Huy Thịnh - người Thầy trực tiếp hướng dẫn , tận tình giúp đỡ, truyền đạtnhững kinh nghiệm quý báu và kiến thức cho tôi trong quá trình học tập vàhoàn thành luận văn.Tôi cũng xin bày tỏ
Trang 3Huy Thịnh - người Thầy trực tiếp hướng dẫn , tận tình giúp đỡ, truyền đạtnhững kinh nghiệm quý báu và kiến thức cho tôi trong quá trình học tập vàhoàn thành luận văn.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần VânKhánh, Phó Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y
Hà nội, Chủ nhiệm đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử xác định đột biến gen CYP1B1 trong bệnh Glôcôm bẩm sinh nguyên phát tại Hà Nội” đã cho phép tôi tham gia nghiên cứu, tạo điều kiện giúp đỡ và chỉ
dẫn tận tình trong suốt quá trình tôi hoàn thành luận văn
Tôi cũng xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn sâu sắc tới GS.TS Tạ ThànhVăn, Phó Hiệu trưởng Trường Đại học Y Hà Nội, Chủ nhiệm Bộ môn Hóasinh, Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội
đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi học tập và hoàn thành luận văn
Tôi xin ghi nhớ sự động viên, giúp đỡ nhiệt tình của các Thầy, Cô, cáccán bộ tại Bộ môn Hóa sinh và Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, TrườngĐại học Y Hà Nội trong suốt quá trình tôi thực hiện luận văn
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu, Phòng Đào tạoSau Đại Học Trường Đại Học Y Hà Nội đã tạo điều kiện giúp tôi học tập vàthực hiện luận văn
Hà Nội, ngày 10 tháng 9 năm 2018
Học viên
Đỗ Thị Hương Lan
Trang 4Tôi là Đỗ Thị Hương Lan, học viên Cao học Hóa sinh khóa 25, TrườngĐại học Y Hà Nội, xin cam đoan:
1 Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện với sự hướng dẫncủa PGS TS Trần Huy Thịnh
2 Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đượccông bố tại Việt Nam
3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác,trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ
sở nghiên cứu
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam đoan này
Hà Nội, ngày 10 tháng 9 năm 2018
Người cam đoan
Đỗ Thị Hương Lan
Trang 5PCR Polymerase Chain Reaction
PCG Primary congenital glaucoma
POAG Primary open-angle glaucoma
JOAG Juvenile open-angle glaucoma
Trang 6ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1 Tổng quan về bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát 3
1.1.1 Khái niệm glôcôm bẩm sinh 3
1.1.2 Dịch tễ học glôcôm bẩm sinh nguyên phát 4
1.1.3 Cơ chế bệnh sinh và tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh 4
1.1.4 Điều trị glôcôm bẩm sinh nguyên phát 7
1.2 Cơ chế bệnh học phân tử 8
1.2.1 Cấu trúc và vị trí gen CYP1B1 10
1.3 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam 14
1.4 Phương pháp phát hiện đột biến gen CYP1B1 22
1.4.1 Phương pháp PCR 22
1.4.2 Phương pháp giải trình tự gen 24
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
2.1 Đối tượng nghiên cứu 26
2.3 Phương pháp nghiên cứu 27
2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 27
2.3.2 Sơ đồ nghiên cứu 28
2.3 Nội dung nghiên cứu 28
2.3.1 Xác định đột biến gen CYP1B1 trên bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát 28
2.3.2 Xây dựng phả hệ của gia đình bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát mang đột biến gen CYP1B1 29
2.4 Phương tiện nghiên cứu 29
2.4.1 Dụng cụ, trang thiết bị 29
2.4.2 Hoá chất 30
2.4.3 Nội dung nghiên cứu 31
Trang 72.5.2 Quy trình tách chiết DNA từ máu ngoại vi 31
2.5.3 Quy trình kỹ thuật PCR để khuyếch đại DNA 34
2.5.4 Giải trình tự gen bằng máy giải trình tự tự động 36
2.5.5 Xác định đột biến gen CYP1B1 36
2.6 Xây dựng phả hệ của gia đình bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát mang đột biến gen CYP1B1 36
2.7 Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu 36
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 38
3.1 Đặc điểm nhóm nghiên cứu 38
3.2 Kết quả phân tích đột biến gen CYP1B1 39
3.1.1 Kết quả tách chiết DNA 39
3.2.2 Kết quả xác định đột biến gen CYP1B 40
3.2.3 Kết quả phả hệ các gia đình bệnh nhân 47
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 53
4.1 Kết quả phát hiện đột biến gen trên bệnh nhân 53
4.1.1 Tỷ lệ phát hiện đột biến 53
4.1.2 Các dạng đột biến 54
4.2 Biện luận kết quả phát hiện đột biến gen CYP1B1 trong 4 gia đình 64
4.2.1 Biện luận kết quả gia đình mã số G04 64
4.2.2 Biện luận kết quả gia đình số mã số G09 64
4.2.3 Biện luận kết quả gia đình số mã số G12 65
4.2.3 Phân tích kết quả gia đình số mã số G18 65
KẾT LUẬN 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Trang 8Bảng 1.1 Sự di truyền trong các thành viên 24 gia đình Saudi Arabian 16
Bảng 1.2 Phân bố các loại đột biến CYP1B1 trên toàn thế giới 17
Bảng 2.1 Trình tự mồi dùng cho phản ứng PCR 34
Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 35
Bảng 3.1 Phân bố về tuổi khởi phát 38
Bảng 3.2 Phân bố về giới tính 39
Bảng 3.3 Kết quả phát hiện đột biến gen CYP1B1 41
Bảng 3.4 Tỷ lệ đột biến gen CYP1B1 42
Bảng 4.1 Tỷ lệ đột biến gen CYP1B1 của các tác giả khác 54
Trang 9Hình 1.1 Dấu hiệu lâm sàng glôcôm bẩm sinh nguyên phát 5
Hình 1.2 Minh họa dấu hiệu tăng nhãn áp 6
Hình 1.3 Hình ảnh siêu âm 7
Hình 1.4 Cơ chế di truyền bệnh gen lặn trên NST thường 8
Hình 1.6 Vị trí của gen CYP1B1 trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể 2 11
Hình 1.7 Minh họa cấu trúc gen CYP1B1 11
Hình 1.8 Sơ đồ minh họa cơ chế ảnh hưởng của đột biến gen CYP1B1 13
Hình 1.9 Các bước cơ bản của phản ứng PCR 23
Hình 1.10 Phương pháp giải trình tự gen 25
Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 28
Hình 2.2 Một số ký hiệu dùng để lập phả hệ 29
Hình 3.1 Mật độ quang kiểm tra nồng độ DNA mẫu G09 39
Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR exon2 mồi 1 40
Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR exon 3 40
Hình 3.4 Hình ảnh đột biến p.Q86K của bệnh nhân G04 42
Hình 3.5 Hình ảnh SNP p.A119S của bệnh nhân G04 43
Hình 3.6 Hình ảnh đột biến p.Q86K của bệnh nhân G09 43
Hình 3.7 Hình ảnh đột biến p.G61E của bệnh nhân G12 43
Hình 3.8 Hình ảnh đột biến p.L27Q bệnh nhân G12 44
Hình 3.9 Hình ảnh đột biến p.G36D bệnh nhân G12 44
Hình 3.10 Hình ảnh đột biến p.E229K bệnh nhân G18 45
Hình 3.11 Hình ảnh đột biến p.D218H bệnh nhân G18 45
Hình 3.12 Hình ảnh SNP p.R48G bệnh nhân G13 46
Hình 3.13 Hình ảnh SNP p.A119S bệnh nhân G13 46
Hình 3.14 Hình ảnh SNP p.L432V bệnh nhân G19 46
Hình 3.15 Sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhân mã số G04 47
Hình 3.16 Hình ảnh giải trình tự gia đình bệnh nhân G04 48
Trang 10Hình 3.19 Sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhân mã số G12 50
Hình 3.20 Hình ảnh giải trình tự gia đình bệnh nhân G12 51
Hình 3.22 Hình ảnh giải trình tự gia đình bệnh nhân G18 52
Hình 4.1 Hình minh họa sự bảo tồn glycin giữa các loài 55
Hình 4.2 Hình ảnh phần mềm dự đoán đột biến p.L27Q 57
Hình 4.3 Hình ảnh phần mềm dự đoán đột biến p.Q86K 59
Hình 4.5 Hình ảnh phần mềm dự đoán đột biến p.D218H 61
Hình 4.6 Minh họa vị trí đột biến p.G61E và p.E229K 63
Trang 11ĐẶT VẤN ĐỀ
Đột biến gen được xác định là một trong nhiều nguyên nhân gây nênnhiều bệnh, đặc biệt là các bệnh lý di truyền và chuyển hóa Những tổnthương gen thường xảy ra sớm nhất, được lưu giữ trong bộ gen của ngườibệnh và có khả năng truyền lại cho các thế hệ sau Mặc dù không phổ biếnnhư một số nhóm các bệnh lý khác nhưng thực tế hàng năm có một số lượnglớn trẻ sinh ra bị dị tật hoặc mắc các bệnh lý di truyền Đây là nhóm bệnh lýgây rất nhiều khó khăn trong điều trị và để lại hậu quả rất nặng nề về sứckhỏe, tinh thần cũng như chất lượng cuộc sống Y học hiện đại đang từngbước tìm ra phương hướng phát hiện sớm và điều trị can thiệp trúng đíchnhằm giải quyết tận gốc căn nguyên của bệnh
Glôcôm là một bệnh phổ biến trên thế giới cũng như ở Việt Nam, ở hầuhết các nước là nguyên nhân thứ hai gây mù có thể phòng và chữa được, và làmối đe dọa nguy hiểm đối với sức khỏe cộng đồng [1] Bệnh tăng nhãn ápảnh hưởng đến dân số ước tính là 60 triệu người, có từ 1,5 đến 2 triệu trẻ em
mù trên thế giới và phần lớn trong số họ sống ở các nước đang phát triển [2],[3], [4]
Glôcôm bẩm sinh nguyên phát là tình trạng tăng nhãn áp do sự pháttriển bất thường của hệ thống thoát lưu thủy dịch, gây tổn hại đến cấu trúcmắt, dẫn đến mất thị giác Chẩn đoán sớm với tư vấn di truyềnvà điều trị kịpthời có thể cải thiện đáng kể thị lực của trẻ và giảm tỉ lệ mù lòa [5] Đây làbệnh hiếm gặp và là một thử thách chẩn đoán và điều trị cho các bác sĩ nhãnkhoa.Tỷ lệ bệnh thay đổi theo các quốc gia và nhóm dân tộc, khoảng 1/10.000đến 1/70.000 [6], [7]
Glôcôm bẩm sinh nguyên phát là một thể bệnh di truyền lặn liên kếtnhiễm sắc thể thường, phổ biến ở trẻ em [8], [9], [10] Protein CYP1B1 đóng
Trang 12vai trò quan trọng nhất trong việc hình thành cấu trúc và duy trì chức năngcủa mắt Đột biến gen CYP1B1 chủ yếu là đột biến điểm nằm rải rác trên toàn
bộ chiều dài gen; tỉ lệ phát hiện đột biến CYP1B1 cũng mang tính đặc trưngcho từng chủng tộc, ở châu Á khoảng 30% [3], [11], [12], [13], [14]
Trong 5 năm gần đây, ngày càng có nhiều nghiên cứu về phát hiệnngười lành mang gen bệnh trong các thành viên gia đình có quan hệ huyếtthống với bệnh nhân Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam chưa có nhiều nghiêncứu về đột biến gen CYP1B1 trên bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phátđược công bố Việc lập phả hệ để xem xét tính chất đột biến gen di truyềngiúp ích trong chẩn đoán trước sinh, tư vấn di truyền, chẩn đoán bệnh sớm,giúp các bác sĩ lâm sàng kịp thời phát hiện, tăng hiệu quả điều trị và nâng cao
chất lượng chăm sóc sức khỏe cộng đồng Do vậy, đề tài: ”Xây dựng phả hệ
bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát mang đột biến gen CYP1B1”
được thực hiện với mục tiêu:
1 Xác định đột biến gen CYP1B1 trên bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát.
2 Xây dựng phả hệ của gia đình bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát mang đột biến gen CYP1B1
Trang 13CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát
1.1.1 Khái niệm glôcôm bẩm sinh
Glôcôm bẩm sinh là một dị tật của nhãn cầu, gây ra hội chứng tăngnhãn áp nghiêm trọng ở mắt trẻ từ lúc mới sinh đến tuổi thanh thiếu niên.Bệnh có thể nguyên phát hoặc thứ phát phối hợp với một dị dạng toàn thânhoặc tại mắt Hậu quả của tăng nhãn áp là thể tích nhãn cầu, nhất là bán cầutrước tăng rất nhanh và rối loạn trầm trọng đến chức năng thị giác
* Glôcôm bẩm sinh nguyên phát:
Bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát được Shaffer và Weiss định nghĩa:
“Glôcôm di truyền phổ biến nhất ở trẻ em, di truyền theo NST thường, lặn,với bất thường đặc biệt về góc gồm không có sự lùi điểm gắn chân mống tạogóc tại vùng bè và không kèm theo bất thường phát triển nào khác Tăng nhãn
áp là nguyên nhân gây giác mạc to, đục và chảy nước mắt do rạn màngDescemet.”
Trong các nhóm bệnh mắt trẻ em thì glôcôm trẻ em là một nhóm bệnhrối loạn không đồng nhất Glôcôm bẩm sinh nguyên phát là dạng phổ biếnnhất, chiếm 55% trong số glôcôm nguyên phát trẻ em [1]
Hầu hết các trường hợp glôcôm bẩm sinh nguyên phát xảy ra ở cả 2mắt (65 – 80%) và mức độ bệnh không tương đương nhau Khoảng 25%glôcôm bẩm sinh nguyên phát khới bệnh lúc mới sinh, hơn 60% trẻ đượcchẩn đoán dưới 6 tháng tuổi và trên 80% xuất hiện trong năm đầu [15]
Bệnh tăng nhãn áp bẩm sinh nguyên phát (PCG) là nguyên nhân chínhgây mù lòa ở trẻ em Nó thường được chẩn đoán trước 3 tuổi [9], [16]
Việc phát hiện và điều trị sớm bệnh có thể ngăn ngừa dẫn đến mù lòa
Trang 14Tuy nhiên, glôcôm bẩm sinh nguyên phát phần lớn được phát hiện muộn saukhi sinh Triệu chứng thường gặp nhất là sợ ánh sáng, chảy nước mắt, và coquắp mi Những triệu chứng này thường khiến cha mẹ bệnh nhân lưu ý [1].
1.1.2 Dịch tễ học glôcôm bẩm sinh nguyên phát
Tổng số bệnh nhân tăng nhãn áp trên thế giới khoảng 105 triệu người,trong đó tăng nhãn áp bẩm sinh ảnh hưởng đến 300000 trẻ (1,3%) [17]
Tỷ lệ bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát có tần suất khoảng 1/10.000đến 1/20.000 trẻ sinh sống ở các nước châu Âu và Mỹ Trong khi đó tỷ lệ nàyrất cao ở cộng đồng có cha mẹ cùng huyết thống như Ấn Độ 1/3.300, TrungĐông 1/2.500 và 1/2.250 ở Slovakia hay Rumani Ở Nhật Bản, trẻ nữ bị nhiềuhơn nam trong khi ở Mỹ và châu Âu thì trẻ nam mắc nhiều hơn với tỷ lệ 3: 2.Bệnh xảy ra trên khắp thế giới không ưu thế rõ rệt về chủng tộc cũng như địa
lý Tuy hiếm gặp nhưng đây là một trong hai nguyên nhân hàng đầu gây mùlòa ở trẻ nhỏ [17], [18] Hầu hết các trường hợp glôcôm bẩm sinh nguyên phátxảy ra ở cả hai mắt (65 - 80%) với mức độ bệnh thường không tương đươngnhau Khó khăn là ở chỗ bệnh thường phát hiện muộn, các phương pháp chỉđịnh không đúng, trẻ không được theo dõi hay tư vấn di truyền không hiệuquả [19]
Tại Hà Nội, trong khoảng 5-10 năm trở lại đây, có một số lượng lớn trẻsinh ra bị bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát, tuy nhiên các trẻ này thườngđược phát hiện bệnh muộn, điều trị, tiên lượng, theo dõi không kịp thời, dẫnđến mù lòa, ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống của trẻ và gia đình
1.1.3 Cơ chế bệnh sinh và tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh
* Cơ chế bệnh sinh:
Bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát được gọi là glôcôm phát triển vì cơchế gây bệnh là do ngừng, kém phát triển của góc mống mắt – giác mạc ở giaiđoạn thai kỳ làm tăng kháng trở thoát lưu thủy dịch Đồng thời, sự di trú bất
Trang 15thường và kém biệt hóa tế bào mào thần kinh đưa đến khiếm khuyết ở cácmức độ khác nhau của hệ thống lưới bè và ống Schlem gây ra sự phát triểnbất thường của hệ thống thoát lưu thủy dịch [1].
* Triệu chứng lâm sàng:
Tam chứng kinh điển: chảy nước mắt; sợ ánh sáng và co quắp mi.Ngoài ra còn gặp mắt lồi to
- Giác mạc to, đường kính ngang > 12mm trong năm đầu
- Rạn màng Descemet (đường Haabs)
- Phù giác mạc: phù biểu mô giác mạc đơn thuần do tăng nhãn áp.Glôcôm bẩm sinh nguyên phát tiến triển kéo dài có thể gây phù nhu mô giácmạc vĩnh viễn [20]
Hình 1.1 Dấu hiệu lâm sàng glôcôm bẩm sinh nguyên phát
http://www.dieutri.vn/upload/mat34.gif
- Củng mạc: mỏng và dãn làm tăng khả năng thấy được màng bồ đàobên dưới ở trẻ sơ sinh, tạo nên củng mạc có màu xanh (Có thể xảy ra đền khitrẻ 10 tuổi)
- Chiều dài trục nhãn cầu ở trẻ sơ sinh bình thường từ 17,5 – 20mm, đạt22mm lúc 1 tuổi Trong glôcôm bẩm sinh nguyên phát, chiều dài trục nhãncầu tăng gây cận thị trục tiến triển
- Nhãn áp: bình thường nhãn áp trẻ sơ sinh là 11,4 ± 2,4 mmHg Trẻdưới một tuổi, nhãn áp < 21mmHg
Trang 16Hình 1.2 Minh họa dấu hiệu tăng nhãn áp
- Chụp gai thị bằng máy chụp đáy mắt giúp đánh giá tình trạng bệnhglôcôm và tiến triển bệnh theo thời gian
Trang 17* Tiêu chuẩn chẩn đoán [21], [22]
Bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát điển hình khi có từ 4 triệuchứng trở lên trong số các triệu chứng sau:
- Nhãn áp cao ≥ 25 mmHg
- Chói, chảy nước mắt, sợ ánh sáng
- Đường kính giác mạc to bất thường ≥ 12 mm
- Giác mạc phù, mờ đục
- Tiền phòng sâu, góc tiền phòng có tổ chức bất thường
- Tổn hại lõm teo gai thị trong bệnh glôcôm
1.1.4 Điều trị glôcôm bẩm sinh nguyên phát
Mục tiêu điều trị là kiểm soát được nhãn áp bằng phẫu thuật hoặcthuốc, điều chỉnh tật khúc xạ và điều trị nhược thị
1.2 Cơ chế bệnh học phân tử
Trang 18Glôcôm bẩm sinh nguyên phát là một thể bệnh glôcôm di truyền lặnliên kết NST thường [8]
Hình 1.4 Cơ chế di truyền bệnh gen lặn trên NST thường
https://suckhoeditruyen.vn/wp-content/uploads/2017/01
Nếu ta gọi A là allen bình thường và a là allen bệnh thì người mangkiểu gen AA là người bình thường, Aa là người bình thường mang gen bệnh
và aa là người bệnh
Trang 19* Đặc điểm di truyền gen lặn trên NST thường
- Trong quần thể có 3 kiểu gen là AA, Aa, aa, có 2 kiểu hình: lành hoặcmắc bệnh
- Kiểu hình bệnh do gen lặn quy định chỉ biểu hiện trên lâm sàng khi cơthể là đồng hợp tử aa
- Cả hai giới nam và nữ đều có khả năng mắc bệnh, di truyền bệnh vàgen bệnh như nhau cho con trai và con gái của họ
- Bệnh có thể xảy ra không liên tục, ngắt quãng qua các thế hệ Bệnhxuất hiện lẻ tẻ, có tính chất gia đình, không rõ tính chất dòng họ
- Tỷ lệ mắc bệnh thường thấp: thường < 50%
- Người bệnh thường là con của 2 bố mẹ có kiểu hình bình thường (đều
là dị hợp tử) Tỷ lệ bệnh trong số các anh em ruột của người bệnh là 25%
- Các con của người bệnh lặn tuy có kiểu hình bình thường nhưng luôn là
dị hợp tử mang gen lặn
- Người dị hợp tử rất khó phát hiện vì các tính chất do gen lặn quy địnhkhông hoặc rất ít được biểu hiện ra bên ngoài, tuy vậy có thể phát hiện bằngphương pháp sinh hóa
- Trong quần thể, số người mang gen lặn lớn hơn số người mắc bệnhrất nhiều
- Sự kết hôn cận huyết hoặc kết hôn trong các quần thể cô lập làm tăngkhả năng đẻ con bệnh hoặc tăng tần số người mắc bệnh
- Nếu một người mắc bệnh kết hôn với một người dị hợp tử thì 50% sốcon của họ sẽ mắc bệnh
- Người mắc bệnh lặn do đột biến mới nảy sinh cần có cả hai đột biếncủa cùng một gen ở cả hai phía bố mẹ nên xác suất xảy ra là vô cùng nhỏ.Hình dưới đây mô tả sáu khả năng có thể xảy ra về sự di truyền gen lặn trênNST thường [23]
Trang 20Hình 1.5 Sơ đồ di truyền gen lặn liên kết NST thường
http://678.com.vn/di-truyen-y-hoc/di-truyen-don-gen-2.jpg
Các đột biến ở nhiều gen đã được tìm thấy là nguyên nhân gây bệnhglôcôm bẩm sinh nguyên phát và nhiều gen vẫn chưa được tìm thấy Các độtbiến trong gen cytochrome P4501B1 (CYP1B1) đã được tìm thấy là nguyênnhân chủ yếu của PCG [24]
1.2.1 Cấu trúc và vị trí gen CYP1B1
Protein CYP1B1 đóng vai trò quan trọng nhất trong việc hình thành cấutrúc và duy trì chức năng của mắt Đột biến gen CYP1B1 chủ yếu là đột biếnđiểm nằm rải rác trên toàn bộ chiều dài gen; tỉ lệ phát hiện đột biến CYP1B1cũng mang tính đặc trưng cho từng chủng tộc, ở châu Á khoảng 30% [11],[12], [13] [14]
Tên khoa học chính thức của gen CYP1B1: "cytochrome P450, family
1, subfamily B, polypeptide 1”
Ngoài ra gen CYP1B1 còn được gọi với các tên khác như: aryl hydrocarbonhydroxylase, CP1B, CP1B1_HUMAN, cytochrome P450 - subfamily I (dioxin -
Trang 21inducible) - polypeptide 1, flavoprotein - linked monooxygenas, microsomalmonooxygenase, xenobiotic monooxygenase.
Năm 1994, Sutter và cộng sự đã xác định được gen CYP1B1 gồm 543axit amin và là một phân họ gen mới của cytochrome P450, P4501B1 Bằngcách phân tích tế bào sinh dưỡng của người và động vật gặm nhấm, tác giả đãlập bản đồ gen CYP1B1 và xác định gen nằm trên NST số 2 [25]
Hình 1.6 Vị trí của gen CYP1B1 trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể 2
Trang 22Từ việc xác định vị trí nối intron/exon của gen CYP1B1, Stoilov vàcộng sự (1997) cũng đã chỉ ra gen CYP1B1 có 3 exon và 2 intron, dài12kb,
mã hóa phân tử mRNA gồm 1.631 base
Các gen CYP1B1 nằm từ cặp base số 38.067.063 đến 38.076.181 [27].Trong một loạt nghiên cứu về nhiễm sắc thể 2, vùng chứa gen CYP1B1 đãđược xác định là GLC3A [28]
Gen CYP1B1 là một phân họ của cytochrome P450.Cytochromes P450
là một nhóm monooxygenases heme-thiolate Trong microsome gan, enzymnày có liên quan đến con đường vận chuyển điện tử phụ thuộc NADPH Nóoxy hoá một loạt các hợp chất không liên quan cấu trúc, bao gồm steroid, axitbéo, retinoid và các chất bài tiết dục Đột biến ảnh hưởng đến enzym thườngtạo ra các đột biến lặn Đối với đột biến lặn dạng dị hợp tử, alen bình thường
có khả năng bù đắp chức năng cho alen bị đột biến Từ quan điểm này, mộtkiểu hình lặn như glôcôm bẩm sinh nguyên phát được gây ra bởi đột biếntrong một loại enzym như CYP1B1 là hợp lý
Trong quá trình hình thành và phát triển nhãn cầu, chức năng củaCYP1B1 chưa rõ ràng, nhưng nó được giả thiết rằng đóng một vai trò trongviệc hình thành các cấu trúc ở phía trước của mắt và cũng có thể tham gia vàomột quá trình điều chỉnh sự bài tiết thủy dịch
Schwartzman và cộng sự năm 1987 đã xác định có mối liên quan giữaarachidonate phụ thuộc cytochromeP450 với ức chế Na+, K+-ATPase tronggiác mạc trong việc điều chỉnh tính trong suốt của giác mạc và tiết thủy dịch.Phát hiện này phù hợp với mờ đục của giác mạc và tăng nhãn áp, hai tiêuchuẩn chẩn đoán chính cho bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát [29]
Stoilov I (2000) đã đưa ra giả thuyết rằng CYP1B1 chuyển hóa mộtphân tử có nguồn gốc nội sinh (như steroid, axit béo hoặc hợp chấtprostanoid) cần thiết cho phát triển bình thường và chức năng của mắt Hoạt
Trang 23động của CYP1B1 có thể dưới hai dạng: tạo ra một hợp chất hoạt động trênmột số mục tiêu hoặc ngừng tác dụng của các hợp chất sinh học khác vàchiếm vị trí của nó Tuy nhiên các phân tử này được chuyển hóa bởi quá trìnhkích hoạt có tổ chức của các enzym Vì vậy, CYP1B1 có thể thuộc về một conđường tín hiệu sinh hóa nội sinh chưa được biết rõ, liên quan đến trưởngthành cuối cùng của góc tiền phòng Đột biến gen CYP1B1 sẽ gây ra rối loạnsản xuất enzym, làm bất thường cấu trúc mạng lưới vùng bè, nơi có các ốngtuyến giúp lưu thoát thủy dịch khỏi mắt Sự ứ trệ thủy dịch này làm tăng nhãn
áp gây bệnh glôcôm [30]
Hình 1.8 Sơ đồ minh họa cơ chế ảnh hưởng của đột biến gen CYP1B1
Có sự khác biệt về đích tác động của thể hoang dại và thể đột biến củaphân tử CYP1B1 Phân tử CYP1B1 thể hoang dại được neo trên màng của lướinội nguyên sinh Chức năng bình thường của nó đòi hỏi sự tham gia của một sốđối tác oxy hóa khử P450 reductase P450 reductase có khả năng đưa mộtnguyên tử của phân tử oxy vào cơ chất của nó Khi đó có 2 khả năng xảy ra (B):
Trang 24- Cơ chất được hoạt hóa và tác động trên mục tiêu xuôi dòng
- Oxy phân tử có thể làm tăng khả năng ưa nước của cơ chất và làm dễdàng cho sự bài tiết và thanh lọc cơ chất từ trong tế bào
Bởi vậy, đột biến CYP1B1 có thể làm thay đổi 2 khả năng trên (C) Sựđiều hòa không gian và thời gian của các gen kiểm soát phát triển của góc tiềnphòng sẽ bị thay đổi bởi sự vắng mặt của phân tử điều hòa (ví dụ như steroid)được sản sinh bởi CYP1B1 Bên cạnh đó, những dấu hiệu dừng phát triển củagóc tiền phòng được quan sát thấy trong góc tiền phòng của glôcôm bẩm sinhnguyên phát có thể phản ánh ảnh hưởng của một quá trình chuyển hóa có thểđược giới hạn và loại bỏ bởi phân tử CYP1B1 [30]
Một nghiên cứu khác đã chứng minh CYP1B1 chuyển hóa quá trìnhtổng hợp, oxy hóa 2 bước acid retinoic (RA) từ retinol RA là một phối tử chocác protein thụ thể điều chỉnh hình thái học CYP1B1 tham gia vào việc tạo ramột số morphogen đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của lưới bè vàcác thành phần khác trong hệ thống thoát lưu thủy dịch bằng cách điều chỉnh
sự biểu hiện của các gen kiểm soát sự phát triển của góc tiền phòng, do đó độtbiến trong CYP1B1 sẽ làm thay đổi biểu hiện của các gen trên [31]
Doshi M và cộng sự, trong nghiên cứu của mình đã khẳng định nhữngbất thường trong sự phát triển của lưới bè trong glôcôm bẩm sinh nguyên phát
có thể là do giảm hoặc vắng mặt các chất nội sinh quan trọng do enzymCYP1B1 không hoạt động [32]
Theo tổng kết năm 2011, trong 52 nghiên cứu trên thế giới có tới 99,8%đột biến phát hiện được ở exon 2 và exon 3 gen CYP1B1 [33]
1.3 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam
* Lịch sử nghiên cứu:
Hippocrates (460-377 TCN), Celsius (thế kỷ thứ nhất) và Galen
(130-201 S) đã nhận ra sự mở rộng bẩm sinh của mắt, nhưng không liên quan đến
Trang 25tình trạng tăng nhãn áp Berger (1744) đề cập đến tăng nhãn áp, nhưng vàonăm 1869 Von Muralt đề cập đến buphthalmos cổ điển trong phạm vi gia đìnhbệnh tăng nhãn áp Tuy nhiên, cả Von Muralt và Von Graefe đều cho rằng tìnhtrạng này là do viêm nội nhãn nguyên phát Vào cuối những năm 1800 và đầunhững năm 1900 đã tiến hành các cuộc giải phẫu cơ thể chính xác và bệnh lýhọc đã chỉ ra các dị dạng khác nhau của cấu trúc của góc tiền phòng Nhữngnghiên cứu như vậy được thực hiện bởi von Hippel (1897), Parsons (1904),Siegrist (1905), Gros (1897), Reis (1905-1911), Seefelder (1906-1920) vànhững người khác.
Vào đầu những năm 1900, glôcôm bẩm sinh dường như không thể chữatrị được và Anderson bình luận, "tương lai của bệnh nhân là bóng tối".Tiênlượng xấu của bệnh tăng nhãn áp trẻ sơ sinh thay đổi đáng kể vào năm 1938với sự ra đời của Otto Barkan , người đã làm sống lại cuộc phẫu thuật người
Ý của Vincentis (1892), "bao gồm góc của mống mắt ở bệnh tăng nhãn áp" Năm 1949, Barkan miêu tả lưới bè (trabecular meshwork) Điều này đãđược xác nhận bởi Worst (1966), người gọi nó là màng Barkan Tuy nhiên,các nghiên cứu bệnh lý của Anderson, Hansson, Maul, Maumenee, và nhữngngười khác không thể tìm thấy sự tồn tại của bất kỳ màng như vậy bằng kínhhiển vi điện tử hoặc ánh sáng [34]
* Những nghiên cứu ngày nay về glôcôm bẩm sinh nguyên phát
Các đột biến Cyp1b1 xảy ra ở 87% gia đình và 27% các trường hợp lẻ
tẻ của PCG trên toàn thế giới [30]
Báo cáo đầu tiên về khuynh hướng di truyền của bệnh tăng nhãn áp đãđược công bố vào năm 1842 khi Benedict quan sát thấy hai chị em bị bệnhtăng nhãn áp Sau đó, nhiều báo cáo cho thấy vai trò nhất định của các yếu tố
di truyền [12], [35], [36], [37]
Nghiên cứu của Basem A và cộng sự năm 1998 trên các gia đình Ả RậpSaudi có bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát cho kết quả sau [38]:
Trang 26Bảng 1.1 Sự di truyền trong các thành viên24 gia đình Saudi Arabian
Gia đình / Gia đình (Số KKECG) Đột biến trong
Exon 2
Các đột biến trong Exon 3
35, 104, 107, 113, 116, 122 123, 125,
129, 132, 135, 137 139, 140, 148,
154, 157
3987G → A(p.G61E) a
(p.G61E)
7957G → A(p.D374N)
(p.G61E)
8242C → T(p.R469W)
> A, 1449G-> A, và 1514C- > A), và 17,8% bệnh nhân được nhận thấy có độtbiến R368H (1449G -> A) [39]
Theo nghiên cứu của Kiranpreet Kaur và cộng sự (2011), hơn 70 loạiđột biến trong CYP1B1 đã được mô tả [32] Tỷ lệ này dao động từ 20% ởNhật Bản; 33,3% ở Indonexia; 44% ở Ấn Độ; 50% ở người Brazil Tỷ lệ nàytương đối cao (gần 100%) ở quần thể có giao phối cận huyết (Ả Rập Arabian
và Gypsy Slovakia) Phần lớn các đột biến này là đột biến sai nghĩa (misensemutation), rải rác trên suốt chiều dài gen, ảnh hưởng đến số lượng acid amin,
Trang 27do đó có thể can thiệp vào các tính chất cơ bản của protein như gấp, liên kếthem, chất nền và tương tác tác nhân oxy hóa.
Bảng 1.2 Phân bố các loại đột biến CYP1B1 trên toàn thế giới
http://www.meajo.org/articles/2011/18/1/images/MiddleEastAfrJOphthalmol
Theo thống kê của nhóm nghiên cứu Ni Li,Yong Zhou, Liang Du vàcác cộng sự năm 2011, trên thế giới đã tiến hành khoảng 655 nghiên cứu vềđột biến gen CYP1B1 trong bệnh glôcôm, đã xác định 542 bệnh nhân glôcômbẩm sinh nguyên phát có đột biến (theo 52 bài báo khoa học) và 147 đột biếnkhác nhau đã được tìm thấy Trong đó 66,7% đột biến sai nghĩa (misensemutation), 14,12% đột biến xóa đoạn (delection mutation), thêm đoạn(insertion) / xóa đoạn là 0.09%, 4,28% lặp đoạn nhiễm sắc thể (duplicationmutation), 2.82% thêm đoạn, đột biến vô nghĩa (nonsense mutation) là 3.55%
và đột biến chưa xác định là 8.11% Sự phân bố của các đột biến :
- 2 đột biến (3130C>T) trong vùng không mã hóa exon 1
- 498 đột biến xảy ra trong exon 2
- 516 đột biến ở exon 3
Các loại đột biến gen xảy ra ở các chủng tộc trên thế giới là khác nhau :
- Ở Trung Đông: các đột biến missense 3987G>A (p.G61E) chiếm
Trang 28Những phát hiện này gợi ý rằng nguồn gốc dân tộc của bệnh nhân hoặc phân bố địa lý của bệnh có thể liên quan đến các dạng đột biến CYP1B1 khác nhau [33]
Gần đây, ngày càng có nhiều nước tại châu Á nghiên cứu về đột biến gen CYP1B1 nhằm phát hiện các đột biến gen hay gặp ở khu vực và góp phầntìm ra cơ chế gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát
Năm 2010, Nobuo Fuse và cộng sự nghiên cứu xác định vai trò củagen CYP1B1 trên bệnh nhân Nhật nhận thấy có đột biến ở khoảng 20% bệnhnhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát Đó là các đột biến p.Asp192Val,c.4776insAT, p.Val364Met, và p.Asp430Glu [13]
Năm 2011, nghiên cứu tại Hàn Quốc đã phát hiện 22 bệnh nhân mangđột biến gen CYP1B1 trong số 85 bệnh nhân chẩn đoán bệnh glôcôm bẩmsinh nguyên phát (25,9%) Trong tổng số 11 loại đột biến phát hiện trongnghiên cứu này,đột biến hay gặp là đột biến lệch khung dịch mã(frameshift mutation) (c.970_971dupAT; p.T325SfsX104) và hai đột biến mới
là p.G329S và p.V419Gfs11X [40]
Cùng năm này, nghiên cứu trên 54 bệnh nhân ở Ả rập phát hiện 41trường hợp đột biến gen CYP1B1 (75,9%) 13 đột biến hay gặp là: 9 đột biến
Trang 29thay thế (p.G61E, p.A119S,p R390H, p.P437L, p.D441G, p.A443G,p.G466S, p.G466D, và p.), 2 đột biến xóa đoạn (g.4238_4247del vàg.7901_7913del) và 2 đột biến tạo mã kết thúc sớm (p.R355X và p.R444X);trong đó đột biến p.G61E là hay gặp nhất [41]
Trong nghiên cứu tại Bắc Triều Tiên (2012) trên 85 bệnh nhân đã pháthiện 63 trường hợp mang đột biến gen (74,1%) Bên cạnh đó, có tác giả cũng
đề cập đến ảnh hưởng của gen với biểu hiện lâm sàng và kết quả điều trị Ởnhóm mang gen đột biến, bệnh thường biểu hiện sớm hơn, nặng hơn, xuấthiện ở cả hai mắt và kết quả điều trị kém hơn [42]
Trong nghiên cứu năm 2014 trên 238 bệnh nhân tại Trung Quốc, đã pháthiện 17,2% bệnh nhân mang gen CYP1B1 đột biến, trong đó có 9 đột biến mới.Tác giả cũng đưa ra kết luận tuổi xuất hiện bệnh trung bình ở nhóm có đột biếngen sớm hơn (2 tháng tuổi) nhóm không có đột biến (6 tháng tuổi) [43]
Một số nghiên cứu phả hệ bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phátcũng được tiến hành
Theo nghiên cứu của Morales-Fernandez L (2015) mô tả một gia đìnhTây Ban Nha có 3 trong số 7 anh chị em được chẩn đoán glôcôm bẩm sinhnguyên phát: xác định hai đột biến R355fsX69 / T404fsX38 trên bệnh nhân;hai trong số 4 anh chị em khỏe mạnh mang đột biến dị hợp tử R355fsX69, haingười còn lại không có đột biến [44]
Trong một nghiên cứu về năm gia đình Ấn Độ có bệnh nhân glôcômbẩm sinh nguyên phát , năm đột biến gây bệnh đã được xác định trong támthành viên bị bệnh: p.Ter 223 (frameship), p.G61E, p.P193L (dị hợp tử),p.E229K (dị hợp tử), p.R368H Ngoài ra, năm SNP đã được tìm thấy trongcác gia đình Đây là một trong hai quan sát thấy trong dân số nói chung và /hoặc đã được tìm thấy ảnh hưởng đến dư lượng axit amin bảo tồn kém độcquyền Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng CYP1B1 có thể là nguyên nhân chủ
Trang 30yếu của PCG trong nền dân tộc Ấn Độ, bởi vì tất cả các gia đình đã phân tíchcho đến nay đã có đột biến trong gen này [45].
Cũng trong nghiên cứu này,một gia đình kết hôn cận huyết (chú –cháu): có hai bệnh nhân được phát hiện đột biến 376insA; các thành viên khác
dị hợp tử với đột biến này Ở một gia đình khác (hôn nhân giữa anh em họ)
có người mẹ bị bệnh và người cha mang gen bệnh Phát hiện đột biếnp.Pro193Leu; p.Glu229lys [45] Trong đó, ông ngoại mang gen bệnh và mộtthành viên khác dị hợp tử với đột biến
Một nghiên cứu trên 21 phả hệ từ Hoa Kỳ và Brazil tìm thấy bốn độtbiến khác nhau trong ba phả hệ và các phả hệ đều có cấu trúc phả hệ phù hợpvới mô hình di truyền lặn [46]
Nghiên cứu khác của nhóm tác giả Maria T., Gacia Anton, Joan JSalazar 2017 trên 5 bệnh nhân và gia đình phát hiện các đột biếnp.Ala179Arg, p.Arg355His, p.Glu387Lys: c.1159G> A,p.Gly61Glu: c.182G>
A, p.Thr404Ser Ba bệnh nhân không có anh trai hoặc chị gái và là thành viênduy nhất bị bệnh trong gia đình của họ Hai trong số các bệnh nhân là anh chị
em và thuộc về một gia đình có 7 người bị bệnh mang đột biến nhưng biểuhiện bệnh ở các độ tuổi khác nhau Ba trong số năm trường hợp là dị hợp tử,một là đồng hợp tử, và cuối cùng là một dị hợp tử đơn [47]
Tác giả Ling Chen điều tra đột biến CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩmsinh nguyên phát trong một gia đình Hán Trung Quốc ba thế hệ Bảy đột biến
đã được xác định trong phả hệ này, trong đó bao gồm 3 đột biến: c.319 C> Gp.L107V, c.517 G>, một p.E173K và c.592 G>, một p.V198I và 4 SNP:rs10012, rs1056827, rs1056836 và rs105683 Đối với p.L107V, gen đột biến
dị hợp tử CG được phát hiện chỉ trong một đối tượng không bị bệnh Đối vớip.V198I, gen đột biến dị hợp tử GA được phát hiện chỉ trong một đối tượngkhông bị bệnh Đối với p.E173K, kiểu gen đột biến đồng hợp AA được phát
Trang 31hiện ở tất cả các cá thể bị bệnh và không có trong tất cả những người không bịbệnh ngoại trừ một cá thể [48]
Theo thống kê mới nhất của nhóm tác giả Hong Wei Wang, Peng Sun,Yao Chen (2018) Trong số các đột biến CYP1B1, p.Glu387Lys đã được bắtnguồn từ một nguồn gốc di truyền chung cho glôcôm bẩm sinh nguyên phát(PCG) Đột biến CYP1B1, được báo cáo là có liên quan với một loạt các kiểuhình bệnh glôcôm, bao gồm PCG, POAG, JOAG và PEXG, xuất hiện ởnhững bệnh nhân bị tăng nhãn áp ở tần số cao hơn so với các gen liên quanđến tăng nhãn áp khác Các đột biến CYP1B1 có thể làm tăng tính nhạy cảmvới glôcôm bẩm sinh nguyên phát và là các yếu tố gây bệnh phổ biến nhấtcủa bệnh Tuy nhiên, tần số đột biến glôcôm bẩm sinh nguyên phát trongCYP1B1 thay đổi đáng kể ở các quần thể khác nhau, bao gồm Mexico(<10%), Việt Nam (16,7%), Trung Quốc, Nhật Bản và Indonesia (tất cả20%) , Ấn Độ (40%) Hơn nữa, đột biến gây ra glôcôm bẩm sinh nguyên pháttrong CYP1B1 xảy ra với tỷ lệ rất cao ở quần đảo Gypsy và Ả Rập Xlô-va-ki-
a, hỗ trợ một nghiên cứu bổ sung báo cáo rằng sự kết hôn đồng huyết là một
cơ chế cơ bản cho tỷ lệ bệnh cao ở quần đảo Gypsy và Ả Rập Xlô-va-ki-a[49]
Một số lượng ngày càng tăng của sự chú ý nghiên cứu là tập trung vào
sự tương tác của CYP1B1 với các gen khác Ngày càng có nhiều bằng chứngcho thấy sự tương tác của CYP1B1 với MYOC xảy ra ở bệnh nhân glôcômbẩm sinh nguyên phát Trong quá trình tương tác, MYOC là một gen biến đổitiềm năng Ngoài ra, đột biến TEK (tyrosine kinase nội mô) xảy ra với độtbiến CYP1B1 ở bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát; đáng chú ý là cha
mẹ của những bệnh nhân này mắc bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát hoặc
dị hợp tử CYP1B1 hoặc TEK và không có triệu chứng Hơn nữa, có bằngchứng rõ ràng cho thấy sự tương tác giữa CYP1B1 và TEK cho sinh bệnh học
Trang 32của glôcôm bẩm sinh nguyên phát ; tuy nhiên, phương thức tương tác vẫnchưa rõ ràng về việc liệu một chế độ chồng chéo hay độc lập có liên quan đến
cơ chế gây bệnh của glôcôm bẩm sinh nguyên phát hay không Theo tác giảHong Wei Wang, mặc dù đột biến CYP1B1 là nguyên nhân phổ biến nhất củaglôcôm bẩm sinh nguyên phát, nhưng những đột biến này chỉ đóng góp mộtphần rất nhỏ trong tổng số Bên cạnh CYP1B1, có một số gen được chứngminh có liên quan đến glôcôm bẩm sinh nguyên phát, bao gồm LTBP2,FOXC1 và MYOC Do đó, rất hợp lý để suy đoán rằng các gen khác có thểtham gia vào sinh bệnh học của bệnh [50]
Ở Việt Nam hiện chưa có nhiều nghiên cứu về đột biến gen gây bệnhglôcôm bẩm sinh nguyên phát được công bố Nghiên cứu của Phạm Thị ChiLan (2007) cho thấy tỷ lệ glôcôm bẩm sinh là 41,7% [51] Nhóm tác giả TanDo; William Shei; Pham Thi Minh Chau công bố trên tạp chí Journal ofGlaucoma năm 2016 nghiên cứu trên 30 bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyênphát ở Việt Nam, trong đó, 5 đột biến được xác định: p.H279L và p.L283F làđột biến mới, ba đột biến : p.A121_S122insDRPAFA, p.L107V và p.V320L
đã được báo cáo trước đây [52]
1.4 Phương pháp phát hiện đột biến gen CYP1B1
PCR được dùng để khuếch đại gen CYP1B1trước khi tiến hành giảitrình tự gen xác định đột biến Kỹ thuật này đòi hỏi phải tối ưu điều kiện PCR
để có thể đưa ra sản phẩm PCR đặc hiệu, không có sản phẩm phụ, vạch rõ nét,giúp giải trình tự gen thu được kết quả tốt và không bị nhiễu
1.4.1 Phương pháp PCR
PCR là kỹ thuật nhân bản DNA trong ống nghiệm Nguyên tắc củaphản ứng PCR dựa trên đặc điểm của quá trình tự sao chép DNA trong tế bào:cần có DNA ở dạng sợi đơn, cần các đoạn mồi và các loại enzym xúc tác Kỹthuật PCR sử dụng Taq polymerase (enzym chịu nhiệt) tổng hợp một mạch
Trang 33DNA mới từ mạch DNA đơn làm khuôn với nguyên liệu là bốn loại nucleotid.Phản ứng đòi hỏi phải có mặt của cặp mồi đặc hiệu (mồi xuôi, mồi ngược) cótrình tự bổ sung với hai đầu của trình tự DNA khuôn PCR là một chuỗi nhiềuchu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn nhiệt độ khác nhau
Hình 1.9 Các bước cơ bản của phản ứng PCR
(Nguồn: Andy Vierstraete, 1999)
- Giai đoạn 1 (biến tính): DNA khuôn sẽ được biến tính ở nhiệt độ cao(cao hơn nhiệt độ Tm) 94oC ÷ 95oC trong vòng từ 30 ÷ 60 giây
- Giai đoạn 2 (bắt cặp): nhiệt độ hạ thấp dưới nhiệt độ nóng chảy Tm
Trang 34(temperature melting) của các mồi khoảng 40oC ÷ 70oCkhoảng 30 ÷ 60 giây.
- Giai đoạn 3 (kéo dài): nhiệt độ tăng lên 72oC [53]
1.4.2 Phương pháp giải trình tự gen
Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắpxếp của các nucleotid trong phân tử DNA
Phân tử DNA là một chuỗi xoắn kép gồm hai mạch đơn được cấu tạo
từ bốn loại nucletid khác nhau đó là: A (adenin), C (cytosin), G (guanin) và T(thymin) Các nucleotid này liên kết với nhau theo một thứ tự xác định Giảitrình tự gen là phát hiện được thứ tự sắp xếp của bốn nucleotid này trên phân
Hiện nay phương pháp của Sanger được sử dụng phổ biến ở Việt Nam
và thế giới Phương pháp của Sanger sử dụng ddNTP (dideoxyribonucleotidetriphosphate) là các đồng phân của dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate),còn được gọi là “terminator” Cấu trúc ddNTP tương tự dNTP chỉ có mộtđiểm khác biệt duy nhất là ddNTP không có gốc OH ở vị trí carbon 3 củadeoxyribose, là vị trí để các dNTP tiếp theo gắn vào Do đó, phản ứng tổnghợp DNA sẽ được dừng lại tại ngay vị trí mà ddNTP được gắn ngẫu nhiên vàothay cho dNTP [54], [55]
Trang 35Hình 1.10 Phương pháp giải trình tự gen
Nguồn ảnh: http://mammoth.psu.edu/
Các phòng xét nghiệm hiện nay hầu hết đều giải trình tự bằng phản ứngenzym, nhưng khi làm giải trình tự thì dùng máy tự động chứ không dùng kỹthuật xạ ký tự ghi như trước đây nữa Tóm lại, sự ra đời của kỹ thuật PCR đãgiúp cho kỹ thuật giải trình tự có những tiến bộ vượt bậc về kỹ thuật cũng nhưphạm vi áp dụng, cho phép xác định trực tiếp trình tự của một DNA khuếchđại bằng PCR mà không qua tạo dòng Kỹ thuật nhân bản DNA trong ốngnghiệm bằng PCR cũng giúp cải tiến phản ứng giải trình tự kém hiệu quảtrước đây trở nên hiệu quả hơn nhờ áp dụng polymerase giải trình tự bền vớinhiệt độ, để phản ứng giải trình tự được thực hiện qua các chu kỳ nhiệt giốngnhư PCR, vì thế hiện nay gọi là phản ứng chu kỳ nhiệt giải trình tự
Trang 36CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
- Gồm 20 bệnh nhân đã được chẩn đoán mắc bệnh glôcôm bẩm sinhnguyên phát; được làm xét nghiệm PCR, giải trình tự gen CYP1B1 tại Trungtâm Nghiên cứu Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà Nội
- Tất cả các thành viên trong gia đình 4 bệnh nhân mang đột biến genCYP1B1 gồm: ông bà nội ngoại, bố mẹ, các anh chị em ruột của bệnh nhân
* Tiêu chuẩn lựa chọn:
- Bệnh nhân được chẩn đoán xác định bệnh glôcôm bẩm sinh nguyênphát tại Bệnh viện Mắt Hà Nội và Bệnh viện Mắt Trung ương; làm xétnghiệm xác định đột biến gen CYP1B1 tại Trung tâm Nghiên cứu Gen –Protein, Trường Đại học Y Hà Nội
- Gia đình bệnh nhân đồng ý tham gia vào nghiên cứu
* Tiêu chuẩn chẩn đoán
Bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát điển hình khi có từ 4 triệuchứng trở lên:
- Nhãn áp cao ≥ 25 mmHg
- Chói, chảy nước mắt, sợ ánh sáng
- Đường kính giác mạc to bất thường ≥ 12 mm
- Giác mạc phù, mờ đục
- Tiền phòng sâu, góc tiền phòng có tổ chức bất thường
- Tổn hại lõm teo gai thị trong bệnh glôcôm
* Tiêu chuẩn loại trừ:
Trang 37+ Glôcôm bẩm sinh thứ phát:
- Tổn thương của giác mạc: hội chứng tách lớp bán phần trước (Axenfeld,Reiger, Peters)
- Tổn thương của mống mắt: tật không mống mắt, tồn lưu màng Wachendorf
- Dị thường thể thủy tinh: hội chứng Lowe, Marfan, Machesani
+ Bệnh nhân không mang đột biến gen CYP1B1
+ Bệnh nhân hoặc gia đình không tự nguyện tham gia nghiên cứu
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Thiết kế nghiên cứu
* Phương pháp nghiên cứu: mô tả cắt ngang
* Phương pháp chọn mẫu: chon mẫu thuận tiện
* Cỡ mẫu: n = 20 bệnh nhân và phả hệ của các bệnh nhân mang độtbiến gen CYP1B1
Mỗi gia đình sẽ nghiên cứu 3 thế hệ
* Xử lý số liệu: thuật toán thống kê y học với phần mềm SPSS 16.0
* Thời gian nghiên cứu: một năm, từ tháng 9.2017-9.2018
* Địa điểm nghiên cứu: Bệnh viện mắt Hà Nội, Bệnh viện mắt TrungƯơng, Trung tâm nghiên cứu Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà Nội
2.3.2 Sơ đồ nghiên cứu
Trang 38Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu
2.3 Nội dung nghiên cứu
2.3.1 Xác định đột biến gen CYP1B1 trên bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát
- Lựa chọn bệnh nhân
- Khai thác thông tin về các thành viên gia đình bệnh nhân
- Lấy mẫu và tiến hành xác định đột biến gen CYP1B1 trên các thànhviên gia đình bệnh nhân
2.3.2 Xây dựng phả hệ của gia đình bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát mang đột biến gen CYP1B1
Xây dựng phả hệ Lựa chọn bệnh nhân và lấy
Trang 39- Máy sinh hiển vi đèn khe
- Kính soi góc tiền phòng Goldmann một mặt gương
- Máy soi đáy mắt, máy thị trường, máy chụp OCT, máy Retcam
- Máy chụp ảnh
Trang 40* Dùng để xác định đột biến gen:
- Ống lấy máu chống đông EDTA
- Pipet, đầu côn
- Ống Eppendorf 1,5 ml và ống Facol
- Máy Gene Amp PCR System 9700 (USA)
- Tủ lạnh sâu: -30°C; -80°C (SANYO)
- Máy điện di: Mupid (Nhật Bản)
- Máy soi gel và chụp ảnh tự động: Chemidoc EQ-Bio-Rad (USA)
- Máy ly tâm lạnh Beckman (USA) và ly tâm để bàn Eppendorf (Đức)
- Lò vi sóng (Samsung)
- Máy đọc trình tự gen ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (USA)
- Tủ ấm
2.4.2 Hoá chất
* Hóa chất dùng để tách chiết DNA:
- Dung dịch Cell Lysis Solution
- Dung dịch Nuclei Lysis Solution
- Dung dịch RNAse Solution
- Dung dịch Protein Precipitation Solution
- Dung dịch Isopropanol
- Dung dịch Ethanol 70%
- Dung dich hòa tan DNA DNA Rehydration Solution
* Hoá chất để thực hiện kỹ thuật PCR (Invitrogen)
- 10x buffer,
- dNTP 10 mM,
- Taq polymerase,
- Các cặp mồi (xuôi và ngược)
* Hoá chất để điện di sản phẩm PCR trên gel agarose:
- Agarose