Glocom bẩm sinh nguyên phát là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường gây nên do đột biến gen CYP1B1, là gen đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành cấu trúc và duy trì chức năng của vùng bè nhãn cầu. Bệnh nhân mang đột biến gen CYP1B1 90% sẽ biểu hiện bệnh ở cả hai mắt và là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây mù lòa ở trẻ nhỏ.
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TẠI VÙNG TRỌNG ĐIỂM TRÊN GEN CYP1B1 Ở BỆNH NHÂN GLOCOM BẨM SINH NGUYÊN PHÁT Trần Thu Hà1, Trần Huy Thịnh1,Vũ Thị Bích Thủy2, Trần Vân Khánh1 Trường Đại học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Mắt Trung ương Glocom bẩm sinh nguyên phát bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường gây nên đột biến gen CYP1B1, gen đóng vai trò quan trọng việc hình thành cấu trúc trì chức vùng bè nhãn cầu Bệnh nhân mang đột biến gen CYP1B1 90% biểu bệnh hai mắt nguyên nhân hàng đầu gây mù lòa trẻ nhỏ Việc phát đột biến gen CYP1B1 bệnh nhân glocom bẩm sinh nguyên phát tiền đề quan trọng giúp phát người lành mang gen bệnh chẩn đoán trước sinh nhằm giảm tỷ lệ mù lòa trẻ Đột biến gen CYP1B1 thường đột biến điểm gặp nhiều exon exon Nghiên cứu thực nhằm bước đầu xác định đột biến exon exon gen CYP1B1 bệnh nhân glocom bẩm sinh nguyên phát 12 bệnh nhân chẩn đoán mắc bệnh glocom bẩm sinh nguyên phát lựa chọn vào nghiên cứu Kỹ thuật giải trình tự gen áp dụng để xác định đột biến exon exon gen CYP1B1 Kết cho thấy phát 4/12 bệnh nhân có đột biến dị hợp tử Gln86Lys exon 2, bệnh nhân có đột biến Gln86Lys đơn bệnh nhân có đột biến Gln86Lys kết hợp với số đa hình thái gen-SNP (Arg48Gly,Ala119Ser exon Leu432Val, Asn453Ser exon 3) Đột biến Gln86Lys exon đột biến chưa công bố, SNP cơng bố Từ khóa: bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát, gen CYP1B1, đột biến gen I ĐẶT VẤN ĐỀ người mang đột biến gen CYP1B1 biểu Glocom bẩm sinh nguyên phát tình trạng bệnh hai mắt với mức độ khác tăng nhãn áp phát triển bất thường [4] Đột biến gen CYP1B1 chủ yếu đột bán phần trước nhãn cầu Bệnh thường xảy biến điểm nằm rải rác toàn chiều dài hai mắt (65 - 80%), xuất sớm gen; tỉ lệ phát đột biến CYP1B1 từ năm đầu sau sinh mang tính đặc trưng cho chủng tộc, nguyên nhân nguy hiểm gây mù lòa Châu Á khoảng 30% [5 - 8] trẻ nhỏ [1; 2] Ở Việt Nam, hàng năm có số lượng lớn Từ năm 1970, glocom bẩm sinh trẻ sinh bị bệnh glocom bẩm sinh nguyên nguyên phát xác định thể phát bệnh thường phát muộn, bệnh glocom di truyền lặn liên kết nhiễm sắc phương pháp định không đúng, trẻ thường, phổ biến trẻ em [3] Năm 2012, theo dõi hay tư vấn di truyền không hiệu nghiên cứu 90% [9] Việc phát đột biến gen CYP1B1 bệnh nhân glocom bẩm sinh nguyên phát Địa liên hệ: Trần Vân Khánh, Trung tâm Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội Email: tranvankhanh@hmu.edu.vn Ngày nhận: 21/12/2016 Ngày chấp thuận: 26/2/2017 TCNCYH 106 (1) - 2017 làm sở cho việc triển khai chẩn đoán trước sinh liệu pháp điều trị gen, đồng thời giúp quản lý tốt người mang gen gây bệnh nhằm giảm tỷ lệ mù lòa trẻ 79 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Theo tổng kết năm 2010, 52 nghiên cứu giới có tới 99,8% đột biến phát exon exon gen CYP1B1 Phương pháp Lấy mẫu bệnh phẩm: ml máu tĩnh mạch chống đơng EDTA [10] Vì nghiên cứu tiến hành giải trình tự gen CYP1B1 exon exon nhằm: bước đầu xác định đột biến gen CYP1B1 exon exon gen CYP1B1 bệnh nhân glocom bẩm sinh nguyên phát Tách chiết DNA từ máu ngoại vi: DNA tổng số tách chiết từ máu toàn phần phenol - chloroform - isopropanol (25:24:1) Kỹ thuật PCR: PCR sử dụng để khuếch đại exon exon gen CYP1B1 với cặp mồi thiết kế [12] II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng Tiêu chuẩn lựa chọn: 12 bệnh nhân chẩn đoán mắc bệnh glocom bẩm sinh nguyên phát Bệnh viện Mắt Trung ương bệnh nhân tuổi Bệnh nhân chẩn đoán xác định bệnh glocom bẩm sinh nguyên phát có từ triệu chứng trở lên [11]: Thành phần phản ứng PCR (thể tích 20μl) gồm: 1X đệm PCR; 2,5mM dNTP, 0,2μM mồi xuôi ngược, 0,5U Taq polymerase, 20 50ng DNA Chu trình nhiệt phản ứng PCR: 94oC/5 phút, 35 chu kỳ [94oC/40 giây, 54oC/30 giây, 72oC/45 giây], 72oC/7 phút Bảo quản mẫu 15oC Kỹ thuật giải trình tự gen - Nhãn áp cao ≥ 25 mmHg (Nhãn áp kế Các sản phẩm PCR tiến hành giải Maclakov) ≥ 22 mmHg (Nhãn áp kế trình tự trực tiếp máy ABI 3100 Genetic Icare) Analyzer Kết thu thập xử lý - Chói, chảy nước mắt, sợ ánh sáng - Đường kính giác mạc to bất thường ≥ 12 mm - Giác mạc phù, mờ đục - Tiền phòng sâu, góc tiền phòng có tổ chức bất thường - Tổn hại lõm teo gai thị bệnh glocom phần mềm ABI PRISM TM 3100 – Avant Data Collection, DNA Sequencing Analysis 5.2 BLAST NCBI Trình tự so sánh ngân hàng gen: DNA (NG- 008806) mRNA (NM- 000053) Đạo đức nghiên cứu Nghiên cứu tuân thủ chặt chẽ quy định đạo đức nghiên cứu Y sinh học Bệnh nhân gia đình bệnh nhân hồn tồn tự Tiêu chuẩn loại trừ: Glocom bẩm sinh thứ nguyện tham gia vào nghiên cứu có quyền phát, tổn thương giác mạc, hội chứng rút lui khỏi nghiên cứu thời điểm tách lớp bán phần trước (Axenfeld, Reiger, Bệnh nhân gia đình thơng báo kết Peters); Tổn thương mống mắt: tật không xét nghiệm gen để giúp cho bác sỹ tư mống mắt, tồn lưu màng Wachendorf; Dị vấn di truyền lựa chọn phác đồ điều trị thường thể thủy tinh: hội chứng Lowe, Marfan, phù hợp Các thông tin cá nhân đảm Machesani bảo bí mật 80 TCNCYH 106 (1) - 2017 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC III KẾT QUẢ khơng có ý nghĩa thống kê Tuổi trung bình phát bệnh 9,6 ± 2,1 tháng tuổi 100% Đặc điểm lâm sàng bệnh nhân nghiên bệnh nhân nghiên cứu đảm bảo tiêu cứu chuẩn chẩn đoán bệnh glocom bẩm sinh Nghiên cứu tiến hành 12 bệnh nhân ngun phát điển hình, bệnh bệnh nhân nam (58,3%) nhân phát đột biến có đặc điểm bệnh nhân nữ (41,7%) Sự khác biệt giới lâm sàng sau: Bảng Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng bệnh nhân Mã số bệnh nhân Triệu chứng G01.00 G02.00 G03.00 G04.00 Nhãn áp cao + + + + Chói, chảy nước mắt, sợ ánh sáng + + + + Đường kính giác mạc to + + + + Giác mạc phù, mờ đục + + + + Bất thường tiền phòng - - - - Tổn hại lõm teo gai thị bệnh glocom - + + + Kết xác định khuếch đại exon exon gen CYP1B1 Sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho exon exon gen CYP1B1 để khuyếch đại DNAsau tách chiết từ mẫu máu bệnh nhân Hình hình ảnh PCR đại diện khuếch đại exon gen CYP1B1 MK 800bp Hình Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại exon 2, gen CYP1B1 (+) mẫu đối chứng; (1 - 6) mẫu bệnh nhân; (MK) Marker Kết hình cho thấy, sản phẩm PCR thu có băng đặc hiệu, rõ nét, kích thước 800 bp, khơng có sản phẩm phụ Sản phẩm PCR đảm bảo cho phản ứng giải trình tự để phát đột biến điểm Kết xác định đột biến gen CYP1B1 Sản phẩm PCR giải trình tự gen để phát đột biến Kết cho thấy phát 4/12 bệnh nhân có đột biến dị hợp tử Gln86Lys exon 2, bệnh nhân có đột TCNCYH 106 (1) - 2017 81 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC biến Gln86Lys đơn bệnh nhân có đột biến Gln86Lys kết hợp với số đa hình thái gen - SNP (Arg48Gly, Ala119Ser exon Leu432Val, Asn453Ser exon 3) Bảng Kết xác định đột biến gen CYP1B1 STT Mã số Exon G01.00 2 G02.00 Đột biến Thể đột biến Chú thích Tài liệu cơng bố Gln86Lys Dị hợp New Gln86Lys Arg48Gly, Dị hợp Dị hợp New SNP Ivaylo Stoilov, (1998) Ala119Ser Dị hợp SNP Ivaylo Stoilov, (1998) Gln86Lys Dị hợp New Leu432Val Dị hợp SNP Gln86Lys Dị hợp New Asn453Ser Dị hợp SNP G03.00 Ivaylo Stoilov, (1998) G04.00 Ivaylo Stoilov, (1998) New: Đột biến mới; SNP: Single Nucleotide Polymorphism (đa hình đơn nucleotid) Kết bảng cho thấy bệnh nhân có đột biến Gln86Lys exon kết hợp với số SNP exon exon cơng bố Người bình thường Bệnh nhân mã số G02.00 Hình Hình ảnh giải trình tự gen CYP1B1 bệnh nhân mã số G02.00 82 TCNCYH 106 (1) - 2017 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Kết cho thấy, bệnh nhân mã số G02.00 có đột biến phát dạng dị hợp tử Gln86Lys exon kết hợp với SNP công bố trước Arg48Gly Ala119Ser exon IV BÀN LUẬN Bệnh glocom bẩm sinh nguyên phát liệu đột biến phát đa bệnh di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể hình thái gen, nghiên cứu tiến hành phân thường, phổ biến trẻ em Khoảng 90% trẻ tích 50 mẫu DNA người bình thường, mang đột biến gen CYP1B1 biểu bệnh kết khơng phát người có hai mắt với mức độ khác dẫn đột biến Gln86Lys exon Bên cạnh đó, đến mù lòa khơng chẩn đốn nghiên cứu tìm dạng đa hình thái điều trị kịp thời Ở Việt Nam, hàng năm số bố năm 1998 Arg48Gly lượng lớn trẻ sinh bị bệnh thường đến viện Ala119Ser giai đoạn muộn với nhiều tổn thương phức tạp Asn453Ser exon Những đột biến biến chứng nặng nề Tuy nhiên, hầu hết nằm vùng chức protein nghiên cứu đề cập tỉ lệ mắc bệnh, CYP1B1 [12] exon Leu432Val, biểu lâm sàng, kết điều trị Trong số bệnh nhân mang đột biến mới,1 biến chứng bệnh Việc phát đột biến bệnh nhân mang đột biến Gln86Lys đơn gen CYP1B1 bệnh nhân glocom bẩm sinh bệnh nhân phối hợp với dạng đa nguyên phát làm sở cho việc triển khai hình thái Tất đột biến dạng chẩn đoán trước sinh liệu pháp điều dị hợp tử, điều giải thích bệnh nhân trị gen, đồng thời giúp quản lý tốt mang đột biến dù dạng dị hợp người mang gen gây bệnh nhằm giảm tỷ lệ vùng chức tổng hợp gen phối hợp mù lòa trẻ Đột biến gen CYP1B1 chủ yếu nhiều đột biến dị hợp tạo hiệu ứng đột biến điểm nằm rải rác toàn chiều cộng hưởng gây bệnh glocom bẩm sinh dài gen; tỉ lệ phát Châu Á khoảng 30% nguyên phát Do chưa phân tích hết toàn Theo tổng kết năm 2010, 52 nghiên cứu chiều dài gen nên 8/12 bệnh nhân chưa phát báo cáo phát 542 bệnh nhân đột biến mang 147 loại đột biến khác gen Về tần suất mắc dạng đột biến khác CYP1B1 Trong số 1007 đột biến phát quốc gia chủng tộc có đột biến vùng khơng mã hóa giới, tác giả đưa kết luận, đột biến thuộc exon 1; 489 đột biến phát thay acid amin (missense) loại đột biến exon 516 đột biến phát exon hay gặp Theo nghiên cứu Úc, tỷ [10] Vì vậy, nghiên cứu bước đầu tiến lệ khoảng 72,7% tổng số đột biến phát hành giải trình tự exon exon 3, vùng Một nghiên cứu khác Hoa Kỳ lại có đột biến thường gặp gen CYP1B1 đột biến thay acid amin gặp Nghiên cứu phát 4/12 bệnh 33,3% trường hợp Theo nghiên nhân có đột biến Gln86Lys exon 2, cứu Châu Á, tỷ lệ đột biến loại cao hơn, đột biến chưa công bố Để xác định dao động khoảng từ 60% đến 97% tổng TCNCYH 106 (1) - 2017 83 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC số đột biến gen CYP1B1 cụ thể Nhật 66,8%; Indonesia 62,5%; Ả rập 96,5% Iran 90% Ngoài số dạng đột Robert N Weiss, Shaffer., Daniel I (1970) Congenital and pediatric glaucomas, Mosby, St Louis, 37 biến vô nghĩa hay thêm nucleotide [10] Trong A O Khan, M A Aldahmesh, J Y Mohamed (2012) CYP1B1 analysis of unilateral primary newborn glaucoma in Saudi nghiên cứu này, đột biến tìm children J AAPOS, 16(6), 571 - 572 biến khác tìm thấy tỷ lệ thấp đột biến xóa đoạn, lặp đoạn, đột dạng thay nucleotide dẫn đến biến đổi Mei Yang, Xiangming Guo, Xing Liu acid amin Tuy nhiên, nghiên (2009) Investigation of CYP1B1 mutations in Chinese patients with primary congenital cứu bước đầu, cần có nghiên cứu để đưa số liệu cụ thể vấn đề V KẾT LUẬN glaucoma, Mol Vis, 15, 432 - 437 Ji Hyun Lee., Chang-Seok Ki., HeeJung Kim (2011) Analysis of copy number variation using whole genome exon - focused Nghiên cứu phát 4/12 bệnh array CGH in Korean patients with primary nhân có đột biến dị hợp tử Gln86Lys exon congenital glaucoma Mol Vis, 17, 3583 3590 2, bệnh nhân có đột biến Gln86Lys đơn bệnh nhân có đột biến - SNP (Arg48Gly, Ala119Ser exon Mukesh Tanwar, Tanuj Dada, Ramanjit Sihota (2009).Mutation spectrum of CYP1B1 in North Indian congenital glaucoma Leu432Val, Asn453Ser exon 3) patients Mol Vis, 15, 1200 – 1209 Gln86Lys kết hợp với số đa hình thái gen Đột biến Gln86Lys exon đột biến chưa công bố Lời cảm ơn Nghiên cứu thực với hỗ trợ kinh phí đề tài cấp Sở Khoa học Cơng nghệ Hà Nội “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử xác định đột biến gen Fuse N., Miyazawa A., Takahashi K (2010) Mutation spectrum of the CYP1B1 gene for congenital glaucoma in the Japanese population Jpn J Ophthalmol, 54(1), - Nguyễn Như Quang (1982) Đặc điểm lâm sàng bệnh glôcôm bẩm sinh phẫu thuật cắt bè củng mạc Nhãn khoa, 1, 65 - 70 10 Ni Li, Yong Zhou, Liang Du (2011) CYP1B1 bệnh glocom bẩm sinh nguyên phát Hà Nội” giúp đỡ cán Overview of Cytochrome P450 1B1 gene Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, Trường glaucoma Experimental Eye Research, 93, Đại học Y Hà Nội 572 - 579 TÀI LIỆU THAM KHẢO Shields M B (1982) Primary congenital glaucoma, Third edition, Williams and Wilkins, USA, 220 - 233 Thylefors B., Negrel A D (1994) The global impact of glaucoma Bull WHO, 72, 323 - 326 84 mutations in patients with primary congenital 11 T S Dietlein, P C Jacobi., G K Krieglstein (1999) Prognosis of primary ab externo surgery for primary congenital glaucoma Br J Ophthalmol, 83(3), 317 - 322 12 Stoilov I., Akarsu A N., Alozie I (1998) Sequence analysis and homology modeling suggest that primary congenital glaucoma on 2p21 results from mutations TCNCYH 106 (1) - 2017 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC disrupting either the hinge region or the conserved core structures of cytochrome P4501B1, Am J Hum Genet, 62, 573 - 584 Summary MUTATION ANALYSIS IN HOTSPOTS REGION OF CYP1B1 GENE IN PATIENTS WITH PRIMARY CONGENITAL GLAUCOMA Primary congenital glaucoma is an autosomal recessive inherited disease caused by mutations in the CYP1B1 gene which plays an important role in the modulation of development and functions of the trabecular meshwork About 90% of patients with CYP1B1 gene mutation will express the disease in both eyes and cause childhood blindness The mutation detection, carrier detection, and prenatal diagnosis are effective solutions for prevention and reduction of childhood blindness Point mutation is the most common in the CYP1B1 gene and usually located in exon and exon The purpose of this study was to identify the mutation in exon and exon of CYP1B1 gene features of primary congenital glaucoma 12 patients with confirmed primary congenital glaucoma were selected for this study Direct sequencing was applied to identify mutation in exon and exon of CYP1B1 gene The results showed that 4/12 patients carrying novel heterozygous Gln86Lys mutation in exon 2, in which patient carrying single Gln86Lys mutation and patients carrying Gln86Lys mutation combined with others SNPs in exon (Arg48Gly, Ala119Ser) or exon (Leu432Val, Asn453Ser) of CYP1B1 gene Gln86Lys in exon was a novel mutation, whereas SNPs had been reported in other studies Keywords: primary congenital glaucoma, CYP1B1 gene, mutation TCNCYH 106 (1) - 2017 85 ... để phát đột biến điểm Kết xác định đột biến gen CYP1B1 Sản phẩm PCR giải trình tự gen để phát đột biến Kết cho thấy phát 4/12 bệnh nhân có đột biến dị hợp tử Gln86Lys exon 2, bệnh nhân có đột. .. bệnh nhân nghiên bệnh nhân nghiên cứu đảm bảo tiêu cứu chuẩn chẩn đoán bệnh glocom bẩm sinh Nghiên cứu tiến hành 12 bệnh nhân nguyên phát điển hình, bệnh bệnh nhân nam (58,3%) nhân phát đột biến. .. cứu chiều dài gen nên 8/12 bệnh nhân chưa phát báo cáo phát 542 bệnh nhân đột biến mang 147 loại đột biến khác gen Về tần suất mắc dạng đột biến khác CYP1B1 Trong số 1007 đột biến phát quốc gia