Bước đầu xác định đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Glôcôm trẻ em nguyên nhân thường gặp gây mù lòa trẻ em, đặc biệt glôcôm bẩm sinh nguyên phát trẻ q nhỏ, khó khám, khó đo nhãn áp, chẩn đốn dễ bị bỏ sót, phẫu thuật dễ bị tái phát Bệnh thường xảy hai mắt (65-80%), xuất sớm từ năm đầu sau sinh điều trị khỏi hay phòng ngừa với kỹ thuật y học đại [1], [2] Tỷ lệ bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát có tần suất khoảng 1/10.000 đến 1/20.000 trẻ sinh sống nước châu Âu Mỹ Bệnh chiếm 55% tổng số trường hợp glôcôm nguyên phát trẻ em, 60% chẩn đoán vào lúc tháng tuổi 80% vòng năm Khoảng 65% trẻ nam bệnh thường xảy hai mắt 65-80% trường hợp với mức độ không tương đương Tuy gặp hai nguyên nhân hàng đầu gây mù lòa trẻ nhỏ [1], [3], [4] Các tác giả Shaffer Weiss từ năm 1970 xác định glôcôm bẩm sinh nguyên phát thể bệnh glôcôm di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể thường [5] Ba đột biến gen nghiên cứu nhiều liên quan đến glôcôm CYP1B1, LTBP2, MYOC [6] Trong gen CYP1B1 tổng hợp protein CYP1B1 đóng vai trò quan trọng việc hình thành cấu trúc trì chức mắt Có nhiều giả thiết đưa mối liên quan đột biến gen CYP1B1 bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát trẻ em [7], [8] Gen CYP1B1 nằm nhánh ngắn nhiễm sắc thể vị trí 2p22.2 bao gồm exon intron, dài 12 kb, mã hóa phân tử mRNA gồm 1.631 base [9], [10] Đột biến gen CYP1B1 hay gặp đột biến thay acid amin (missense) phát 733 trường hợp số 1096 đột biến (66,76%) Trong đột biến exon phát nhiều với 516 trường hợp chiếm 47,08% [11] Một báo cáo khác năm 2011 kết luận đột biến thay acid amin loại đột biến gen CYP1B1 hay gặp [12] Ở nước ta, nghiên cứu trước bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát đề cập đến tỉ lệ mắc bệnh, biểu lâm sàng, kết điều trị phẫu thuật thành cơng thấp (trung bình khoảng 30%) biến chứng nặng nề nghiên cứu V T B Thủy (1998), hay nghiên cứu 103 trẻ bị glôcôm điều trị Khoa Nhi bệnh viện Mắt TP Hồ Chí Minh (2006), nghiên cứu Đ Y Lục (2006) 36 bệnh nhân Trong năm gần đây, xu hướng nghiên cứu sâu chế bệnh sinh mức độ phân tử hứa hẹn làm tiền đề triển khai chẩn đoán trước sinh liệu pháp điều trị gen, đồng thời giúp việc quản lý tốt người mang gen gây bệnh Các nghiên cứu phát đột biến gen số bệnh lý di truyền bắt đầu triển khai thu kết tốt bệnh loạn dưỡng Duchenne, thối hóa tủy, tăng sản thượng thận bẩm sinh, tạo xương bất tồn Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu đột biến gen gây bệnh glôcôm bẩm sinh ngun phát Vì chúng tơi tiến hành đề tài “Bước đầu xác định đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát” với mục tiêu: Xác định đột biến exon gen CYP1B1 bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược glôcôm bẩm sinh nguyên phát 1.1.1 Khái niệm dịch tễ học glôcôm bẩm sinh nguyên phát Khái niệm Theo Shaffer Weiss, Glôcôm bẩm sinh nguyên phát định nghĩa glôcôm di truyền phổ biến trẻ em, di truyền lặn nhiễm sắc thể thường, với bất thường đặc biệt góc gồm khơng có lùi điểm gắn chân mống tạo góc vùng bè khơng kèm theo bất thường phát triền khác Tăng nhãn áp nguyên nhân gây giác mạc to, đục chảy nước mắt rạn màng Descemet [1] Glôcôm bẩm sinh thứ phát kèm theo bất thường phần khác mắt  Tổn thương giác mạc: hội chứng tách lớp bán phần trước (Axenfeld, Reiger, Peters)  Tổn thương mống mắt: tật không mống mắt, tồn lưu màng Wachendorf  Dị thường thể thủy tinh: hội chứng Lowe, Marfan, Machesani Việc phát điều trị sớm bệnh glơcơm bẩm sinh ngăn ngừa dẫn đến mù lòa Dịch tễ học Glơcơm bẩm sinh nguyên phát bệnh gặp với tỷ lệ 1/10000 đến 1/20000 trẻ mắc Trong tỷ lệ cao cộng đồng có cha mẹ huyết thống Ấn Độ 1/3.300, Trung Đông 1/2.500 1/1.250 Slovakia hay Rumani [1] 1.1.2 Phân loại glơcơm bẩm sinh ngun phát Etienne dựa theo kiểu góc tiền phòng quan sát soi góc tiền phòng để chia glôcôm bẩm sinh thành hai loại:  Glôcôm góc mở (do có di tích phơi kín đáo)  Glơcơm góc đóng: có tổ chức trung phơi khơng bình thường dày che lấp vùng bè Tùy thuộc vào tuổi xuất bệnh, Glơcơm bẩm sinh ngun phát chia làm nhóm:  Glơcơm bẩm sinh thực (True congenital glaucoma): nhóm nhãn áp tăng cao bệnh nhân nằm bụng mẹ, triệu chứng bệnh xuất sau đẻ  Glôcôm trẻ nhỏ nguyên phát (Primary infantile glaucoma): bệnh phát năm đời  Glôcôm người trẻ (Juvenile congenital glaucoma): phát muộn trẻ em sau tuổi tuổi vị thành niên 1.1.3 Giải phẫu bệnh, sinh lí bệnh glơcơm bẩm sinh ngun phát * Góc tiền phòng glơcơm bẩm sinh: Các nghiên cứu q trình phát triển phơi thai học giải phẫu học góc tiền phòng cho thấy chế tăng nhãn áp glơcơm bẩm sinh khác hồn tồn so với người trưởng thành [3] Có nhiều giả thiết khác giải thích chế gây tăng nhãn áp glôcôm bẩm sinh Tuy nhiên tác giả cho áp lực nội nhãn tăng glôcôm bẩm sinh phát triển bất thường góc tiền phòng dẫn đến cản trở lưu thơng thủy dịch [13], [14], [15] Mann cho teo khơng hồn tồn tổ chức trung bì góc tiền phòng làm tắc nghẽn lưu thơng thủy dịch gây tăng nhãn áp Barkan cho tiêu tan khơng hồn tồn tế bào trung mơ góc tạo nên màng bịt góc tiền phòng (gọi màng Barkan) chế tăng nhãn áp Anderson cộng nghiên cứu kính hiển vi điện tử khơng tìm thấy diện màng Barkan lại thấy mặt trước màng bồ đào bám cao vùng bè [14] Các tác giả khác Allen, Burian Braley thấy chế sinh bệnh glôcôm bẩm sinh tách lớp khơng hồn tồn tổ chức trung bì góc tiền phòng Worst cho phát triển khơng hoàn toàn cựa củng mạc dẫn đến bám cao thể mi vào vùng bè, thêm vào có lớp tế bào nội mơ đơn bao phủ góc tiền phòng suốt thời kì thai nghén Smelser Ozanics giải thích glơcơm bẩm sinh ngun phát đơn thay đổi cấu trúc mạng lưới bè màng bồ đào, đồng thời có lớp dày chất vô định lớp nội mô thành ống Schlemm, điều phát thấy có giải phẫu bệnh bệnh nhân glơcơm bẩm sinh nguyên phát đơn Kupfer lại nhấn mạnh có diện tế bào mào thần kinh thuộc xương sọ có góc tiền phòng, điều gợi ý phát triển bất thường cấu trúc góc tiền phòng Tóm lại có nhiều giả thiết giải thích chế sinh bệnh glơcơm bẩm sinh nguyên phát đơn Các tác giả [3], [14], [15] cho chế gây glôcôm bẩm sinh nguyên phát do: - Sự ngừng phát triển mức độ khác góc tiền phòng phát triển khơng hài hòa thành phần góc - Sự bám bất thường thể mi mống mắt vào phần sau vùng bè, nếp thể mi thể mi bị kéo phía trung tâm, cựa củng mạc dịch chuyển phía trước Thuyết di truyền bệnh lý glôcôm bẩm sinh nói đến: glơcơm bẩm sinh di truyền theo kiểu lặn nguyên phát đơn độc, túy di truyền trội thể phối hợp Người ta nói đến di truyền đa gen, đa nhân tố [3], [13] 1.1.4 Chẩn đốn điều trị glơcơm bẩm sinh ngun phát 1.1.4.1 Chẩn đoán xác định  Triệu chứng chủ quan -Sợ ánh sáng, co quắp mi: thường triệu chứng khởi đầu quan trọng bệnh nhân thường nheo mắt quay mắt nơi khác có ánh sáng chiếu vào mắt, trẻ nhỏ thường hay gục đầu vào lòng mẹ Sợ ánh sáng kích thích tế bào biểu mơ giác mạc áp lực nội nhãn tăng - Chảy nước mắt - Mờ mắt  Triệu chứng khách quan: - Mi mắt: có xu hướng khép lại nhằm hạn chế ánh sáng vào mắt - Giác mạc: Trong glôcôm bẩm sinh thường giác mạc to nhãn cầu to đặc biệt xuất trẻ tuổi Bình thường giác mạc có đường kính sinh 10 mm theo Kluys Ken, 9,4 - 11 mm theo Aminlari Đường kính giác mạc tuổi 11,5 mm theo Kluys Ken, 10,5 - 11,7 mm theo Aminlari [16] Trong glơcơm bẩm sinh giác mạc to bình thường , phù, có rách rạn màng Descemet - Lồi mắt trâu: giai đoạn muộn nhãn cầu bị dãn rộng hậu tăng nhãn áp lâu ngày Khi củng mạc dãn mỏng thường có màu đen xanh nhìn thấy hắc mạc phía diện củng mạc dãn lồi Dây Zinn dãn gây lệch thể thủy tinh - Tiền phòng sâu - Mống mắt: có dị tật kèm theo Đồng tử giãn, phản xạ trường hợp khơng chức - Khám đáy mắt thấy dấu hiệu teo lõm gai tùy theo mức độ bệnh Lõm gai glơcơm bẩm sinh hồi phục hồn tồn nhãn áp điều chỉnh tốt Đây điểm khác với lõm gai người lớn [17] - Soi góc tiền phòng Trong glơcơm bẩm sinh ngun phát soi góc tiền phòng thường thấy: + Chân mống mắt bám cao bám trước so với bình thường + Bè màng bồ đào biến đổi nhạt màu điều dễ làm cho ta khó phân biệt dải thể mi, vùng bè cựa củng mạc - Nhãn áp Ở trẻ lớn đo nhãn áp theo phương pháp hay dùng trẻ nhỏ thường phải đo nhãn áp trẻ ngủ gây mê - Thị lực: thử thường giảm - Thị trường: thường bị tổn hại - Siêu âm: đo trục trước sau nhãn nhãn cầu Ở trẻ sơ sinh trục nhãn cầu bình thường dài khoảng 17mm Trong năm đầu đời nhãn cầu phát triển nhanh, đến tuổi trục nhãn cầu đạt kích thước gần tương tự người lớn (23 đến 24mm) Trong glôcôm bẩm sinh nguyên phát đặc biệt trẻ tuổi, nhãn cầu dãn lồi theo hướng nhãn áp tăng, trục nhãn cầu thường lớn kích thước bình thường lưới tuổi  Triệu chứng toàn thân: - Đối với glơcơm bẩm sinh ngun phát thường khơng có dị tật bẩm sinh mắt toàn thân kèm theo Ngược lại glơcơm bẩm sinh thứ phát phát dị tật mắt toàn thân 1.1.4.2 Chẩn đoán giai đoạn - Ở Việt Nam, tác giả phân loại giai đoạn bệnh theo đường kính giác mạc sau [17]: + Giai đoạn 1: đường kính giác mạc ≤ 12 mm, giác mạc + Giai đoạn 2: đường kính giác mạc từ 12 đến 14 mm, giác mạc phù đục + Giai đoạn 3: đường kính giác mạc > 14mm, giác mạc phù đục trắng, nhãn cầu giãn lồi không hồi phục, chức 1.1.4.3 Điều trị glôcôm bẩm sinh nguyên phát  Điều trị nội khoa: - Điều trị nội khoa bước đầu chuẩn bị cho phẫu thuật điều trị bổ sung phẫu thuật Các thuốc co đồng tử khơng có tác dụng tác dụng [17]  Điều trị ngoại khoa: - Đối với glôcôm bẩm sinh, phương pháp điều trị phẫu thuật Mục đích phẫu thuật tạo điều kiện cho lưu thông thủy dịch tốt Hiện nay, có phương pháp phẫu thuật chính: Mở góc tiền phòng, Mở bè củng giác mạc, Phẫu thuật cắt bè củng giác mạc Phẫu thuật điện đông, lạnh đông thể mi [17] - Mở góc tiền phòng: Phẫu thuật thực lần khám đầu tiên, giác mạc nhìn thấy góc tiền phòng Đây phương pháp đơn giản, mang lại kết tốt, kết đạt 85% Tuy nhiên, phẫu thuật khơng thực đường kính giác mạc 14 mm - Mở bè củng giác mạc: Kỹ thuật định giác mạc mờ đục ngăn cản việc nhìn rõ góc tiền phòng phẫu thuật mở góc tiền phòng bị thất bại Mục đích phương pháp mở bè củng giác mạc đoạn dài để làm lưu thông ống Schlemm góc tiền phòng dễ dàng Tuy nhiên, khó khăn kỹ thuật việc xác định ống Schlemm - Phẫu thuật cắt bè củng - giác mạc: Kỹ thuật áp dụng cho tất giai đoạn glơcơm bẩm sinh Mục đích cắt mẩu bè củng giác mạc đoạn ống Schlemm tạo điều kiện cho lưu thông thủy dịch tốt - Phẫu thuật điện đông, lạnh đông thể mi: Phẫu thuật áp dụng mắt mắt chức thất bại với phương pháp phẫu thuật nêu 1.2 Vị trí, cấu trúc gen protein CYP1B1 1.2.1 Vị trí gen Gen CYP1B1 nằm nhánh ngắn nhiễm sắc thể vị trí 2p22.2 bao gồm exon, phần mã hóa gen exon thứ 2, chiều dài gen 1629 cặp base [9] Hình 1.1: Vị trí gen CYP1B1 [18] Trong loạt nghiên cứu nhiễm sắc thể 2, vùng chứa gen CYP1B1 xác định GLC3A [19] 1.2.2 Cấu trúc gen Gen CYP1B1 có exon intron, dài 12 kb, mã hóa phân tử mRNA gồm 1.631 base tổng hợp protein CYP1B1 [10] Ba exon gen CYP1B1 có độ dài 371; 1044 3707 bp Tuy nhiên, vùng mã hóa gen CYP1B1 đầu 5’ exon kết thúc exon Vùng mã hóa có chiều dài 1629 bp mã hóa protein 543 acid amin [20] Vị trí gen quy định tổng hợp vùng xác định gen CYP1B1 10 Hình 1.2: Sơ đồ vị trí gen tổng hợp vùng cấu trúc protein CYP1B1 [21] 1.2.3 Protein CYP1B1: Cấu trúc chức Sản phẩm protein gen CYP1B1 protein CYP1B1, phân họ enzym cytochrom P450 Chức men CYP1B1 chưa rõ ràng, giả thiết đóng vai trò việc hình thành cấu trúc phía trước mắt tham gia vào q trình điều chỉnh tiết thủy dịch Năm 1988, Ivaylo Stoilov cộng xây dựng mơ hình ba chiều vùng C' tận (C-terminal) protein CYP1B1 Cấu trúc gồm vùng I, J, K, L vùng gắn Hem 11 Li N, Zhou Y, Du L et al (2011) Overview of Cytochrome P450 1B1 gene mutations in patients with primary congenital glaucoma Experimental Eye Research, 93 (5), 572-579 12 K Kaur, A K Mandal S Chakrabarti (2011) Primary Congenital Glaucoma and the Involvement of CYP1B1 Middle East African Journal of Ophthalmology, 18 (1), 7-16 13 T Kakiuchi-Matsumoto, Y Isashiki, N Ohba et al (2001) Cytochrome P450 1B1 gene mutations in Japanese patients with primary congenital glaucoma(1) American journal of ophthalmology, 131 (3), 345-350 14 Anderson R (1981) The development of the trabecular meshwork and its abnormality in primary infantile glaucoma Trans Am Ophthalmol Soc, 79, 458-485 15 David S.W Garyfallia K.S (2005) Newborn Primary Congenital Glaucoma Journal of Pediatric Ophthalmology and Strabismus, 42, 333-341 16 Aminlari A (2000) Congenital and Pediatric Glaucoma Ophthalmic Fundamentals, 163, 1-12 17 Phan Dẫn (2008) Glôcôm bẩm sinh Nhãn khoa giản yếu, Nhà xuất y học, Tập II, 290-303 18 , 6/8/2017 19 Sarfarazi M, Akarsu AN, Hossain A et al (1592) Assignment of a locus (GLC3A) for primary congenital glaucoma (Buphthalmos) to 2p21 and evidence for genetic heterogeneity Genomics, 30 (2), 171-177 20 Mukesh Tanwar, Tanuj Dada, Ramanjit Sihota et al (2009) Mutation spectrum of CYP1B1 in North Indian congenital glaucoma patients Molecular Vision, 15, 1200-1209 21 Muneeb Faiq, Kuldeep Mohanty, Rima Dada et al (2013) Molecular Diagnostics and Genetic Counseling in Primary Congenital Glaucoma Journal of Current Glaucoma Practice, (1), 25-35 22 Stoilov I, Akarsu AN, Alozie I et al (1998) Sequence analysis and homology modeling suggest that primary congenital glaucoma on 2p21 results from mutations disrupting either the hinge region or the conserved core structures of cytochrome P4501B1 American Journal of Human Genetics, 62 (3), 573-584 23 Chen X, Chen Y, Wang L et al (2014) CYP1B1 genotype influences the phenotype in primary congenital glaucoma and surgical treatment The British Journal of Ophthalmology, 98 (2), 246-251 24 Mashima Y, Suzuki Y, Sergeev Y et al (2001) Novel cytochrome P4501B1 (CYP1B1) gene mutations in Japanese patients with primary congenital glaucoma Invest Ophthalmol Vis Sci, 42 (10), 2211-2216 25 Sitorus R, Ardjo SM, Lorenz B et al (2003) CYP1B1 gene analysis in primary congenital glaucoma in Indonesian and European patients J Med Genet, 40 (1), e9 26 Abu-Amero KK1, Osman EA, Mousa A et al (2011) Screening of CYP1B1 and LTBP2 genes in Saudi families with primary congenital glaucoma: genotype-phenotype correlation Molecular Vision, 17, 2911-2919 27 H.-J Kim, W Suh, S C Park et al (2011) Mutation spectrum of CYP1B1 and MYOC genes in Korean patients with primary congenital glaucoma Molecular Vision, 17, 2093-2101 28 Suh W Kee C (2012) A clinical and molecular genetics study of primary congenital glaucoma in South Korea The British Journal of Ophthalmology, 96 (11), 1372-1377 29 Tạ Thành Văn (2010) PCR số kỹ thuật y sinh học phân tử Nhà xuất Y học, Hà Nội, 81-82 30 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (2005) Sinh học phân tử Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội, 31 San Millán RM, Martínez-Ballesteros I, Rementeria A et al (2013) Online exercise for the design and simulation of PCR and PCR-RFLP experiments BMC Research Notes, 6, 513 32 Phạm Hùng Vân (2009) Real-time PCR-các vấn đề PCR real-time PCR- Các vấn đề áp dụng thường gặp, Nhà xuất Y học Hà Nội, 3, 56 33 Fereshteh Chitsazian, Betsabeh Khoramian Tusi Elahe Elahi (2007) CYP1B1 Mutation Profile of Iranian Primary Congenital Glaucoma Patients and Associated Haplotypes The Journal of Molecular Diagnostics, (3), 382 - 393 34 Stoilov IR, Costa VP, Vasconcellos JP et al (2002) Molecular genetics of primary congenital glaucoma in Brazil Invest Ophthalmol Vis Sci, 43 (6), 1820-1827 35 Plásilová M, Stoilov I, Sarfarazi M et al (1999) Identification of a single ancestral CYP1B1 mutation in Slovak Gypsies (Roms) affected with primary congenital glaucoma J Med Genet, 36 (4), 290-294 36 Gaurab Karki (2017) Sanger’s method of gene sequencing, , 10/8/2018 37 Rachel A McGovern (2015) The Sanger sequencing method 38 Đỗ Thị Thanh Thủy (2015) Sequencing lý thuyết, , 11/8/2018 39 Mei Yang, Xiangming Guo, Xing Liu et al (2009) Investigation of CYP1B1 mutations in Chinese patients with primary congenital glaucoma Mol Vis, 15, 432–437 40 T S Dietlein, P C Jacobi G K Krieglstein (1999) Prognosis of primary ab externo surgery for primary congenital glaucoma Br J Ophthalmol, 83 (3), 317 - 322 41 Do Tan, Shei W, Pham Thi Minh Chau et al (2016) CYP1B1 and MYOC Mutations in Vietnamese Primary Congenital Glaucoma Patients Journal of Glaucoma, 25 (5), 491-498 42 Adeli.K Ogbonna.G (1990) Rapid purification of human DNA from whole blood for potential application in clinical chemistry laboratories Clinical chemistry, 36 (2), 261-264 43 Khuất Hữu Thanh (2006) Nguyên lý kỹ thuật gen Kỹ thuật gen Nguyên lý ứng dụng, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, 102-123 44 Chouiter L Nadifi S (2017) Analysis of CYP1B1 Gene Mutations in Patients with Primary Congenital Glaucoma J Pediatr Genet, (4), 205-214 45 Badeeb OM, Micheal S, Koenekoop RK et al (2014) CYP1B1 mutations in patients with primary congenital glaucoma from Saudi Arabia BMC Med Genet, 15, 109 46 Geyer O, Wolf A, Levinger E et al (2011) Genotype/phenotype correlation in primary congenital glaucoma patients from different ethnic groups of the Israeli population Am J Ophthalmol, 151 (2), 263-271 PHỤ LỤC MẪU BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU Mã bệnh án: Bệnh viện: Mã bệnh nhân: Phần hành Họ tên: Tuổi: Giới: □ Nam □ Nữ Địa chỉ: Điện thoại: Nghề nghiệp: Dân tộc: Người thân: Điện thoại: Điều trị nội trú tại: Ngày vào viện: / / Ngày viện: / ./ Phần nghiên cứu 2.1 Lý vào viện: 2.2 Triệu chứng: Số mắt bị bệnh Nhãn áp Chói, chảy nước mắt, sợ ánh sáng Đường kính giác mạc Tình trạng giác mạc Tiền phòng Lõm teo gai thị 2.3 Chẩn đoán giai đoạn:…… 2.4 Số lần phẫu thuật thực hiện: BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN SƠN TÙNG BƯỚC ĐẦU XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN CYP1B1 GÂY BỆNH GLÔCÔM BẨM SINH NGUYÊN PHÁT Chuyên ngành: Hóa sinh Mã số: 60720106 LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS TRẦN VÂN KHÁNH HÀ NỘI – 2018 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, tơi xin chân thành cảm ơn: PGS TS BS Trần Vân Khánh, Trưởng Bộ môn Bệnh học phân tử, Khoa kỹ thuật Y học, Phó Giám đốc Trung tâm nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội, người Cô tận tình hướng dẫn, dìu dắt, tạo điện kiện thuận lợi trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn GS TS BS Tạ Thành Văn, Giám đốc Trung tâm nghiên cứu Gen Protein, Trưởng Bộ mơn Hóa sinh, Phó Hiệu trưởng Trường Đại học Y Hà Nội, tạo điều kiện tốt cho học tập tham gia nghiên cứu Trung tâm PGS TS BS Trần Huy Thịnh, Phó Trưởng Bộ mơn Hóa sinh Thầy, Cơ Bộ mơn Hóa sinh ln giúp đỡ, tận tình giảng dạy cho tơi q trình học tập mơn làm luận văn Tôi xin cảm ơn Sở Khoa học Công nghệ Hà Nội cấp kinh phí cho tơi thực hồn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới BS Trần Thu Hà, Bệnh viện Mắt Trung ương giúp lựa chọn bệnh nhân hoàn thành luận văn Tơi bày tỏ lòng biết ơn đến cử nhân Trịnh Thị Thanh Hương toàn thể anh, chị, em Trung tâm nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội tạo điều kiện nhiệt tình hướng dẫn tơi q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, quan bạn bè động viên, ủng hộ q trình học tập hồn thành luận văn Hà nội, ngày 13 tháng năm 2018 Nguyễn Sơn Tùng LỜI CAM ĐOAN Tôi Nguyễn Sơn Tùng, bác sỹ nội trú khóa 41 chuyên ngành Hóa sinh, Trường đại học Y Hà Nội, xin cam đoan: Đây luận văn thân trực tiếp thực hướng dẫn PGS TS BS Trần Vân Khánh Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực, khách quan xác nhận sở Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà nội, ngày 13 tháng năm 2018 Nguyễn Sơn Tùng DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT A ARMS-PCR : Adenin : Amplification Refractory Mutation System (kỹ thuật khuếch Bp BN C CYP1B1 DNA dNTP ddNTP G PCG PCR RFLP đại đột biến bền với nhiệt) : Base pair : Bệnh nhân : Cytosine : Cytochrome P450, family 1, subfamily B, polypeptide : Deoxyribonucleotid Acid : Deoxyribonucleotid-5-triphosphate : Dideoxyribonucleotid-5-triphosphate : Guanine : Primary congenital glaucoma (Glôcôm bẩm sinh nguyên phát) : Polymerase chain reaction (phản ứng khuếch đại chuỗi gen) : Restriction fragment length polymorphism (đa hình chiều dài T SNP SSCP phân đoạn cắt giới hạn) : Thymine : Single nucleotide polymorphism (đa hình thái đơn nucleotid) : Single strand conformational polymorphism (đa hình thái cấu trúc chuỗi đơn ) MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Sơ lược glôcôm bẩm sinh nguyên phát 1.1.1 Khái niệm dịch tễ học glôcôm bẩm sinh nguyên phát .3 1.1.2 Phân loại glôcôm bẩm sinh nguyên phát 1.1.3 Giải phẫu bệnh, sinh lí bệnh glơcơm bẩm sinh nguyên phát 1.1.4 Chẩn đoán điều trị glôcôm bẩm sinh nguyên phát 1.2 Vị trí, cấu trúc gen protein CYP1B1 1.2.1 Vị trí gen .9 1.2.2 Cấu trúc gen 1.2.3 Protein CYP1B1: Cấu trúc chức 10 1.3 Đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát 13 1.3.1 Các dạng đột biến cấu trúc gen CYP1B1 .13 1.3.2 Các vị trí đột biến gen CYP1B1 DNA 15 1.4 Các kĩ thuật phát đột biến gen CYP1B1 19 1.4.1 Kỹ thuật PCR 19 1.4.2 Kỹ thuật PCR-RFLP 22 1.4.3 Kỹ thuật SSCP 23 1.4.4 Kỹ thuật ARMS-PCR 25 1.4.5 Kỹ thuật giải trình tự gen 26 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .32 2.1 Đối tượng nghiên cứu 32 2.2 Phương pháp nghiên cứu 33 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 33 2.2.2 Kỹ thuật thu thập thông tin 34 2.2.3 Nội dung biến số nghiên cứu 34 2.2.4 Dụng cụ, trang thiết bị hóa chất nghiên cứu 34 2.2.5 Quy trình kỹ thuật .35 2.2.6 Xử lý phân tích số liệu 37 2.3 Vấn đề đạo đức nghiên cứu 37 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 38 3.1 Thông tin chung đối tượng nghiên cứu 38 3.2 Kết tách chiết DNA .40 3.3 Kết điện di DNA tổng số kiểm tra chất lượng DNA 42 3.4 Kết PCR khuyếch đại exon gen CYP1B1 42 3.5 Kết xác định đột biến gen CYP1B1 giải trình tự gen 43 3.6 Mối liên quan đột biến gen CYP1B1 số đặc điểm lâm sàng bệnh nhân nghiên cứu 53 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 57 4.1 Bàn luận thông tin chung đối tượng nghiên cứu 57 4.2 Bàn luận kết tách chiết DNA 58 4.3 Bàn luận kết điện di DNA tổng số kiểm tra chất lượng DNA 59 4.4 Bàn luận kết PCR khuếch đại exon gen CYP1B1 59 4.5 Bàn luận kết xác định đột biến gen CYP1B1 59 4.6 Bàn luận mối liên quan đột biến gen CYP1B1 số đặc điểm lâm sàng nhóm bệnh nhân nghiên cứu .63 KẾT LUẬN 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢN Bảng 1.1: Bảng mô tả đột biến gen CYP1B1 dự đoán vùng ảnh hưởng .11 Bảng 1.2: Bảng tỉ lệ đột biến gen CYP1B1 số nước châu Á 14 Bảng 1.3: Bảng cặp mồi khuyếch đại gen CYP1B1 .22 Bảng 2.1: Trình tự mồi dùng cho phản ứng PCR 36 Bảng 3.1: Đặc điểm tuổi bệnh nhân nghiên cứu 39 Bảng 3.2: Nồng độ độ tinh mẫu DNA tách chiết từ mẫu máu bệnh nhân nghiên cứu 41 Bảng 3.3 Kết xác định đột biến gen CYP1B1 bệnh nhân nghiên cứu 48 Bảng 3.4: Kết dự đoán gây bệnh đột biến điểm gen CYP1B1 49 Bảng 3.5: Tỷ lệ dạng đột biến gen CYP1B1 52 Bảng 3.6: Kết phát đa hình gen SNP bệnh nhân nghiên cứu .52 Bảng 3.7 So sánh tuổi khởi phát nhóm có đột biến nhóm khơng có đột biến gen CYP1B1 53 Bảng 3.8 So sánh số mắt mắc nhóm bệnh nhân có đột biến nhóm bệnh nhân khơng có đột biến gen CYP1B1 53 Bảng 3.9 So sánh đuờng kính giác mạc nhóm bệnh nhân có đột biến nhóm bệnh nhân khơng có đột biến gen CYP1B1 .54 Bảng 3.10 So sánh nhãn áp hai mắt nhóm bệnh nhân có đột biến nhóm bệnh nhân khơng có đột biến gen CYP1B1 .55 Bảng 3.11 So sánh số lần phẫu thuật hai nhóm bệnh nhân có đột biến bệnh nhân khơng có đột biến gen CYP1B1 56 Bảng 4.1: Kết phát tỷ lệ đột biến bệnh nhân châu Á 60 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Biểu đồ tỷ lệ giới đối tượng nghiên cứu .38 Biểu đồ 3.2: Phân bố đột biến điểm gen CYP1B1 49 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Vị trí gen CYP1B1 Hình 1.2: Sơ đồ vị trí gen tổng hợp vùng cấu trúc protein CYP1B1 10 Hình 1.3: Hình ảnh khơng gian chiều vùng C' tận protein CYP1B1 11 Hình 1.4: Sơ đồ minh họa chế ảnh hưởng đột biến gen CYP1B1 12 Hình 1.5: Sự phân bố đột biến gen CYP1B1 15 Hình 1.6: Sự phân bố đột biến gen CYP1B1 thường gặp người da trắng 16 Hình 1.7: Sự phân bố đột biến gen CYP1B1 người châu Á 17 Hình 1.8: Giải trình tự gen CYP1B1, p.V419Gfs11X đột biến xóa đoạn phát bệnh nhân dị hợp tử 18 Hình 1.9: Các bước kĩ thuật PCR .21 Hình 1.10: Hình ảnh điện di sản phẩm sau dùng enzym cắt giới hạn 23 Hình 1.12 Cấu trúc phân tử dNTP ddNTP 27 Hình 1.13: Minh họa phản ứng gắn ddNTP làm dừng phản ứng tổng hợp DNA 28 Hình 1.14: Nguyên lý giải trình tự theo phương pháp dideoxynucleotid 30 Hình 1.15: Nguyên lý kỹ thuật giải trình tự gen 31 Hình 3.1: Minh họa đo OD mẫu DNA tách chiết máy Nanodrop 1000 bệnh nhân mã số G13 40 Hình 3.2: Kết điện di DNA tổng số 42 Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại exon gen CYP1B1 43 Hình 3.4: Hình ảnh đại diện cho đột biến Q86K exon gen CYP1B1 kỹ thuật giải trình tự gen 44 Hình 3.5: Hình ảnh đại diện cho đột biến D218H exon gen CYP1B1 kỹ thuật giải trình tự 44 Hình 3.6: Hình ảnh đại diện cho đột biến V198I exon gen CYP1B1 kỹ thuật giải trình tự gen 45 Hình 3.7: Hình ảnh đại diện cho đột biến E229K exon gen CYP1B1 kỹ thuật giải trình tự 45 Hình 3.8: Hình ảnh đại diện cho đa hình gen R48G exon gen CYP1B1 kỹ thuật giải trình tự 46 Hình 3.9: Hình ảnh đại diện cho đột biến A119S exon gen CYP1B1 kỹ thuật giải trình tự 47 Hình 3.10: Hình ảnh đại diện cho đột biến L432V exon gen CYP1B1 kỹ thuật giải trình tự 47 Hình 3.11: Hình ảnh cấu trúc protein CYP1B1 với đột biến p.Q86K 50 Hình 3.12: Hình ảnh cấu trúc protein CYP1B1 với đột biến p.D218H 51 ... thận bẩm sinh, tạo xương bất toàn Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu đột biến gen gây bệnh glơcơm bẩm sinh ngun phát Vì tiến hành đề tài Bước đầu xác định đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh. .. glôcôm bẩm sinh nguyên phát với mục tiêu: Xác định đột biến exon gen CYP1B1 bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát 3 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược glôcôm bẩm sinh nguyên phát 1.1.1 Khái... cứu đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát nước châu Á báo cáo ngày nhiều Năm 2011, nghiên cứu tác giả Kim Hee-Jung cộng 85 bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát phát 22 bệnh