Xác định đột biến gen LRRK2 ở bệnh nhân Parkinson

Nghiên cứu này nhằm mục đích xác định đột biến của gen LRRK2 ở bệnh nhân Parkinson bằng phương pháp giải trình tự gen trực tiếp. Nghiên cứu được tiến hành trên 30 bệnh nhân được chẩn đoán Parkinson.

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN LRRK2 Ở BỆNH NHÂN PARKINSON Nguyễn Thị Nữ, Phạm Lê Anh Tuấn, Trần Vân Khánh Trần Huy Thịnh Trường Đại học Y Hà Nội Gen LRRK2 gen lớn nằm nhiễm sắc thể 12 với chiều dài 144 kb, bao gồm 51 exon mã hóa 2527 acid amin có vai trị quan trọng việc khởi động trình dịch mã tế bào Đột biến gen LRRK2 chiếm khoảng - 10% bệnh nhân Parkinson có tiền sử gia đình, di truyền trội nhiễm sắc thể thường chiếm khoảng 3,6% bệnh nhân Parkinson khơng có tiền sử gia đình LRRK2 protein lớn, đa miền với đột biến gây bệnh rải rác trải dài gen Vì chúng tơi thực nghiên cứu nhằm mục đích xác định đột biến gen LRRK2 bệnh nhân Parkinson phương pháp giải trình tự gen trực tiếp Nghiên cứu tiến hành 30 bệnh nhân chẩn đoán Parkinson Kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp sử dụng để xác định đột biến gen LRRK2 Kết tỷ lệ có đột biến chiếm 16,7%, khơng có đột biến 83,3% Độ tuổi trung bình 55,9 ± 9,5 Tỷ lệ nam/nữ = 1,14 Từ khóa: Parkinson, đột biến gen, LRRK2 I ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh Parkinson bệnh rối loạn thần kinh phổ biến thứ hai giới sau Alzheimer.1 Bệnh gây ảnh hưởng đến triệu người 50 tuổi số 15 quốc gia đông dân giới, số dự kiến tăng gấp đôi vào năm 2030.2 Nguyên nhân bệnh thối hóa tế bào thần kinh vùng chất đen, thối hóa tế bào làm giảm hàm lượng dopamin, chất có vai trị quan trọng việc dẫn truyền tín hiệu thần kinh để đảm bảo cho trình co diễn bình thường điều khiển não bộ.3 Các triệu chứng di truyền với hai dạng Parkinson khởi phát điển hình vơ khởi phát muộn Và theo số nghiên cứu xác định có tới 80 dạng đột biến gen LRRK2 có khả gây bệnh cơng bố, phần lớn đột biến dạng thay nucleotid.5 Trong có đột biến (N1437H, R1441H/G/C, Y1699C, G2019S I2020T) chứng minh đột biến gây bệnh.6 Tuy nhiên, tỷ lệ mắc đột biến lại khác chủng tộc Cho đến nay, nhiều nghiên cứu đánh giá phần gen LRRK2 trường hợp gây bệnh Parkinson đột biến gen LRRK2 lớn bệnh Parkinson trở nên rõ ràng 70% tế bào thần kinh dopaminergic chết Gần có nhiều nghiên cứu có tới 20 gen có liên quan đến bệnh Parkinson GBA, SNCA, PARK2, LRRK2, PINK1, PARKIN Trong đột biến gen LRRK2 cơng nhận yếu tố có nguy phức tạp với nhiều miền tương tác enzym protein, miền có đột biến gây bệnh Parkinson yếu tố nguy gây bệnh…7 Do đó, việc xác định đột biến gen LRRK2 có ý nghĩa chẩn đoán sớm phát triển phương pháp trị liệu nhắm vào mục tiêu đích để cải thiện chất lượng sống cho bệnh nhân có nguy bị Parkinson Xuất phát từ thực tế thực đề tài với mục tiêu: Xác định đột biến gen LRRK2 bệnh nhân Parkinson phương pháp giải trình tự gen trực tiếp Tác giả liên hệ: Trần Huy Thịnh Trường Đại học Y Hà Nội Email: tranhuythinh@hmu.edu.vn Ngày nhận: 26/10/2021 Ngày chấp nhận: 03/11/2021 18 TCNCYH 151 (3) - 2022 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP thống primer3 (v.0.4.0) Thành phần phản ứng PCR: tổng thể tích 10µl gồm: 2µl DNA, 1µl primer (F/R), 5µl Gotaq 2X, 2µl nước cất Chu trình nhiệt phản ứng PCR: 95oC/ phút, [95oC/ 30 giây, 58oC/ 20 giây, 72oC/ 30 giây] x 35 chu kỳ, 72oC/ phút, giữ 15oC Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1,5%, 120V 30 phút + Kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp (sequencing): Sản phẩm PCR tinh giải trình tự máy ABI-3100 Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội Xử lý số liệu: Kết đột biến phân tích phần mềm CLC Main Worbench so sánh với liệu từ Gene bank (Accession number NM_198578) Và phần mềm SPSS 20.0 sử dụng để thu thập thông tin từ hồ sơ bệnh án xử lý số liệu Đối tượng nghiên cứu Tiêu chuẩn lựa chọn: Lựa chọn 30 bệnh nhân chẩn đoán xác định mắc bệnh Parkinson bệnh viện Lão khoa Trung Ương theo tiêu chuẩn chẩn đoán ngân hàng não hội bệnh Parkinson Vương quốc Anh, hồ sơ bệnh án cung cấp đầy đủ thơng tin Tiêu chuẩn loại trừ: Bệnh nhân có kèm triệu chứng bệnh não khác (như chấn thương sọ não, tai biến mạch máu não, u não ) Phương pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu mô tả Thời gian nghiên cứu Từ tháng 8/2020 đến tháng 9/2021 Địa điểm nghiên cứu Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội Một số quy trình thực + Tách chiết DNA: DNA tổng số tách chiết từ mẫu máu toàn phần bệnh nhân Parkinson kit QIAamp DNA mini Kit Các đối tượng nghiên cứu lấy 2ml máu tĩnh mạch vào ống đựng máu vơ trùng có chứa chất chống đông EDTA 1,5mg/mL mẫu đạt tiêu chuẩn OD280/OD260 ≥ 1,8 sử dụng để phân tích gen + Kỹ thuật PCR: Sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại tồn gen LRRK2 Trình tự mồi tự thiết kế hệ Đạo đức nghiên cứu Đây nghiên cứu mô tả cắt ngang thơng tin cá nhân mã hóa giữ bảo mật an toàn Thu thập số liệu tiến hành cách trung thực, phục vụ cho mục đích nghiên cứu III KẾT QUẢ Đặc điểm chung nhóm nghiên cứu Nhóm nghiên cứu chúng tơi gồm 30 bệnh nhân chẩn đốn mắc Parkinson khơng phân biệt giới tính, tuổi tác giai đoạn bệnh khác Thông tin đặc điểm trình bày bảng bảng Bảng Đặc điểm tuổi giới nhóm đối tượng nghiên cứu Nhóm tuổi Nam Nữ Tổng số Số lượng Tỷ lệ (%) Số lượng Tỷ lệ (%) Số lượng Tỷ lệ (%) < 60 13 81,3 64,3 22 73,3 ≥ 60 18,7 35,7 26,7 Tổng 16 100 14 100 30 100 Tỷ lệ nam/nữ = 1,14 TCNCYH 151 (3) - 2022 19 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Bảng Đặc điểm giai đoạn bệnh đối tượng nghiên cứu Có đột biến Khơng có đột biến Tổng số Giai đoạn bệnh theo Hoehn Yahr n=5 % n = 25 % n = 30 % I 0 12 48 12 40 II 40 32 10 33,3 III 60 12 20 IV 0 6,7 V 0 0 0 Phân bố nhóm tuổi nhóm bệnh nhân nghiên cứu là: Tỷ lệ bệnh nhân Parkinson cao nhóm tuổi < 60 tuổi (73,3%), cịn nhóm tuổi ≥ 60 tuổi chiếm tỷ lệ (26,7%) Tuổi trung bình mắc bệnh 55,9 ± 9,5 tuổi Tuổi nhỏ 38 tuổi, tuổi cao mắc bệnh 80 tuổi Nam 60 tuổi chiếm tỷ lệ 81,3%, ≥ 60 tuổi 18,7% Nữ 60 tuổi chiếm tỷ lệ 64,3%, ≥ 60 tuổi 35,7% Tỷ lệ nam/nữ = 1,14 Đặc điểm giai đoạn bệnh nhóm nghiên cứu chia làm 05 giai đoạn Giai đoạn bệnh thường gặp bệnh nhân có đột biến giai đoạn II (40%), III (60%) Ở bệnh nhân khơng có đột biến giai đoạn thường gặp giai đoạn I (48%) giai đoạn II (32%), gặp giai đoạn III (12%), giai đoạn IV (8%) khơng có bệnh nhân giai đoạn V Đặc điểm đột biến số exon gen LRRK2 bệnh nhân Parkinson Cả 30 bệnh nhân nghiên cứu xác định đột biến gen LRRK2 phương pháp giải trình tự gen Sanger Cụ thể có 5/30 bệnh nhân mang đột biến tìm thấy loại đột biến khác bệnh nhân mang đột biến Thông tin bệnh nhân mang đột biến loại đột biến trình bày bảng Bảng Đặc điểm thơng tin bệnh nhân có đột biến đột biến tìm thấy STT Mã số Giới Tuổi Vị trí exon/ intron Đột biến thay Thay đổi aicid amin Mô tả đột biến PK17 Nam 56 Exon c.158A>G Lys53Arg Dị hợp tử PK44 Nam 44 Exon c.158A>G Lys53Arg Dị hợp tử PK30 Nam 52 Exon 16 c.1929A>C Glu643Asp Dị hợp tử PK38 Nữ 55 Intron 18 2242-17delT ĐB dịch khung Dị hợp tử PK39 Nam 52 Intron 39 c.5758-16T>C ĐB vùng cắt nối Dị hợp tử Chúng tơi tìm thấy đột biến bệnh nhân có bệnh nhân có đột biến vùng exon (cụ thể bệnh nhân mang đột biến exon bệnh nhân mang đột biến exon 16), bệnh nhân có đột biến vùng intron intron 18 intron 39 Tất đột biến đột biến dị hợp tử có đột biến thay nucleotid, đột biến dịch khung đột biến vùng cắt nối 20 TCNCYH 151 (3) - 2022 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Các hình ảnh kết giải trình tự gen bệnh nhân Parkinson có đột biến c.158A Người bình thường c.158A>G(K53R) Bệnh nhân mã số PK17 PK44 Hình Kết giải trình tự cho thấy bệnh nhân PK17 PK44 vị trí 158 phân tử mRNA gen LRRK2 tương ứng với nucleotid A người bình thường thay nucleotid G dẫn đến ba thứ 53 mã hóa acid amin Lysin thành Arginin c.1929A Người bình thường c.1929A>G(Glu643Asp) Bệnh nhân mã số PK39 Hình Kết giải trình tự cho thấy bệnh nhân PK39 vị trí 1929 phân tử mRNA gen LRRK2 tương ứng với nucleotid A người bình thường thay nucleotid G dẫn đến ba thứ 643 mã hóa acid amin Glutamic thành Aspartic 5758-16T Người bình thường 5758-16 T>C Bệnh nhân mã số PK30 Hình Kết giải trình tự cho thấy bệnh nhân PK30 vị trí 5758 vùng intron gen LRRK2 tương ứng với nucleotid T người bình thường thay nucleotid C dẫn đến thay nucleotid vị trí cắt nối vùng intron TCNCYH 151 (3) - 2022 21 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 2242-17T Người bình thường 2242-17delT Bệnh nhân mã số PK38 Hình Kết giải trình tự cho thấy bệnh nhân PK38 vị trí 2242 vùng intron gen LRRK2 tương ứng với nucleotid T người bình thường bị xóa dẫn đến thay đổi lớn tới trình tự nucleotid phía sau Một số đặc điểm triệu chứng vận động bệnh nhân Parkinson Các đặc điểm lâm sàng bệnh nhân Parkinson có đột biến khơng có đột biến chúng tơi trình bày bảng Bảng Đặc điểm triệu chứng vận động Triệu chứng vận động Số bệnh nhân có đột biến (n = 5) Số bệnh nhân khơng có đột biến (n = 25) Tổng (n = 30) Tỉ lệ (%) n % n % n % Run 80 20 80 24 80 Giảm vận động tay chân 100 24 96 29 96,7 Cứng 100 20 80 25 83,3 Tư 100 17 68 22 73,3 Nhận xét: Bệnh nhân hầu hết có đầy đủ triệu chứng rối loạn vận động nhóm có đột biến khơng có đột biến, tổng tỷ lệ giảm vận động tay chân chiếm tỉ lệ cao (96,7%), cứng (83,3%), run (80%) tư (73,3) 22 IV BÀN LUẬN Trong nhóm nghiên cứu chúng tơi giai đoạn bệnh bệnh nhân Parkinson tập trung chủ yếu giai đoạn II III, số bệnh nhân giai đoạn IV khơng có bệnh nhân giai đoạn V Độ tuổi trung bình nhóm TCNCYH 151 (3) - 2022 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC nghiên cứu 55,95 ± tương đồng với nghiên cứu tác giả Nhữ Đình Sơn (2012) với độ tuổi trung bình 56,69 ± 10,54.8 Chúng nhận thấy đa số bệnh nhân khởi phát bệnh 50 tuổi, bệnh nhân khởi phát trước tuổi 50 có bệnh nhân khởi phát bệnh trước 40 tuổi Sự khác biệt khác biệt lối sống, thổ nhưỡng, tình trạng nhiễm mơi trường số tác động ngoại cảnh khác Trong nghiên cứu chúng tơi xác định bệnh nhân có đột biến tổng số 30 lực tương tác tĩnh điện.10 Sự thay đổi lực tương tác tĩnh điện làm ảnh hưởng đến trình gấp protein làm giảm chức protein Và đột biến c.1929A>G exon 16 làm biến đổi acid amin Glutamic thành Aspartic tương tự Hai acid amin Glutamic Aspartic thuộc nhóm acid amin mang điện tích âm cấu trúc phân tử khác nhau, kích thước khác nên thay đổi làm ảnh hưởng cấu trúc protein làm ảnh hưởng đến chức protein bệnh nhân Parkinson (16,7%) Trong có hai bệnh nhân mang đột biến exon 2, bệnh nhân đột biến exon 16, bệnh nhân đột biến intron 18 bệnh nhân mang đột biến vùng intron 39 Tất đột biến dị hợp tử Điều tương đồng với nhiều nghiên cứu giới cho đột biến gen LRRK2 phần lớn đột biến thay nucleotid đột biến dị hợp tử Trong nghiên cứu tác giả Qin Rui cộng (2018) có phân tích đột biến G2019S (thay glycine 2019 serine) dẫn đến kích hoạt mức kinase phổ biến góp phần vào ~ 36% bệnh Parkinson gia đình lẻ tẻ người Ả Rập Bắc Phi, ~ 30% bệnh Parkinson gia đình quần thể Do Thái Ashkenazi, lên đến 6% trường hợp gia đình Châu Âu 3% bệnh Parkinson lẻ tẻ Châu Âu Bắc Mỹ, khơng có người Châu Á.1,9 Và nghiên cứu tất đột biến tìm thấy đột biến chưa có báo cáo nước giới nghiên cứu gen LRRK2 công bố Hai đột biến dị hợp tử làm thay đổi trình tự acid amin Một đột biến exon c.158A>G làm biến đổi acid amin Lysin thành Arginin Hai acid amin nhóm với tích điện dương, hầu hết tiếp xúc với bề mặt protein đóng vai trị quan trọng ổn định protein cách hình thành Một đột biến thay nucleotide vị trí cắt nối tìm thấy nghiên cứu c.5758-16T>C intron 39, khơng trực tiếp làm thay đổi trình tự mã hoá acid amin protein LRRK2 ảnh hưởng đến vị trí cắt bỏ intron 39 để nối exon 39 40 vào tạo nên mRNA hoàn chỉnh Cuối đột biến xóa nucleotid T vị trí intron 18 phân tử mRNA làm chức protein bị biến đổi, vị trí cắt nối thay đổi Mặc dù đột biến chưa có báo cáo công bố liên quan tới bệnh Parkinson từ kết giải trình tự gen cho thấy sai khác lớn trình tự mã hóa acid amin điều làm ảnh hưởng lớn đến vùng gen mã hóa tạo nên tín hiệu kết thúc sớm sau Vì tạo protein LRRK2 khơng có chức nguyên nhân gây nên bệnh Parkinson Đây báo cáo đột biến gen LRRK2 xác định bệnh nhân Parkinson Việt Nam Do có số khả mức độ ổn định mARN, cấu trúc hay thay đổi trình tổng hợp protein có liên quan đến chế số thay đổi Hơn nữa, yếu tố mơi trường sống góp phần vào biến đổi kiểu hình bệnh nhân Parkinson Vì vậy, chúng tơi cần có nghiên cứu sâu hơn, cỡ mẫu lớn để chứng minh nghĩa đột TCNCYH 151 (3) - 2022 23 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC biến sai nghĩa tìm hiểu thêm đột biến quần thể người Việt Nam Nghiên cứu 30 bệnh nhân nhận thấy hầu hết bệnh nhân có đầy đủ triệu chứng rối loạn vận động, run, cứng hai nhóm đối tượng có đột biến khơng có đột biến Trong hay gặp triệu chứng giảm vận động tay chân (96,7%), tiếp tình trạng cứng (83,3%), sau run (80%) tư (73,3%) Kết nghiên cứu tương đồng với nghiên cứu tác giả Nguyễn Thanh Bình với tỉ lệ giảm vận động tay chân (88,9%), cứng (90%), run (96,1%) bất thường tư (88,3%).11 Còn theo nghiên cứu tác giả Trần Văn Chung (2010) tỉ lệ thấp so với nghiên cứu với tỉ lệ giảm vận động (76,5%), run (82%), cứng (86,4%).12 Sự khác biệt nghiên cứu cỡ mẫu nghiên cứu đối tượng nghiên cứu mức độ biểu bệnh khác thường gặp nhiều tác giả cho đa số bệnh nhân có đầy đủ triệu chứng V KẾT LUẬN Trong 30 bệnh nhân chẩn đốn mắc bệnh Parkinson nghiên cứu tỷ lệ bệnh nhân có đột biến chiếm 16,7%, tỷ lệ bệnh nhân khơng có đột biến chiếm 83,3% Ở bệnh nhân Parkinson có đột biến, phân tích cho thấy có đột biến thay nucleotid exon exon 16 làm thay đổi trình tự mã hóa acid amin, đột biến vị trí cắt nối intron 39 làm dịch chuyển khung dịch mã, đột biến xóa đoạn intron 18 TÀI LIỆU THAM KHẢO Rui Q, Ni H, Li D, Gao R, Chen G The Role of LRRK2 in Neurodegeneration of Parkinson Disease Current neuropharmacology 2018; 16(9):1348-1357 doi:10.2174/1570159x16666 180222165418 24 Dorsey ER, Constantinescu R, Thompson JP, et al Projected number of people with Parkinson disease in the most populous nations, 2005 through 2030 Neurology Jan 30 2007;68(5):384-6 doi: 10.1212/01.wnl.0000 247740.47667.03 Fahn S, Sulzer D Neurodegeneration and neuroprotection in Parkinson disease NeuroRx: the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics Jan 2004; 1(1):139-54 doi: 10.1602/neurorx.1.1.139 Lê Đức Hinh Bệnh Parkinson Nhà xuất Y học; 2001 Nuytemans K, Theuns J, Cruts M, Van Broeckhoven C Genetic etiology of Parkinson disease associated with mutations in the SNCA, PARK2, PINK1, PARK7, and LRRK2 genes: a mutation update Human mutation Jul 2010;31(7):763-80 doi: 10.1002/humu.21277 Healy DG, Falchi M, O’Sullivan SS, et al Phenotype, genotype, and worldwide genetic penetrance of LRRK2-associated Parkinson’s disease: a case-control study The Lancet Neurology Jul 2008;7(7):583-90 doi: 10.1016/ s1474-4422(08)70117-0 Houlden H, Singleton AB The genetics and neuropathology of Parkinson’s disease Acta neuropathologica Sep 2012;124(3):32538 doi: 10.1007/s00401-012-1013-5 Nhữ Đình Sơn Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng số yếu tố nguy bệnh Parkinson Tạp chí Y Dược học Quân 2004;(2) Hu ZX, Peng DT, Cai M, et al A study of six point mutation analysis of LRRK2 gene in Chinese mainland patients with Parkinson’s disease Neurological sciences: official journal of the Italian Neurological Society and of the Italian Society of Clinical Neurophysiology Aug 2011;32(4):741-2 doi: 10.1007/s10072-010-04 53-8 10 Sokalingam S, Raghunathan G, TCNCYH 151 (3) - 2022 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Soundrarajan N, Lee SG A study on the effect of surface lysine to arginine mutagenesis on protein stability and structure using green fluorescent protein PloS one 2012;7(7):e40410 doi: 10.13 71/journal.pone.0040410 11 Nguyễn Thanh Bình Đặc điểm triệu chứng vận động vận động bệnh nhân parkinson Tạp chí Y học thực hành 2017;1053(8) 12 Trần Văn Chung Một số đặc điểm dịch tễ học lâm sàng hội chứng/bệnh Parkinson người cao tuổi quận Đống Đa Hai Bà Trưng, Hà Nội Tạp chí Y học thực hành 2010;713(4) Summary IDENTIFYING MUTATION IN LRRK2 GENE IN PARKINSON’S PATIENTS Leucine-rich repeat kinase (LRRK2) is a large gene on chromosome 12, spanning a genomic distance of 144 kb and containing 51 exons that encode 2527 amino acids for the initiation of translation in cell Mutations of LRRK2 occur approximately in - 10% of Parkinson’s patients who had family history and autosomal dominant inheritance, and in 3.6% of patients with no family history When expressed, LRRK2 is a large, multidomain protein with scattered pathogenic mutations spanning the entire genome The purpose of the research is to identify mutations in LRRK2 gene of 30 Parkinson’s patients by direct genomic sequencing The patients were recruited from the National Geriatric Hospital The average age was 55.9 ± 9.5 years, and the ratio of male/female was 1.14 Mutations were detected in 16.7% of the patients; the remaining 83.3% did not have any detectable mutations Keywords: Parkinson’s disease, mutation, LRRK2 gene TCNCYH 151 (3) - 2022 25 ... thấy đột biến bệnh nhân có bệnh nhân có đột biến vùng exon (cụ thể bệnh nhân mang đột biến exon bệnh nhân mang đột biến exon 16), bệnh nhân có đột biến vùng intron intron 18 intron 39 Tất đột biến. .. nhân mang đột biến tìm thấy loại đột biến khác bệnh nhân mang đột biến Thông tin bệnh nhân mang đột biến loại đột biến trình bày bảng Bảng Đặc điểm thông tin bệnh nhân có đột biến đột biến tìm... bệnh nhân giai đoạn V Đặc điểm đột biến số exon gen LRRK2 bệnh nhân Parkinson Cả 30 bệnh nhân nghiên cứu xác định đột biến gen LRRK2 phương pháp giải trình tự gen Sanger Cụ thể có 5/30 bệnh nhân