ứng dụng kỹ thuật real time pcr để xác định kiểu gen, lượng virus trong máu và đặc điểm kháng thuốc điều trị của virus viêm gan b trên người bệnh của bệnh viện đa khoa tỉnh đồng tháp và chuyển giao kĩ thuật

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Báo cáo tổng kết ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH KIỂU GEN, LƯỢNG VIRUS TRONG MÁU VÀ ĐẶC ĐIỂM KHÁNG THUỐC ĐIỀU TRỊ CỦA VIRUS VIÊM GAN B TRÊN NGƯỜI BỆNH CỦA BỆNH VIỆN ĐA KHOA TỈNH ĐỒNG THÁP VÀ CHUYỂN GIAO KĨ THUẬT Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy Thành viên: BS Mai Ngọc Lành ThS Trương Kim Phượng CN Hồ Thị Thanh Thủy TP HỒ CHÍ MINH – 2014 MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH v ĐẶT VẤN ĐỀ Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài TỔNG QUAN 1.1 Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B giới 1.2 Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B Việt Nam 1.3 Một số đặc điểm sinh học virus viêm gan B 1.4 Chẩn đoán phân tử phát nhiễm HBV 1.5 Giới thiệu phương pháp Real-time PCR 1.6 Các thuốc điều trị, tượng kháng thuốc cách phát 13 1.7 Vấn đề kiểu gen HBV 19 VẬT LIỆU –PHƯƠNG PHÁP 24 2.1 Vật liệu 25 2.2 Phương pháp 25 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 27 3.1 Mô tả đặc điểm mẫu nghiên cứu 28 3.2 Xác định mối tương quan yếu tố lâm sàng cận lâm sàng bệnh 36 3.2.1 Giữa kiểu gen yếu tố lâm sàng 37 3.2.2 Giữa tải lượng virus yếu tố lâm sàng 37 3.2.3 Giữa đột biến kháng thuốc yếu tố lâm sàng 37 3.3 Xác định mối tương quan yếu tố cận lâm sàng bệnh với 39 3.3.1 Tác động kiểu gen lên yếu tố khác 39 3.3.2 Tác động đột biến kháng thuốc lên yếu tố khác 43 3.3.3 Tác động tải lượng virus số HbeAg 45 3.4 Chuyển giao kỹ thuật 48 i KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 49 4.1 Kết luận 50 4.2 Kiến nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC 60 ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADV: Adefovir dipivoxil ALT: Alanine aminotranferase cccDNA: Covalently closed circular DNA - DNA “vòng đóng cộng hóa trị” Ct: Threshold cycle - Chu kỳ ngưỡng ETV: Entecavir FDA: Food and Drug Administration - Cục Quản lý Thuốc Thực phẩm Hoa Kỳ HBcAg: Hepatitis B core antigen - kháng nguyên lõi virus viêm gan B HBeAg: Hepatitis B envelope antigen - kháng nguyên tiết virus viêm gan B HBsAg: Hepatitis B surface antigen - kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B HBV: Hepatitis B virus - virus viêm gan B HCC: Hepatocellular carcinoma - ung thư biểu mô tế bào gan LAM: Lamivudine LDT: Telbivudine NRTI: Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitor - chất ức chế phiên mã ngược nucleoside NUCs: nucleos(t)ide analogs – chất tương tự nucleos(t)ide OR: odds ratio - tỷ số chênh PCR: Polymerase Chain Reaction - phản ứng dây chuyền nhờ polymerase SPSS: Statistical Package for the Social Sciences TDF: Tenofovir VGSVB: Viêm gan siêu vi B iii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng Đặc điểm lâm sàng 28 Bảng Đặc điểm cận lâm sàng 28 Bảng Mối liên quan kiểu gen tuổi 36 Bảng Mối liên quan kiểu gen giới tính 37 Bảng Mối liên quan tải lượng virus tuổi 37 Bảng Mối liên quan tải lượng virus giới tính 37 Bảng Mối liên quan đột biến kháng LAM tuổi 38 Bảng Mối liên quan đột biến kháng LAM giới tính 38 Bảng Mối liên quan đột biến kháng ADV tuổi 38 Bảng 10 Mối liên quan đột biến kháng ADV giới tính 38 Bảng 11 Mối liên quan kiểu gen HbeAg 39 Bảng 12 Mối liên quan kiểu gen ALT 39 Bảng 13 Mối liên quan kiểu gen tải lượng virus 39 Bảng 14 Mối liên quan kiểu gen tính kháng LAM 40 Bảng 15 Mối liên quan kiểu gen tính kháng ADV 40 Bảng 16 Mối liên quan đột biến kháng LAM HbeAg 43 Bảng 17 Mối liên quan đột biến kháng ADV HbeAg 43 Bảng 18 Mối liên quan đột biến kháng LAM ALT 44 Bảng 19 Mối liên quan đột biến kháng ADV ALT 44 Bảng 20 Mối liên quan đột biến kháng LAM tải lượng virus 44 Bảng 21 Mối liên quan đột biến kháng ADV tải lượng virus 45 Bảng 22 Mối liên quan tải lượng virus HbeAg 45 iv DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình Tỷ lệ nhiễm viêm gan B mạn tính tồn giới Hình 2: Cấu trúc virus viêm gan B Hình 3: Cấu trúc gen HBV Hình Đồ thị khuếch đại dựa hiệu số tín hiệu huỳnh quang 11 Hình 5: Đồ thị minh họa số kết định lượng DNA HBV bằng kít VA.A02-001D 13 Hình Cấu tạo phân tử Lamivudine 15 Hình Mơ hình tương tác LAM với polymerase HBV hoang dại HBV đột biến L180M+M204V 16 Hình Cấu tạo phân tử Adefovir dipivoxil 17 Hình Mơ hình liên kết rtN236 với ADV-DP rtN236 với dATP chủng HBV hoang dại đột biến rt236T 18 Hình 10: Đồ thị minh họa số kết định lượng DNA HBV bằng kít VA.A02-001H 19 Hình 11: Đồ thị minh họa số kết định lượng DNA HBV bằng kít VA.A02-001F 23 v ĐẶT VẤN ĐỀ Tính cấp thiết đề tài Theo báo cáo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), có khoảng tỷ người nhiễm HBV toàn giới, đó khoảng 6% có viêm gan siêu vi B cấp tính – 10% số chuyển sang mạn tính người lớn, riêng trẻ em tỷ lệ lên đến 90% Tỷ lệ tử vong giai đoạn cấp tính 1% Biến chứng viêm gan siêu vi B cấp viêm gan mạn, xơ gan ung thư gan nguyên phát, dẫn đến tử vong vào khoảng triệu người năm Một số kết điều tra cho thấy nước Đông Nam Á, Trung Quốc Châu Phi nơi có tỷ lệ người nhiễm HBV cao giới Tại Việt Nam có 15 20% người nhiễm HBV, 80 - 92% bệnh nhân xơ gan ung thư gan nguyên phát có nhiễm HBV Bệnh viêm gan siêu vi B bệnh phổ biến tỉnh Đồng Tháp, ước tính khoảng 10% tổng số xét nghiệm HbsAg Việc triển khai điều trị Bệnh viện Đa khoa Đồng Tháp chưa thực chưa đủ phương tiện chẩn đoán theo dõi điều trị Chẩn đoán nhiễm HBV bao gồm phương pháp huyết học như: khuếch tán miễn dịch, kết dính hồng cầu, phương pháp có độ nhạy cao miễn dịch enzyme (EIA) miễn dịch phóng xạ (RIA) Gần có thêm kỹ thuật phân tử gồm: kỹ thuật lai phân tử (molecular hybridization) PCR (Polymerase Chain Reaction), đó real-time PCR có ưu với độ nhạy, độ đặc hiệu cao, khả phân tích kết trình thực phản ứng khuếch đại, không qua bước điện di nên tránh khả ngoại nhiễm Việc sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán y khoa nói chung nhiễm virus HBV nói riêng triển khai nhiều bệnh viện lớn, tập trung TP Hồ Chí Minh Hà nội Đề tài thực hiện, khởi đầu cho việc áp dụng kỹ thuật tiên tiến chẩn đoán nhiễm HBV Đồng Tháp Đề tài cung cấp số liệu tải lượng virus HBV máu, kiểu gen, kiểu đột biến kháng thuốc, liệu ban đầu đặc trưng nhiễm HBV, tạo sở cho việc theo dõi, điều trị bệnh viêm gan siêu vi B Mục tiêu cụ thể đề tài: - Xác định đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng người bệnh nhiễm HBV (chỉ tiêu xác định: HBsAg dương tính, 100 ca) - Định lượng virus HBV máu, xác định tỉ lệ kiểu gen tần số đột biến kháng thuốc Lamivudine Adefovir HBV - Xác định mối liên quan đặc trưng sinh học phân tử HBV với đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng người bệnh - Chuyển giao kỹ thuật TỔNG QUAN 34 (51.5%) 32 (48.5%) 66 p