Ứng dụng kỹ thuật real time pcr để xác định các týp hpv trongmẫumô tổn thương tiền ung thư ở cổ tử cung, âm đạo

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - - BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH CÁC TÝP HPV TRONG MẪU MÔ TỔN THƢƠNG TIỀN UNG THƢ Ở CỔ TỬ CUNG, ÂM ĐẠO Mã số: Chủ nhiệm đề tài: TS.BS ĐOÀN THỊ PHƢƠNG THẢO ThS NGUYỄN ĐẠI THỨC Tp Hồ Chí Minh, năm 2018 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL - TIME PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH CÁC TÝP HPV TRONG MẪU MÔ TỔN THƢƠNG TIỀN UNG THƢ Ở CỔ TỬ CUNG, ÂM ĐẠO Mã số: Chủ nhiệm đề tài (Ký, họ tên) TP Hồ Chí Minh, năm 2018 DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU Chủ nhiệm đề tài: TS.BS ĐOÀN THỊ PHƢƠNG THẢO ThS NGUYỄN ĐẠI THỨC MỤC LỤC CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tình hình nhiễm HPV Việt Nam giới 1.2 Đặc điểm chung Human Papillomavirus (HPV) 1.2.1 Hình thái cấu trúc HPV 1.2.2 Đặc điểm cấu trúc chức gen HPV 1.2.2.1 Đặc điểm cấu trúc 1.3 Phân loại HPV 1.4 Các phƣơng pháp phát HPV mức độ mô bệnh học phân tử 1.4.1 Chẩn đốn mơ bệnh học 1.4.2 Chẩn đoán kỹ thuật sinh học phân tử CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thiết kế nghiên cứu 2.2 Đối tƣợng nghiên cứu 2.3 Tiêu chuẩn chọn mẫu 2.4 Tiêu chuẩn loại trừ 2.5 Cỡ mẫu 2.6 Qui trình kỹ thuật lấy mẫu phân tích mẫu nghiên cứu 2.6.1 Ghi nhận thông tin lâm sàng 2.6.2 Sơ đồ quy trình phân tích mẫu nghiên cứu 2.6.3 Dụng cụ, trang thiết bị, hóa chất nghiên cứu 2.6.4 Quy trình thực đọc kết Realtime PCR 10 2.6.5 Thống kê, xử lý số liệu dự kiến kết nghiên cứu 11 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ 12 3.1 Đặc điểm giải phẫu bệnh 12 3.2 Phân bố mức độ tổn thƣơng mơ bệnh học theo nhóm tuổi 12 3.3 Tỷ lệ nhiễm HPV mẫu mô bệnh học 12 3.4 Mối liên quan tỷ lệ nhiễm HPV nhóm tuổi 13 3.4.1 Phân bố tỷ lệ nhiễm HPV theo nhóm tuổi 13 3.4.2 Phân bố tỷ lệ nhiễm týp HPV theo nhóm tuổi 14 3.5 Các mối liên quan tỉ lệ nhiễm HPV theo mức độ tổn thƣơng mô bệnh học 14 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 17 4.1 Đặc điểm mô bệnh học 17 4.2 Độ tuổi bệnh nhân 17 4.3 Tỷ lệ nhiễm HPV mẫu mô bệnh học cổ tử cung 17 4.3.1 Tỷ lệ nhiễm HPV theo nhóm tuổi 21 4.3.2 Các mối tƣơng quan tỉ lệ nhiễm HPV mức độ tổn thƣơng mô bệnh học 21 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BV : Bệnh viện ĐHYD : Đại Học Y Dƣợc TP.HCM: Thành Phố Hồ Chí Minh CTC : Cổ tử cung HPV : Human Papilloma Virus UTCTC: Ung thƣ cổ tử cung MBH : Mô bệnh học PCR : Polymerase Chain Reaction CIN : Cervical Intraepithelial Neoplasia CIN : Cervical Intraepithelial Neoplasia CIN : Cervical Intraepithelial Neoplasia CIS : Cervical Carcinoma In Situ ORF : Open Reading Frame URR : Upstream Regulatory Region LCR : Long Control Region DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Tỷ lệ nhiễm HPV qua xét nghiệm Realtime PCR MBH 22 Bảng 3.2 Tỷ lệ nhiễm HPV mẫu mô bệnh học theo nhóm tuổi 23 Bảng 3.3 Tỷ lệ týp HPV mẫu mô bệnh học theo nhóm tuổi 24 Bảng 3.4 Tỷ lệ nhiễm HPV mẫu mô bệnh học 24 Bảng 3.5 Sự phân bố týp HPV nguy cao HPV nguy thấp UTCTC theo mức độ tổn thƣơng mô bệnh học 25 Bảng 3.6 Tỷ lệ nhiễm HPV theo mức độ tổn thƣơng biểu mô cổ tử cung 25 Bảng 3.7 Sự phân bố týp HPV theo mức độ tổn thƣơng biểu mô CTC 26 Bảng 4.1 Tỷ lệ nhiễm HPV cặp mồi khác nghiên cứu .28 Bảng 4.2 So sánh tỷ lệ nhiễm HPV với nghiên cứu khác 29 Bảng 4.3 Tỷ lệ nhiễm genotype HPV16 HPV18 so với nghiên cứu 30 DANH MỤC HÌNH Sơ đồ 2.1 Quy trình phân tích mẫu nghiên cứu 17 Hình 2.1 Biểu kết HPV dƣơng tính 17 Biểu đồ 3.1 Tần số phân bố mô bệnh học theo nhóm tuổi 22 Biểu đồ 3.2 Tỷ lệ phân týp nhiễm HPV 23 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH CÁC TÝP HPV TRONG MẪU MÔ TỔN THƢƠNG TIỀN UNG THƢ Ở CỔ TỬ CUNG, ÂM ĐẠO Đoàn Thị Phƣơng Thảo, Nguyễn Đại Thức TÓM TẮT Mục tiêu: Xác định týp vi rút HPV mẫu có tổn thƣơng Condyloma, CIN 1, CIN 2, CIN Carcinoma tế bào gai cổ tử cung, âm đạo Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang đƣợc thực nghiên cứu thời gian từ tháng 05/2015 đến tháng 05/2016 Đại Học Y Dƣợc Thành Phố Hồ Chí Minh Kết quả: Với 56 trƣờng hợp HPV dƣơng tính, tiến hành định genotype HPV ghi nhận 27/56 trƣờng hợp (48,22%) nhóm HPV “nguy cao”, 14/56 trƣờng hợp (25%) nhóm HPV “nguy thấp”, 4/56 trƣờng hợp (7,16%) nhóm đa nhiễm có nguy cao, cịn lại 11/56 trƣờng hợp (19,64%) nhóm HPV chƣa xác định đƣợc nguy Trong nhóm HPV “nguy cao” có HPV16 chiếm tỷ lệ cao nhất: 12/56 (21,43%), thứ hai HPV52 có tỷ lệ 9/56 (16,07%), thứ HPV18 có 5/56 (8,93%) lại HPV58, HPV16+18, HPV18+58, HPV6+52, HPV11+52 loại có 1/56 (1,79%) Kết luận: Tỷ lệ nhiễm HPV tổn thƣơng tiền ung thƣ cổ tử cung với Condyloma (77,8%), Condyloma kèm CIN1 (100%), CIN1 (37,5%), CIN2 (50%), CIN3 (64,5%) Carcinôm tế bào gai cổ tử cung (90%) Tỷ lệ nhiễm HPV nguy thấp HPV nguy cao khác biệt có ý nghĩa thống kê theo mức độ tổn thƣơng loạn sản cổ tử cung với p=0,006 Với tỷ lệ nhiễm HPV nguy cao loạn sản độ cao Carcinôm tế bào gai cao tổn thƣơng tiền ung thƣ với mức độ tổn thƣơng Condyloma, loạn sản nhẹ loạn sản vừa cổ tử cung có ý nghĩa thống kê, với p< 0,001 Từ Khóa: HPV, ung thƣ cổ tử cung, định týp HPV, realtime PCR định týp HPV, chẩn đoán phân tử HPV, xác định týp HPV ĐẶT VẤN ĐỀ Human Papillomavirus (HPV) tác nhân lây nhiễm thƣờng gặp qua đƣờng tình dục nguyên nhân quan trọng dẫn tới ung thƣ cổ tử cung (UTCTC), loại ung thƣ đứng hàng thứ hai loại ung thƣ nữ giới [41] Hàng năm giới, ƣớc tính có khoảng 529.000 ca mắc UTCTC, tử vong khoảng 275.000 trƣờng hợp, 85% tổng số trƣờng hợp bệnh gặp nƣớc phát triển [24] Cùng với tăng nhanh tỷ lệ nhiễm HPV cộng đồng, UTCTC thực trở thành gánh nặng bệnh tật toàn cầu, gây ảnh hƣởng nặng nề đến sức khỏe tâm lý nữ giới HPV thuộc họ Papillomaviridea với 200 genotype khác vật liệu di truyền đƣợc xác định khoảng 100 genotype khoảng 40 genotype HPV đƣợc xác định niêm mạc đƣờng sinh dục ngƣời [16],[34] Trong đó, khoảng tám genotype HPV "nguy cao" (HPV-16, -18, -31, -33, -35, -45, -52, 58) đƣợc thống kê genotype phổ biến nhất, có liên quan tới 90% trƣờng hợp UTCTC toàn giới riêng HPV-16, -18 gặp 70% trƣờng hợp [34], [18] Tại Việt Nam, theo thống kê Tổ chức Y tế giới năm 2010, UTCTC loại ung thƣ chiếm tỷ lệ cao nữ giới lứa tuổi 15 đến 44, với 6000 ca nhiễm (tỷ lệ: 11,7 100.000 phụ nữ) tử vong 3000 trƣờng hợp năm [41] Điều đặc biệt quan tâm phần lớn trƣờng hợp UTCTC thƣờng đƣợc phát giai đoạn muộn, trình diễn tiến từ nhiễm vi rút đến ung thƣ thƣờng trải qua thời gian dài Các bệnh nhiễm HPV gây kể UTCTC, chữa khỏi hẳn đƣợc phát sớm Điều quan trọng để phát đƣợc nhiễm HPV phải có chƣơng trình sàng lọc đƣợc áp dụng nhằm phát sớm trƣờng hợp nhiễm HPV, từ để có biện pháp điều trị triệt để, ngăn chặn nguy tiến triển thành ung thƣ ung thƣ xâm nhập Đây hội có ý nghĩa cho việc phát nhiễm HPV, phát ngƣời có nguy mắc UTCTC nhằm giúp trình điều trị hiệu tổn thƣơng tiền ung thƣ ung thƣ giai đoạn sớm Tuy nhiên, Việt Nam việc thực xác định genotype HPV mẫu mô sinh thiết vùi nến đặc biệt mẫu có chẩn đốn mơ bệnh học Condyloma, CIN 1, CIN 2, CIN Carcinoma tế bào gai cổ tử cung, hạn chế nghiên cứu mô bệnh học phát triển kỹ thuật định genotype HPV mô vùi nến Với tầm quan trọng ý nghĩa việc định týp HPV nhƣ xuất phát từ thực tiễn nêu trên, đề tài "Ứng dụng kỹ thuật Real-time PCR để xác định týp HPV mẫu mô tổn thƣơng tiền ung thƣ cổ tử cung, âm đạo." Câu hỏi nghiên cứu: Kỹ thuật Real-time PCR mẫu mô sinh thiết phát nhiễm týp HPV có thực hiệu nhằm giúp cho bác sĩ điều trị biết đƣợc týp HPV có “nguy cao” hay “nguy thấp” gây UTCTC để xác định phƣơng hƣớng điều trị cho bệnh nhân hay không? Mục ti u nghi n cứu Xác định tỷ lệ nhiễm HPV mẫu mơ có tổn thƣơng Condyloma, CIN 1, CIN 2, CIN Carcinoma tế bào gai cổ tử cung, âm đạo Khảo sát mối liên quan chẩn đốn mơ bệnh học Condyloma, CIN 1, CIN 2, CIN Carcinoma tế bào gai cổ tử cung – âm đạo với genotype HPV Nhận xét: tỷ lệ nhiễm HPV dƣơng tính mẫu mơ bệnh học 64,37% HPV âm tính 35,63 Biểu đồ 3.2 Tỷ lệ phân týp nhiễm HPV Trong týp HPV dƣơng tính, HPV16 chiếm tỷ lệ cao 21,43%, thứ hai HPV chƣa xác định týp có tỷ lệ 19,64% thứ HPV52 HPV11 có tỷ lệ 16,1% Với týp đa nhiễm HPV11+52, HPV6+52, HPV18+58, HPV 16+18 ghi nhận đƣợc loại 1,79 % 3.4.Mối liên quan tỷ lệ nhiễm HPV nhóm tuổi 3.4.1.Phân bố tỷ lệ nhiễm HPV theo nhóm tuổi: Bảng 3.2 Tỷ lệ nhiễm HPV mẫu mơ bệnh học theo nhóm tuổi Từ 20-29 tuổi Từ 30-39 tuổi HPV ÂM TÍNH N % 20,0 42,1 HPV DƢƠNG TÍNH N % 80,0 11 57,9 Từ 40-49 tuổi 15 Nhóm tuổi 31,8 68,2 Từ 50-59 tuổi 39,1 14 60,9 Trên 60 tuổi 38,5 61,5 Tổng 31 35.6 56 64.4 Nhận xét: tỷ lệ nhiễm HPV mẫu mơ bệnh học khơng có khác biệt nhóm tuổi ( Với 2 = 1,720 p=0,787) Tỷ lệ nhiễm HPV nhóm 13 tuổi khơng có khác rõ rệt nhƣng nhóm tuổi 20-29 chiếm tỷ lệ cao 80% thứ hai nhóm 40-49 tuổi 68,2% 3.4.2.Phân bố tỷ lệ nhiễm týp HPV theo nhóm tuổi: Bảng 3.3 Tỷ lệ týp HPV mẫu mơ bệnh học theo nhóm tuổi HPV6 Nhóm tuổi n (%) 20-29 (16,7) 30-39 (5,9) 40-49 (3,8) 50-59 (5,3) ≥ 60 (0,0) Tổng (5,7) Nhận xét: không HPV11 HPV16 n n (%) (%) (25,0) (8,3) (5,9) (0,0) (7,7) (15,4) (10,5) (26,3) (7,7) (15,4) 12 (10,3) (13,8) có khác biệt ĐA NHIỄM HPV18 HPV52 HPV58 n (%) (8,3) (5,9) (7,7) (5,3) (0,0) (5,7) tần suất n n (%) (%) (8,3) (0,0) (17,6) (5,9) (7,7) (0,0) (5,3) (0,0) (15,4) (0,0) (10,3) (1,1) nhiễm típ HPV CHƢA XÁC ĐỊNH n n (%) (%) (8,3) (0,0) (0,0) (17,6) (7,7) (15,4) (0,0) (10,5) (7,7) (15,4) 11 (4,4) (12,6) nhóm tuổi khác ( Với 2 = 44,477 p=0,618) 3.5.Các mối liên quan tỉ lệ nhiễm HPV theo mức độ tổn thƣơng mô bệnh học Bảng 3.4 Tỷ lệ nhiễm HPV mẫu mô bệnh học Tổn thƣơng MBH Condyloma Condyloma có CIN CIN CIN CIN Carcinơma tế bào gai TỔNG HPV âm tính n % 22,2 HPV dƣơng tính n % 14 77,8 Tổng số n % 18 20,7 0,0 100,0 2,3 10 11 62,5 50,0 35,5 20 37,5 50,0 64,5 16 10 31 18,4 11,5 35,6 10,0 90,0 10 11,5 31 35,5 56 64,4 87 100 14 Nhận xét: tỷ lệ nhiễm HPV có liên quan tới mức độ tổn thƣơng mơ bệnh học cổ tử cung có ý nghĩa thống kê ( Với 2 = 11,319 p = 0,045) Tỷ lệ nhiễm HPV Condyloma có CIN chiếm tỷ lệ cao 100% Carcinoma tế bào gai chiếm tỷ lệ thứ hai 90%, sau Condyloma 77,8%, CIN có 64,5%, CIN có 50% CIN chiếm tỷ lệ thấp 37,5% Bảng 3.5 Sự phân bố týp HPV nguy cao HPV nguy thấp UTCTC theo mức độ tổn thƣơng mô bệnh học HPV nguy thấp Tổng số ĐA NHIỄM Carcinôma tế bào gai HPV58 CIN (6,2) (0,0) (22,6) (10,0) 11 (12,6) HPV52 CIN (0,0) (0,0) 6,4 (0,0) (4,4) HPV18 CIN n (%) (5,6) (0,0) HPV16 Condyloma Có CIN n (%) (11,2) (0,0) HPV11 Condyloma HPV chƣa xác định n (%) (0,0) n (%) (16,7) n (%) (33,3) n (%) (5,6) n (%) (0,0) n (%) (5,6) (0,0) (100,0) (0,0) (0,0) (0,0) (0,0) (12,5) (0,0) 0,0 (0,0) (5,7) (0,0) (0,0) 0,0 (10,0) (10,3) (0,0) (0,0) 19,4 (50,5) 12 (13,8) (6,2) (40,0) 0,0 (0,0) (5,7) (6,2) (0,0) 16,1 (20,0) (10,3) (0,0) (10,0) 0,0 (0,0) (1,1) HPV6 Tổn thƣơng MBH HPV nguy cao Nhận xét: Với p