XÂY DỰNG PHẢ hệ BỆNH NHÂN GLÔCÔM bẩm SINH NGUYÊN PHÁT MANG đột BIẾN GEN CYP1B1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI ĐỖ THỊ HƯƠNG LAN XÂY DỰNG PHẢ HỆ BỆNH NHÂN GLÔCÔM BẨM SINH NGUYÊN PHÁT MANG ĐỘT BIẾN GEN CYP1B1 LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI ĐỖ THỊ HƯƠNG LAN XÂY DỰNG PHẢ HỆ BỆNH NHÂN GLÔCÔM BẨM SINH NGUYÊN PHÁT MANG ĐỘT BIẾN GEN CYP1B1 Chuyên ngành: Hóa sinh Mã số : 60720106 LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Huy Thịnh HÀ NỘI - 2018 LỜI CẢM ƠN Trước hết xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến PGS.TS Trần Huy Thịnh - người Thầy trực tiếp hướng dẫn , tận tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu kiến thức cho tơi q trình học tập hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Vân Khánh, Phó Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà nội, Chủ nhiệm đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử xác định đột biến gen CYP1B1 bệnh Glôcôm bẩm sinh nguyên phát Hà Nội” cho phép tham gia nghiên cứu, tạo điều kiện giúp đỡ dẫn tận tình suốt q trình tơi hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn sâu sắc tới GS.TS Tạ Thành Văn, Phó Hiệu trưởng Trường Đại học Y Hà Nội, Chủ nhiệm Bộ môn Hóa sinh, Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ tơi học tập hồn thành luận văn Tơi xin ghi nhớ động viên, giúp đỡ nhiệt tình Thầy, Cô, cán Bộ môn Hóa sinh Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội suốt trình thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại Học Trường Đại Học Y Hà Nội tạo điều kiện giúp học tập thực luận văn Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2018 Học viên Đỗ Thị Hương Lan LỜI CAM ĐOAN Tôi Đỗ Thị Hương Lan, học viên Cao học Hóa sinh khóa 25, Trường Đại học Y Hà Nội, xin cam đoan: Đây luận văn thân trực tiếp thực với hướng dẫn PGS TS Trần Huy Thịnh Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thơng tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nghiên cứu Tơi xin hồn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam đoan Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2018 Người cam đoan Đỗ Thị Hương Lan DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT A Adenin C Cytosin CYP1B1 Cytochrome P450, family 1, subfamily B, polypeptide DNA Deoxyribonucleotid acid dNTP Deoxyribonucleotid 5’- triphosphat EDTA Ethylen Diamin Tetraacetic Acid G Guanin NADP Nicotinamid Adenin Dinucleotid Phosphat NST Nhiếm sắc thể PCR Polymerase Chain Reaction PCG Primary congenital glaucoma POAG Primary open-angle glaucoma JOAG Juvenile open-angle glaucoma T Thymin TE tri – EDTA MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát .3 1.1.1 Khái niệm glôcôm bẩm sinh 1.1.2 Dịch tễ học glôcôm bẩm sinh nguyên phát 1.1.3 Cơ chế bệnh sinh tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh 1.1.4 Điều trị glôcôm bẩm sinh nguyên phát 1.2 Cơ chế bệnh học phân tử .8 1.2.1 Cấu trúc vị trí gen CYP1B1 .10 1.3 Tình hình nghiên cứu giới Việt Nam 14 1.4 Phương pháp phát đột biến gen CYP1B1 22 1.4.1 Phương pháp PCR 22 1.4.2 Phương pháp giải trình tự gen 24 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .26 2.1 Đối tượng nghiên cứu 26 2.3 Phương pháp nghiên cứu 27 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 27 2.3.2 Sơ đồ nghiên cứu 28 2.3 Nội dung nghiên cứu 28 2.3.1 Xác định đột biến gen CYP1B1 bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát 28 2.3.2 Xây dựng phả hệ gia đình bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát mang đột biến gen CYP1B1 29 2.4 Phương tiện nghiên cứu 29 2.4.1 Dụng cụ, trang thiết bị 29 2.4.2 Hoá chất 30 2.4.3 Nội dung nghiên cứu 31 2.5 Các bước tiến hành .31 2.5.1 Chẩn đoán lựa chọn bệnh nhân 31 2.5.2 Quy trình tách chiết DNA từ máu ngoại vi 31 2.5.3 Quy trình kỹ thuật PCR để khuyếch đại DNA .34 2.5.4 Giải trình tự gen máy giải trình tự tự động 36 2.5.5 Xác định đột biến gen CYP1B1 36 2.6 Xây dựng phả hệ gia đình bệnh nhân glơcơm bẩm sinh ngun phát mang đột biến gen CYP1B1 36 2.7 Vấn đề đạo đức nghiên cứu .36 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 38 3.1 Đặc điểm nhóm nghiên cứu 38 3.2 Kết phân tích đột biến gen CYP1B1 39 3.1.1 Kết tách chiết DNA .39 3.2.2 Kết xác định đột biến gen CYP1B 40 3.2.3 Kết phả hệ gia đình bệnh nhân 47 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 53 4.1 Kết phát đột biến gen bệnh nhân 53 4.1.1 Tỷ lệ phát đột biến 53 4.1.2 Các dạng đột biến 54 4.2 Biện luận kết phát đột biến gen CYP1B1 gia đình 64 4.2.1 Biện luận kết gia đình mã số G04 64 4.2.2 Biện luận kết gia đình số mã số G09 .64 4.2.3 Biện luận kết gia đình số mã số G12 .65 4.2.3 Phân tích kết gia đình số mã số G18 65 KẾT LUẬN 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Sự di truyền thành viên 24 gia đình Saudi Arabian 16 Bảng 1.2 Phân bố loại đột biến CYP1B1 toàn giới .17 Bảng 2.1 Trình tự mồi dùng cho phản ứng PCR .34 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 35 Bảng 3.1 Phân bố tuổi khởi phát 38 Bảng 3.2 Phân bố giới tính 39 Bảng 3.3 Kết phát đột biến gen CYP1B1 41 Bảng 3.4 Tỷ lệ đột biến gen CYP1B1 .42 Bảng 4.1 Tỷ lệ đột biến gen CYP1B1 tác giả khác 54 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Dấu hiệu lâm sàng glơcơm bẩm sinh ngun phát .5 Hình 1.2 Minh họa dấu hiệu tăng nhãn áp Hình 1.3 Hình ảnh siêu âm Hình 1.4 Cơ chế di truyền bệnh gen lặn NST thường Hình 1.6 Vị trí gen CYP1B1 nhánh ngắn nhiễm sắc thể 11 Hình 1.7 Minh họa cấu trúc gen CYP1B1 11 Hình 1.8 Sơ đồ minh họa chế ảnh hưởng đột biến gen CYP1B1 13 Hình 1.9 Các bước phản ứng PCR 23 Hình 1.10 Phương pháp giải trình tự gen 25 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 28 Hình 2.2 Một số ký hiệu dùng để lập phả hệ .29 Hình 3.1 Mật độ quang kiểm tra nồng độ DNA mẫu G09 39 Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR exon2 mồi 40 Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR exon .40 Hình 3.4 Hình ảnh đột biến p.Q86K bệnh nhân G04 42 Hình 3.5 Hình ảnh SNP p.A119S bệnh nhân G04 .43 Hình 3.6 Hình ảnh đột biến p.Q86K bệnh nhân G09 43 Hình 3.7 Hình ảnh đột biến p.G61E bệnh nhân G12 43 Hình 3.8 Hình ảnh đột biến p.L27Q bệnh nhân G12 44 Hình 3.9 Hình ảnh đột biến p.G36D bệnh nhân G12 44 Hình 3.10 Hình ảnh đột biến p.E229K bệnh nhân G18 45 Hình 3.11 Hình ảnh đột biến p.D218H bệnh nhân G18 45 Hình 3.12 Hình ảnh SNP p.R48G bệnh nhân G13 46 Hình 3.13 Hình ảnh SNP p.A119S bệnh nhân G13 .46 Hình 3.14 Hình ảnh SNP p.L432V bệnh nhân G19 46 Hình 3.15 Sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhân mã số G04 .47 Hình 3.16 Hình ảnh giải trình tự gia đình bệnh nhân G04 48 Hình 3.17 Sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhân mã số G09 .49 Hình 3.18 Hình ảnh giải trình tự gia đình bệnh nhân G09 50 Hình 3.19 Sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhân mã số G12 .50 Hình 3.20 Hình ảnh giải trình tự gia đình bệnh nhân G12 51 Hình 3.22 Hình ảnh giải trình tự gia đình bệnh nhân G18 52 Hình 4.1 Hình minh họa bảo tồn glycin lồi 55 Hình 4.2 Hình ảnh phần mềm dự đoán đột biến p.L27Q 57 Hình 4.3 Hình ảnh phần mềm dự đốn đột biến p.Q86K 59 Hình 4.5 Hình ảnh phần mềm dự đoán đột biến p.D218H 61 Hình 4.6 Minh họa vị trí đột biến p.G61E p.E229K .63 60 61 Hình 4.5 Hình ảnh phần mềm dự đoán đột biến p.D218H http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/ * Đột biến p.E229K: đột biến missense, dị hợp tử Đột biến phát bệnh nhân mã số G18 Nucleotid guanin (T) thay nucleotid adenin (A) vị trí genome 6398, dẫn đến thay đổi codon GAA thành AAA Điều làm cho acid amin glutamic (E) bị thay acid amin lysin (K) vị trí acid amin 229 exon Đột biến p.E229K xem đột biến phổ biến nhất: (p.G61E,p P193L,p.Ter@223,p.E229K,p R368H p.R390C) theo tác giả Mukesh Tanwar (2009) [6] Đột biến tác giả Ni Li thống kê số đột biến phổ biến cộng đồng người da trắng [33] Đột biến mô tả lần bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát Đức liên kết với biến thể p.A443G bệnh nhân 62 (Michels-Rautenstrauss- 2001) Tuy nhiên, trạng thái gây bệnh A443G chưa công bố [75] P.E229K báo cáo alen đột biến bệnh nhân PCG Thổ Nhĩ Kỳ [76], p E229K xác định trạng thái dị hợp tử hai bệnh nhân Pháp bị bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát [61], bệnh nhân Ấn Độ [72], bệnh nhân da trắng [71] Theo báo cáo tác giả Colomb Evelyne bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát, đột biếnp E 229K trạng thái dị hợp tử , phân tích chuỗi cẩn thận vùng mã hóa bệnh nhân khơng cho thấy đột biến khác Đột biến làm thay đổi vị trí tiến hóa bảo tồn chuỗi CYP1B1 [61] Đột biến p.E229K dị hợp tử tìm thấy nghiên cứu tác giả Michels-Rautenstrauss KG [75] Tác giả xác định đột biến p.E229K đột biến gây bệnh Tác giả Choudhary D phân tích, vị trí acid amin 229 nằm vùng quan trọng, góp phần vào cấu trúc ba chiều protein Đột biến xảy đầu tận COOH F-xoắn vùng lân cận vùng kết dính đế (SBR) Thay acid glutamic acid amin lysin dẫn đến thay đổi từ dư lượng tích điện âm cho chuỗi bên tích điện dương điều ảnh hưởng đến phân phối cục Đột biến làm rối loạn cụm cầu mối quan trọng Trong kiểu hoang dã (WT), R-194 :: E-229, R-194 :: D-333 D-333 :: K-512 tạo thành tam giác tương tác trái phiếu ion, giữ I-xoắn với F-xoắn sợi S3.2 Do đột biến này, tương tác R-194 :: E-229 bị có khả làm ổn định tương tác ion khác protein [77] Một báo cáo thứ hai xác định p.E229K alen hypomorphic (allen giảm hình) đề xuất đột biến hoạt động alen nguy cơ, dẫn đến phát triển bệnh tăng nhãn áp với diện gen sửa đổi ảnh hưởng môi trường [ 62] Đột biến tìm 63 thấy làm giảm ổn định protein, p.E229K tác động đến khả chuyển hóa chất [77] Hình 4.6 Minh họa vị trí đột biến p.G61E p.E229K [86] * Ba đa hình đơn gen phát bệnh nhân nghiên cứu chúng tôi., gồm đa hình đơn p.R48G (g.5855C>G); p.A119S (g.6068G>T); p L432V g.10042C>G Các đa hình báo cáo Ivaylor R Stoilov [27], [56], [64] Chúng phát bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát Nhật nghiên cứu tác giả Yukihiko Mashima (2001) [78] Tác giả thấy rằng, R48G A119S tìm thấy Ivaylor R Stoilov cho đột biến ảnh hưởng đến việc kết hợp heme, cách ảnh hưởng đến vùng lề / cấu trúc lõi bảo tồn (CCS) để xác định khả gấp liên kết heme phân tử P450 Ngược lại, tất vị trí đa hình bảo tồn nằm ngồi CCS, khơng ảnh hưởng đến chức enzym [56] Tuy nhiên, có số nghiên cứu đề cập đến đa hình p.L432V Theo tác giả Mukhesh Tanwar tất bệnh nhân có đột biến CYP1B1 có tính đa hình p.L432V [12] Nghiên cứu Bhattacharjee A cho rằng protein 64 CYP1B1 với valine vị trí 432 tạo gốc tự nhiều gây tổn thương oxy hóa cho tế bào biểu mô sắc tố võng mạc, p.L432Vnhư alen nhạy cảm cho POAG yếu tố nguy cho bệnh Thế hệ ROS cao Val432 CYP1B1 dẫn đến bệnh tăng nhãn áp [79] Leu432Val báo cáo ảnh hưởng đến tính chất xúc tác CYP1B1 (Li DNvà cộng sự) [80] 4.2 Biện luận kết phát đột biến gen CYP1B1 gia đình 4.2.1 Biện luận kết gia đình mã số G04 Bệnh nhân mã sốG 04, khởi phát bệnh lúc sinh, bị bệnh mắt, dấu hiệu lâm sàng nặng với mức nhãn áp 35mmHg Phân tích trình tự gen bệnh nhân phát đột biến p.Q86K dị hợp tử đa hình đơn p.A119S đồng hợp tử Gia đình bệnh nhân Đơng Anh Hà Nội, tiền sử thai nghén khơng có đặc biệt Gia đình bệnh nhân khơng có người bệnh tăng nhãn áp Bố mẹ anh trai bệnh nhân (10 tuổi) khơng phát đột biến Đa hình đơn p.A119S thể dị hợp tử phát bố bệnh nhân Như vậy, khơng tìm thấy di truyền đột biến p.Q86K gia đình số G04 Có thể đột biến p.Q86K bệnh nhân đột biến sinh Tuy nhiên bệnh nhân mang đột biến ( kiểu gen Aa) di truyền đột biến cho hệ sau Cần tư vấn di truyền cho bệnh nhân trước kết hôn 4.2.2 Biện luận kết gia đình số mã số G09 Bệnh nhân phát bệnh từ tháng tuổi, mức độ bệnh nặng Kết giải trình tự cho thấy bệnh nhân mang đột biến p.Q86K dị hợp tử Tiền sử thai nghén bệnh nhân khơng có đặc biệt Phả hệ gia đình bệnh nhân cho thấy bà nội bố biểu bệnh nên kiểu gen AA Tuy nhiên không phát đột biến p.Q86K bố bệnh nhân Giả thiết đặt ra, có đột biến khác vị trí khơng phát gen khác gây bệnh di truyền từ bà nội sang bố bệnh nhân bệnh nhân P.Q86K đột biến phối hợp gây 65 bệnh bệnh nhân Hai em bệnh nhân khơng phát bệnh, nhiên người lành mang gen, cần kiểm tra để có tư vấn di truyền thích hợp 4.2.3 Biện luận kết gia đình số mã số G12 Bệnh nhân mã số G12, thứ gia đình có anh em trai Hai anh trai bệnh nhân (14 11 tuổi) khơng có biểu bệnh Bệnh nhân khởi phát bệnh từ tháng tuổi, bị bệnh mắt Nhãn áp < 25mmHg Bà nội bệnh nhân sống có tiền sử sống vùng nhiễm Dioxin; mẹ bệnh nhân thời gian mang thai bệnh nhân có sử dụng thuốc trầm cảm Cả ông, bà, bố mẹ bệnh nhân khơng có tiền sử bệnh tăng nhãn áp Phân tích trình tự gen CYP1B1 bố, mẹ bệnh nhân không phát đột biến Vậy, bệnh nhân khơng phát chứng di truyền Có thể bệnh nhân mang đột biến phát sinh Bệnh nhân mang đột biến cần tư vấn di truyền cho bệnh nhân trước kết 4.2.3 Phân tích kết gia đình số mã số G18 Bệnh nhân mã số G18, khởi phát bệnh lúc sinh, bị bệnh mắt, nhãn áp >25mmHg Gia đình bệnh nhân khơng có bị bệnh tăng nhãn áp Em gái bệnh nhân sinh