi tube PCR tích ethidium bromide quan sát hệ thống 20 µl chứa thành phần gồm PCR buffer, chụp ảnh Geldoc-ItTM (UVP, Mỹ), kích dNTP (200 µM), hỗn hợp mồi xuôi VH(L) thước sản phẩm PCR mục tiêu khoảng 520 mix mồi ngược JH (0,2 µM cho bp loại), 0,75U TaKaRa TaqTM HotStart Tinh sản phẩm PCR: Sử dụng Polymerase (Takara, Nhật Bản) 50-100 ng ExoSAP-IT™ PCR Product Cleanup gDNA Phản ứng thực máy Reagent (Thermo Fisher Scientific) để tinh luân nhiệt Applied Biosystems 2720 Thermal sản phẩm PCR sản phẩm PCR chứa Cycler (Life Technologies, Hoa Kỳ) với trình tự mục tiêu khơng có băng phụ Mỗi chương trình luân nhiệt bao gồm 980C tube PCR chứa µl sản phẩm PCR µl phút; theo sau 38 chu kỳ 980C ExoSap Phản ứng thực máy 10 giây, 680C 1,5 phút kết thúc Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler giai đoạn kéo dài sản phẩm 720C (Life Technologies, Hoa Kỳ) với chương phút Sản phẩm PCR sau phát trình luân nhiệt bao gồm 370C 15 phút 425 KỶ YẾU CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU 800C 15 phút Trong trường hợp có băng phụ, sản phẩm PCR cắt gel tinh kit GFX PCR DNA and Gel Band Purification (Thermo Fisher Scientific) Giải trình tự chuỗi DNA: Sản phẩm PCR sau tinh thực phản ứng cycle sequencing với BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, Mỹ) theo hai chiều xi ngược (sử dụng mồi PCR) Trình tự DNA đọc máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với POP-7 polymer capillary 50 cm (Applied Biosystems, Mỹ) Kết GTT phân tích phần mềm SeqScape (Life Technologies, Hoa Kỳ) để xác định đột biến gen TP53 Cịn gen IGHV sau phân tích phần mềm SeqScape phân tích tiếp phần mềm IMGT để xác định tình trạng đột biến gen IGHV III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Đặc điểm NB BCMDL nghiên cứu Từ tháng 12/2021 đến tháng 6/2022 có NB chẩn đốn BCMDL Trong đó, nam giới chiếm 71% nữ giới chiếm 29%; độ tuổi trung bình NB nghiên cứu 67,14 tuổi với tuổi thấp 54 tuổi cao 73 tuổi 3.2 Kết khuếch đại gen TP53 IGHV Hình 1: Kết điện di sản phẩm PCR gen TP53 IGHV Chúng thực phản ứng PCR TP53 sử dụng cặp mồi TP53-g10F1/g11R3 khuếch đại thành công gen TP53 vùng Giếng số 9, 10: sản phẩm PCR khuếch đại gen IGHV mẫu toàn NB gen IGHV sử dụng hỗn hợp mồi VH(L) mix nghiên cứu (Hình 1) – JH Trong đó, L: 100 bp ladder; 1, 3, 5, 7, Giếng số 1, 2: sản phẩm PCR khuếch đại 9: mẫu NB; 2, 4, 6, 8, 10: chứng âm gen TP53 sử dụng cặp mồi TP53-g2F1/g4R1 3.3 Kết xác định đột biến gen Giếng số 3, 4: sản phẩm PCR khuếch đại gen TP53 bệnh BCMDL TP53 sử dụng cặp mồi TP53-g5F2/g6R1 Phân tích liệu GTT phần mềm Giếng số 5, 6: sản phẩm PCR khuếch đại gen SeqScape mẫu NB cho thấy tất TP53 sử dụng cặp mồi TP53-g7F1/g9R1 trường hợp không phát đột biến Giếng số 7, 8: sản phẩm PCR khuếch đại gen gen TP53 426 TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 520 - THÁNG 11 - SỐ ĐẶC BIỆT - 2022 Hình 2: Kết điện di sản phẩm PCR GTT gen TP53 (NB CLL-03) 3.4 Kết xác định tình trạng đột biến gen IGHV bệnh BCMDL Sau thực phản ứng PCR khuếch đại thành công vùng gen IGHV, tiến hành GTT phân tích trình tự phần mềm SeqScape IMGT để xác định kiểu tái xếp (TSX) gen tình trạng đột biến gen IGHV NB (Hình 3) Hình 3: Kết GTT phân tích phần mềm IMGT (NB CLL-03) 427 KỶ YẾU CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU (A) Kết GTT phân tích trình tự NB CLL-03 sử dụng mồi JH xác định kiểu gen IGHV3-48 với tỷ lệ tương đồng 97,22% (B) Kết GTT phân tích trình tự NB CLL-03 sử dụng mồi VH3(L) cho kết kiểu gen IGHV3-48 với tỷ lệ tương đồng 97,22% Dựa vào điểm “cut off” 98% tương đồng với trình tự dịng mầm gen IGHV, xác định số lượng NB U-CLL M-CLL chiếm tỉ lệ NB (43%) NB (57%) IV BÀN LUẬN BCMDL bệnh có diễn tiến khơng đồng nhất, khó dự đoán tiến triển bệnh, đặc biệt NB chẩn đoán giai đoạn sớm Hệ thống phân loại giai đoạn bệnh dựa đặc điểm lâm sàng (Rai Binet) tiêu chuẩn vàng tiên lượng BCMDL 40 năm qua Tuy nhiên, hai hệ thống khơng thể dự đốn diễn tiến bệnh Do đó, việc phát dấu ấn tiên lượng BCMDL có ý nghĩa quan trọng, có đột biến gen TP53 tình trạng đột biến gen IGHV [8] Để GTT DNA cần sử dụng polymerase có độ trung thực cao nên nghiên cứu này, tất phản ứng PCR thực với TaKaRa TaqTM HotStart Polymerase (Takara, Nhật Bản), polymerase có độ trung thực cao Trong mẫu NB khảo sát kết điện di sản phẩm PCR cho thấy hầu hết mẫu có băng có kích thước phù hợp với kích thước trình tự mục tiêu Sản phẩm PCR GTT kỹ thuật GTT Sanger hệ thống ABI 3130 Genetic Analyzer cho kết trình tự chuỗi DNA 428 phù hợp với vùng gen khuếch đại Gen TP53 có vai trị quan trọng kiểm soát phân chia chết theo chương trình tế bào (apoptosis) Phần lớn gen ức chế khối u thường bị bất hoạt đột biến đoạn cắt cụt (truncating) nên không biểu protein Các đột biến phổ biến đặc trưng TP53 đột biến sai nghĩa (missense) vùng liên kết DNA Một nghiên cứu BCMDL cho thấy del (17p) thường kèm với đột biến TP53 hai loại đột biến xảy độc lập với tần suất khác tùy vào nhóm NB cụ thể [5] Trong nghiên cứu này, chưa phát NB BCMDL mang đột biến TP53 Theo kết nghiên cứu Thorsten Zenz cộng năm 2010 cho thấy có 28 NB BCMDL mang đột biến TP53 tổng số 328 NB tham gia khảo sát, chiếm 8,5% [10] Do đó, tần suất đột biến TP53 thấp NB chưa điều trị số lượng mẫu khảo sát nghiên cứu chưa đủ lớn nên chưa phát NB mang đột biến TP53 Vì vậy, để phát NB BCMDL mang đột biến TP53 cần tiến hành khảo sát cỡ mẫu lớn (từ 35 mẫu trở lên) Khi NB BCMDL xác định khơng có bất thường TP53 cần khảo sát tình trạng đột biến gen IGHV để xác định NB thuộc nhóm U-CLL hay M-CLL Các nghiên cứu NB U-CLL có tiên lượng xấu so với NB M-CLL, cụ thể trường hợp U-CLL có thời gian từ lúc chẩn đoán đến khởi động điều trị (TTFT: time-tofirst treatment) OS ngắn so với MCLL Đặc biệt, NB M-CLL hóa trị liệu cho thấy có PFS OS dài so với NB UCLL [2] Trong nghiên cứa chúng tôi, NB xác định U-CLL (43%); NB TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 520 - THÁNG 11 - SỐ ĐẶC BIỆT - 2022 lại xác định M-CLL (57%) Mặc dù số lượng mẫu khảo sát hạn chế tỷ lệ cho thấy tương đồng với số nghiên cứu khác giới, chẳng hạn nghiên cứu Hamblin TJ cộng 84 NB cho thấy tỉ lệ NB U-CLL M-CLL chiếm tỉ lệ lần lược 45% 55% [3] V KẾT LUẬN Kết nghiên cứu cho thấy tỷ lệ NB khơng có đột biến gen IGHV (U-CLL) 43% có đột biến gen IGHV (M-CLL) 57%; chưa phát NB mang đột biến TP53 Như vậy, thành công bước đầu việc khảo sát đột biến gen TP53 tình trạng đột biến gen IGHV giúp phân nhóm tiên lượng lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp cho NB BCMDL TÀI LIỆU THAM KHẢO David Gonzalez, Pilar Martinez MD, Rachel Wade, et al Mutational status of the TP53 gene as a predictor of response and survival in patients with chronic lymphocytic leukemia: results from the LRF CLL4 trial J Clin Oncol, 2011,29(16):2223-9 Fischer K, Bahlo J, Fink AM, et al Longterm remissions after FCR chemoimmunotherapy in previously untreated patients with CLL: updated results of the CLL8 trial Blood, 2016;127(2):20815 Hamblin TJ, Davis Z, Gardiner A, et al Unmutated Ig V(H) genes are associated with a more aggressive form of chronic 10 lymphocytic leukemia Blood, 1999;94(6):1848-54 Hartmut Döhner, M.D., Stephan Stilgenbauer, M.D., Axel Benner, et al Genomic Aberrations and Survival in Chronic Lymphocytic Leukemia N Engl J Med, 2000;343:1910-1916 M López-Guerra, S Xargay-Torrent, L Rosich, et al The gamma-secretase inhibitor PF-03084014 combined with fludarabine antagonizes migration, invasion and angiogenesis in NOTCH1-mutated CLL cells Leukemia, 2015;29(1):96-106 Michael Hallek, Bruce D Cheson, Daniel Catovsky, et al iwCLL guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment, and supportive management of CLL Blood, 2018;131(25):2745-2760 Michael Hallek, Othman Al-Sawaf Chronic lymphocytic leukemia: 2022 update on diagnostic and therapeutic procedures American Journal of Hematology, 2021;96(12):1679-1705 Sutton LA, Hadzidimitriou A, Baliakas P, et al Immunoglobulin genes in chronic lymphocytic leukemia: key to understanding the disease and improving risk stratification Haematologica, 2017;102(6):968-971 Xose S Puente, Magda Pinyol, Víctor Quesada, et al Whole-genome sequencing identifies recurrent mutations in chronic lymphocytic leukaemia Nature, 2011;475(7354):101-5 Zenz T, Eichhorst B, Busch R, et al TP53 mutation and survival in chronic lymphocytic leukemia J Clin Oncol, 2010;28(29):4473-9 429 ... khơng có đột biến gen IGHV (U-CLL) 43% có đột biến gen IGHV (M-CLL) 57%; chưa phát NB mang đột biến TP53 Như vậy, thành công bước đầu việc khảo sát đột biến gen TP53 tình trạng đột biến gen IGHV. .. trình tự (GTT) Sanger phân tích trình tự gen TP53 IGHV để xác định đột biến gen TP53 tình trạng đột biến gen IGHV BN chẩn đoán BCMDL Bệnh viện Truyền máu Huyết học (BVTMHH) Kết thu cung cấp thông... Chronic lymphocytic leukemia, TP53 gene mutation, IGHV gene mutation status I ĐẶT VẤN ĐỀ Bạch cầu mạn dòng lympho (BCMDL) bệnh lý ác tính đặc trưng tăng sinh tích tụ đơn dịng tế bào lympho B

Ngày đăng: 27/01/2023, 00:08

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN