Nghiên cứu xác định đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát và phát hiện người lành mang gen bệnh

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Glôcôm bẩm sinh nguyên phát tình trạng tăng nhãn áp phát triển bất thường bán phần trước nhãn cầu Bệnh thường xảy hai mắt (65%-80%), phát giai đoạn muộn, điều trị gặp tỷ lệ thất bại cao không điều trị kịp thời theo dõi chặt chẽ Đây nguyên nhân gây mù lòa quan trọng trẻ nhỏ , , Glôcôm bẩm sinh nguyên phát bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường với tần suất mắc bệnh khoảng 1/10.000 [4], Một số nghiên cứu trước mối liên quan bệnh với tình trạng đột biến gen CYP1B1, LTBP2, MYOC, đột biến gen CYP1B1 chiếm tỷ lệ cao (10%100%) , , đột biến gen MYOC LTBP2 gặp (0%-5,5%) , , , , Đột biến gen CYP1B1 chủ yếu đột biến điểm nằm rải rác toàn chiều dài gen, với tỷ lệ phát đột biến khác quốc gia giới (Nhật 23,1%, Indonesia 38,1%, Ấn Độ 44% Ả Rập tỷ lệ cao 100% tình trạng kết hôn cận huyết gây nên) , , Những nghiên cứu mức độ in vitro in vivo protein CYP1B1 đóng vai trò quan trọng việc hình thành cấu trúc trì chức mắt Theo Khan cộng (2012), 90% người mang đột biến gen CYP1B1 biểu bệnh hai mắt với mức độ khác Trong năm gần đây, nghiên cứu bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát tập trung sâu vào chế bệnh sinh mức độ phân tử, làm sở cho việc triển khai chẩn đoán trước sinh liệu pháp điều trị gen, đồng thời giúp việc quản lý tốt người mang gen gây bệnh Tại Việt Nam có nhiều nghiên cứu phân tích đột biến gen cho bệnh lý di truyền như: ung thư võng mạc, tăng sản thượng thận bẩm sinh, Wilson, Thalassemia…, nhiên nghiên cứu bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát đề cập tỉ lệ mắc bệnh, biểu lâm sàng, kết điều trị biến chứng bệnh Hàng năm bệnh viện Mắt Trung ương tiếp nhận khoảng 20 ca bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát mắc Áp dụng phát người lành mang gen bệnh chẩn đoán trước sinh để đưa tư vấn di truyền thích hợp làm giảm tỷ lệ trẻ mắc bệnh cộng đồng lâu dài tác động tốt tới phát triển kinh tế, xã hội Xuất phát từ thực tiễn này, đề tài "Nghiên cứu xác định đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát phát người lành mang gen bệnh" thực với hai mục tiêu: Xác định đột biến gen CYP1B1 mối liên quan với lâm sàng bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát Phát người lành mang gen bệnh thành viên gia đình có quan hệ huyết thống với bệnh nhân glơcơm bẩm sinh nguyên phát CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Đại cương bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát Từ thời Hippocrates vào năm 460-377 trước công nguyên, Celus kỷ thứ Galen năm 130-201 sau công nguyên ghi nhận bệnh mắt to (buphthalmos) bẩm sinh thời điểm chưa biết có mối liên quan mắt to nhãn áp Cho đến kỷ 18, Berger (1744) đề cập đến vấn đề tăng nhãn áp phân vào nhóm bệnh di truyền Năm 1896, Von Muralt xác định trường hợp mắt to gia đình bệnh glơcơm Năm 1970, Shaffer Weiss định nghĩa glôcôm bẩm sinh nguyên phát "glôcôm di truyền phổ biến trẻ em, di truyền lặn nhiễm sắc thể thường, với bất thường đặc biệt góc khơng có tượng lùi điểm gắn chân mống mắt tạo góc vùng bè khơng kèm bất thường phát triển khác" Tăng nhãn áp nguyên nhân gây giác mạc to, đục chảy nước mắt rạn màng Descemet 1.1.2 Dịch tễ học bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát Glôcôm bẩm sinh nguyên phát bệnh gặp, có tần suất khoảng 1/20.000 đến 1/10.000 trẻ sinh sống nước châu Âu Mỹ Trong tỷ lệ cao cộng đồng có cha mẹ huyết thống 1/3.300 Ấn Độ, 1/2.500 Trung Đông 1/2.250 Slovakia hay Rumani Bệnh chiếm 55% tổng số glôcôm nguyên phát trẻ em Ở Nhật Bản, trẻ nữ bị nhiều nam Mỹ châu Âu trẻ nam mắc nhiều với tỷ lệ 3:2 Bệnh xảy khắp giới không ưu rõ rệt chủng tộc, địa lý Hầu hết trường hợp glôcôm bẩm sinh nguyên phát xảy hai mắt (65% - 80%) với mức độ bệnh thường không tương đương Khoảng 25% khởi bệnh lúc sinh, 60% trẻ chẩn đoán tháng tuổi 80% xuất năm tuổi 1.1.3 Cơ chế bệnh sinh bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát Qua nghiên cứu q trình phát triển phơi thai học giải phẫu học góc tiền phòng cho thấy chế tăng nhãn áp glôcôm bẩm sinh khác hồn tồn với chế glơcơm góc đóng glơcơm góc mở người trưởng thành Các nghiên cứu sớm Von Hippel (1897), Gros (1897), Parson (1904), Siegrist (1905), Reis (1905–1911), Seefelder (1906 - 1920) phát bất thường bẩm sinh cấu trúc góc tiền phòng ống Schlemm Barkan năm 1949 cho có tồn màng phơi thai lưới bè năm 1966 Worst khẳng định điều này, gọi màng Barkan Tuy nhiên nghiên cứu Anderson, Hansson, Maumenee khơng tìm thấy chứng màng Barkan ánh sáng đèn sinh hiển vi điện tử lại phát mặt trước mống mắt bám cao vào vùng bè (Hình 1.1) Smelser Ozanics lại cho chế bệnh thay đổi mạng lưới bè màng bồ đào, đồng thời có chất vơ định tạo thành lớp dày nội mô thành ống Schlemm , , , , Hình 1.1 Phát triển phần mống mắt bề mặt vùng bè Ngày nay, thuyết di truyền glôcôm bẩm sinh nguyên phát ngày đề cập đến nhiều sáng tỏ qua nghiên cứu Người ta cho gen CYP1B1, LTBP2, MYOC bị đột biến làm rối loạn sản xuất men, thay đổi phản ứng hóa sinh nội bào, tạo nên bất thường cấu trúc mạng lưới vùng bè, dẫn đến ứ trệ thủy dịch làm tăng nhãn áp , Gen MYOC nằm nhánh dài nhiễm sắc thể vị trí 1q24.3, có tên gọi GLC1A cho giúp trì cấu trúc góc tiền phòng, thể mi mạng lưới bè củng giác mạc nhiên nghiên cứu đưa tỷ lệ đột biến gen MYOC thấp bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát Theo nghiên cứu Kim tỷ lệ 2,4%, nghiên cứu Kaur 5,5% nhiều nghiên cứu khác khơng tìm đột biến gen MYOC bệnh , Hình 1.2 Vị trí gen MYOC nhánh dài nhiễm sắc thể Gen LTBP2 hay gọi GLC3D nằm nhánh dài nhiễm sắc thể 14 vị trí 14q24.3 Gen LTBP2 khơng có đột biến gây bệnh mà dạng đa hình gen độc lập phối hợp với đột biến gen CYP1B1 Nghiên cứu Trung Quốc, Ả Rập Thổ Nhĩ Kỳ cho tỷ lệ đột biến gen LTBP2 0% , , Hình 1.3 Vị trí gen LTBP2 nhánh dài nhiễm sắc thể 14 Trong số gen nói trên, có đột biến gen CYP1B1 chứng minh gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát với tỷ lệ đột biến cao từ 10% đến 100% tùy theo vùng lãnh thổ , Vì vậy, chúng tơi sâu vào nghiên cứu đặc điểm chế gây bệnh gen CYP1B1 1.1.3.1 Cấu trúc vị trí gen CYP1B1 Tên khoa học thức gen CYP1B1 "cytochrome P450, family 1, subfamily B, polypeptide 1” Ngồi gen CYP1B1 gọi với tên khác như: aryl hydrocarbon hydroxylase, CP1B, CP1B1_HUMAN, cytochrome P450-subfamily I (dioxin-inducible) -polypeptide 1, flavoprotein - linked monooxygenas, microsomal monooxygenase, xenobiotic monooxygenase Năm 1994, Sutter cộng xác định gen CYP1B1gồm 543 acid amin phân họgen cytochrome P450, P4501B1 Bằng cách phân tích tế bào sinh dưỡng người động vật gặm nhấm, tác giả lập đồ gen CYP1B1 xác định gen nằm nhiễm sắc thể Năm 1996, Tang cộng phát gen CYP1B1 nằm nhánh ngắn nhiễm sắc thể vị trí 2p22.2 bao gồm exon, phần mã hóa gen exon thứ 2, chiều dài gen 1629 cặp base Từ việc xác định vị trí nối intron/exon gen CYP1B1, Stoilov cộng (1997) gen CYP1B1 có exon intron, dài 12kb, mã hóa phân tử mRNA gồm 1.631base Cụ thể nữa, gen CYP1B1 nằm từ cặp base số 38.067.602 đến 38.076.180 (Phụ lục 1) Trong loạt nghiên cứu nhiễm sắc thể 2, vùng chứa gen CYP1B1 xác định GLC3A Hình 1.4 Vị trí gen CYP1B1 nhánh ngắn nhiễm sắc thể Năm 1998, Ivaylo Stoilov cộng xây dựng mơ hình ba chiều vùng C' tận (C-terminal) protein CYP1B1 Cấu trúc gồm bốn vùng I, L, J K với vùng gắn heme mô tả đột biến dẫn đến thiếu sản phẩm acid amin 189 254, acid amin từ vùng C Glu387, Arg390 Cys470 Hình 1.5 Hình ảnh khơng gian chiều vùng C' tận protein CYP1B1 1.1.3.2 Chức năng, chế gây bệnh gen CYP1B1 Gen CYP1B1 phân họ cytochrome P450 Các cytochrome dòng P450 biết đến chủ yếu với khả chuyển hóa chất lạ sinh học (xenobiotics) có chức giống phân tử men Các cytochrome tham gia vào phản ứng oxy hóa như: sinh tổng hợp, sản xuất hormon cần thiết đóng vai trò hợp chất trao đổi chất trung gian hầu hết sinh vật sống Đột biến ảnh hưởng đến men thường tạo đột biến lặn Đối với đột biến lặn dạng dị hợp tử, alen bình thường có khả bù đắp chức cho alen bị đột biến Từ quan điểm này, kiểu hình lặn glơcơm bẩm sinh ngun phát gây đột biến loại men CYP1B1 hợp lý Trong trình hình thành phát triển nhãn cầu, chức men CYP1B1 chưa rõ ràng, giả thiết đóng vai trò việc hình thành cấu trúc phía trước mắt tham gia vào trình điều chỉnh tiết thủy dịch Schwartzman cộng năm 1987 xác định có mối liên quan arachidonate phụ thuộc cytochrome P450 với ức chế Na+,K+-ATPase giác mạc việc điều chỉnh tính suốt giác mạc tiết thủy dịch Phát phù hợp với mờ đục giác mạc tăng nhãn áp, tiêu chuẩn chẩn đốn cho bệnh glơcơm bẩm sinh ngun phát Stoilov (2000) đưa giả thuyết CYP1B1 chuyển hóa phân tử có nguồn gốc nội sinh (như steroid, axit béo hợp chất prostanoid) cần thiết cho phát triển bình thường chức mắt Hoạt động CYP1B1 hai dạng: tạo hợp chất hoạt động số mục tiêu ngừng tác dụng hợp chất sinh học khác chiếm vị trí Tuy nhiên phân tử chuyển hóa q trình kích hoạt có tổ chức men Vì vậy, CYP1B1 thuộc đường tín hiệu sinh hóa nội sinh chưa biết rõ, liên quan đến trưởng thành cuối góc tiền phòng Đột biến gen CYP1B1 gây rối loạn sản xuất men, làm bất thường cấu trúc mạng lưới vùng bè, nơi có ống tuyến giúp lưu thủy dịch khỏi mắt Sự ứ trệ thủy dịch làm tăng nhãn áp gây bệnh glôcôm Thể hoang dại CYP1B1 Đích tác động Thể đột biến CYP1B1 Mất chức Cơ chất Hoạt hóa hay Bất hoạt gắn heme Đột biến cắt cụt Đột biến vùng lề Đột biến vùng lõi Hình 1.6 Sơ đồ minh họa chế ảnh hưởng đột biến gen CYP1B1 Có khác biệt tác động thể hoang dại thể đột biến phân tử CYP1B1 Phân tử CYP1B1 thể hoang dại neo màng lưới nội ngun sinh Chức bình thường đòi hỏi tham gia số đối tác oxy hóa khử P450 reductase P450 reductase có khả đưa nguyên tử phân tử oxy vào chất Khi có khả xảy ra: trường hợp chất hoạt hóa tác động mục tiêu xi dòng chưa biết Tuy nhiên, oxy phân tử làm tăng khả ưa nước chất làm dễ dàng cho tiết lọc chất từ tế bào Bởi vậy, đột biến CYP1B1 làm thay đổi khả Sự điều hòa khơng gian thời gian gen kiểm soát phát triển góc tiền phòng bị thay đổi vắng mặt phân tử điều hòa (ví dụ steroid) sản sinh CYP1B1 Bên cạnh đó, dấu hiệu dừng phát triển góc tiền phòng quan sát thấy góc tiền phòng glơcơm bẩm sinh nguyên phát phản ánh ảnh hưởng q trình chuyển hóa giới hạn loại bỏ phân tử CYP1B1 (Hình 1.6) 10 1.1.4 Chẩn đốn bệnh glơcơm bẩm sinh ngun phát 1.1.4.1 Đặc điểm lâm sàng bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát Triệu chứng: gồm tam chứng kinh điển - Sợ ánh sáng, co quắp mi: thường triệu chứng khởi đầu quan trọng Bệnh nhân thường nheo mắt quay mặt nơi khác có ánh sáng chiếu vào mắt, trẻ nhỏ thường hay gục đầu vào lòng mẹ Sợ ánh sáng kích thích tế bào biểu mô giác mạc áp lực nội nhãn tăng - Chảy nước mắt - Mờ mắt Dấu hiệu lâm sàng: để chẩn đốn xác định glơcơm bẩm sinh cần phải khám đánh giá nhiều thông số, trẻ nhỏ không hợp tác cần khám gây mê - Mi mắt: có xu hướng khép lại nhằm hạn chế ánh sáng vào mắt - Giác mạc: thường to nhãn cầu to đặc biệt xuất trẻ tuổi Bình thường sinh giác mạc có đường kính ngang 10-10,5mm tăng thêm 0,5-1mm sau năm Theo Kluys Ken, đường kính sinh 10mm, tuổi 11,5mm; theo Aminlary đường kính giác mạc lúc sinh 9,4-11mm, lúc tuổi 10,5-11,7mm 12mm tuổi Trong năm đầu đường kính ngang lớn 12mm dấu hiệu nghi ngờ glôcôm bẩm sinh nguyên phát Rạn màng Descemet (vết Haab’s): vệt trắng ngang trung tâm song song với rìa chu biên giác mạc Dấu hiệu thường khơng gặp giác mạc có đường kính ngang 12,5mm bệnh xuất sau tuổi HÀ NỘI – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NI TRN THU H Nghiên cứu xác định đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát phát ngời lành mang gen bệnh Chuyờn ngnh: Nhón khoa Mã số : 62720157 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Vân Khánh PGS.TS Vũ Thị Bích Thủy HÀ NỘI – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi Trần Thu Hà nghiên cứu sinh khoá 33, chuyên ngành nhãn khoa, Trường Đại học Y Hà Nội xin cam đoan: Đây luận án thân trực tiếp thực hướng dẫn PGS.TS Trần Vân Khánh PGS.TS Vũ Thị Bích Thủy Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thơng tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam đoan Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Người viết cam đoan Trần Thu Hà CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tiếng Việt BN : Bệnh nhân MP : Mắt phải MT : Mắt trái NR : Đa hình gen PCR : Polymerase Chain Reaction SNP : Đa hình gen UD : Đột biến chưa xác định Tiếng Anh DNA : Deoxyribonucleic acid MLPA : Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification Bảng viết tắt amino acid MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát 1.1.2 Dịch tễ học bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát 3 1.1.3 Cơ chế bệnh sinh bệnh glôcôm bẩm sinh ngun phát 1.1.4 Chẩn đốn bệnh glơcơm bẩm sinh nguyên phát 1.1.5 Điều trị bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát 10 15 1.2 Đột biến gen CYP1B1 mối liên quan với lâm sàng 16 1.2.1 Đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát 16 1.2.2 Các kỹ thuật phát đột biến gen CYP1B1 22 1.2.3 Mối liên quan bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát với đột biến gen 28 1.3 Đột biến CYP1B1 phát người lành mang gen bệnh 31 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1 Đối tượng nghiên cứu 36 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn 36 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 36 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 37 2.3 Phương pháp nghiên cứu37 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu.37 2.3.2 Cỡ mẫu chọn mẫu nghiên cứu 37 2.3.3 Phương tiện nghiên cứu 37 2.3.4 Các bước tiến hành nghiên cứu 40 2.4 Vấn đề đạo đức nghiên cứu 47 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 48 3.1 Đặc điểm bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát 3.1.1 Phân bố bệnh nhân theo tuổi phát bệnh 3.1.2 Phân bố bệnh nhân theo giới 48 3.1.3 Tiền sử bệnh nhân gia đình 49 48 48 3.1.4 Tình trạng mắt bị bệnh bệnh nhân 49 3.1.5 Phân bố giai đoạn bệnh 49 3.1.6 Triệu chứng năng50 3.1.7 Dấu hiệu thực thể 50 3.2 Kết xác định đột biến gen CYP1B1 mối liên quan với lâm sàng 52 3.2.1 Kết xác định đột biến gen CYP1B1 Error! Bookmark not defined 3.2.2 Kết xác định đột biến gen CYP1B1bằng kỹ thuật giải trình tự 52 3.2.3 Kết xác định đột biến gen CYP1B1bằng kỹ thuật MLPA 58 3.2.4 Mối liên quan lâm sàng đột biến gen CYP1B1 55 3.3 Kết phát người lành mang gen bệnh thành viên gia đình bệnh nhân glơcơm bẩm sinh ngun phát 3.3.1 Phả hệ có di truyền đột biến 65 68 3.3.2 Phả hệ không di truyền đột biến 74 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 79 4.1 Nhận xét số đặc điểm bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát 79 4.1.1 Sự phân bố bệnh nhân theo tuổi phát bệnh 79 4.1.2 Sự phân bố bệnh nhân theo giới 79 4.1.3 Tiền sử bệnh nhân gia đình 80 4.1.4 Tình trạng mắt bị bệnh bệnh nhân 80 4.1.5 Giai đoạn bệnh mắt bệnh nhân 80 4.1.6 Triệu chứng năng81 4.1.7 Dấu hiệu thực thể 81 4.2 Kết xác định đột biến gen CYP1B1 mối liên quan với lâm sàng bệnh glơcơm bẩm sinh ngun phát 83 4.2.1 Tình trạng đột biến gen CYP1B1 83 4.2.2 Mối liên quan lâm sàng đột biến gen CYP1B1 88 4.3 Đột biến gen CYP1B1 thành viên gia đình bệnh nhân 96 4.3.1 Các phả hệ có di truyền đột biến 97 4.3.2 Các phả hệ không di truyền đột biến KẾT LUẬN 102 110 KHUYẾN NGHỊ 112 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ ĐƯỢC CƠNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các loại đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát nước khác tính đến năm 2010 17 Bảng 1.2 Các loại đột biến gen CYP1B1 hay gặp theo vùng lãnh thổ 19 Bảng 1.3 Phân loại mức độ nặng bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát 30 Cả bệnh nhân mang đột biến gen biểu bệnh nặng kết điều trị kém, thị lực đạt tối đa 20/100, có mắt chức hồn tồn, thị lực sáng tối âm tính (ST-), mắt thấy bóng bàn tay (BBT) 33 Bảng 1.4 Lâm sàng điều trị bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát phả hệ 33 Bảng 2.1 Tên, kích thước vị trí sản phẩm PCR Kit MLPA P128-CYP450 (MRC- Holland) 39 39 Bảng 2.2 Trình tự mồi dùng cho phản ứng PCR 43 Bảng 3.1 Tuổi phát bệnh 48 Bảng 3.2 Phân bố mắt theo giai đoạn bệnh 50 Bảng 3.3 Tỷ lệ triệu chứng 50 Bảng 3.4 Tình trạng giác mạc nhóm nghiên cứu 51 Bảng 3.5 Đặc điểm bệnh nhân mang đột biến gen CYP1B1 53 Bảng 3.6 Tỷ lệ dạng đột biến gen CYP1B1 55 Bảng 3.7 Kết dự đoán gây bệnh đột biến điểm gen CYP1B1 56 Bảng 3.8 Các đa hình SNP gen CYP1B1 bệnh nhân nghiên cứu 57 Bảng 3.9 Mối liên quan thời gian phát bệnh đột biến gen 56 Bảng 3.10 Mối liên quan giới tính tình trạng đột biến gen 56 Bảng 3.11 Mối liên quan tiền sử mắc bệnh mẹ mang thai với tình trạng đột biến gen CYP1B1 57 Bảng 3.12 Mối liên quan tình trạng đột biến gen với số mắt bị bệnh 57 Bảng 3.13 Mối liên quan giai đoạn bệnh với tình trạng đột biến gen 58 Trong số 85 bệnh nhân, đo nhãn áp cho 143 mắt 59 Bảng 3.14 Mối liên quan nhãn áp với đột biến gen CYP1B1 59 Bảng 3.15 Mối liên quan đường kính giác mạc với đột biến gen59 Bảng 3.16 Mối liên quan chiều dài trục nhãn cầu với đột biến gen 60 Bảng 3.17 Mối liên quan mức độ lõm đĩa với đột biến gen CYP1B1 60 Bảng 3.18 Mối liên quan số lần phẫu thuật với tình trạng đột biến 61 Bảng 3.19 Mối liên quan thời gian xuất bệnh với tình trạng 63 đột biến 63 Khi xét yếu tố thời gian xuất bệnh với tình trạng đột biến gen thấy nhóm bệnh nhân xuất bệnh sau sinh tỷ lệ đột biến gen 25%, nhóm bệnh nhân xuất bệnh muộn 18,9% Khả đột biến gen CYP1B1 nhóm bệnh nhân biểu bệnh sớm sau sinh cao gấp 1,43 lần so với khả đột biến nhóm bệnh nhân biểu bệnh muộn nhiên khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê với khoảng tin cậy 95% có chứa 63 Bảng 3.20 Mối liên quan thời gian xuất bệnh số mắt bị bệnh với tình trạng đột biến 64 64 Khi xét hai yếu tố kết hợp thời gian xuất bệnh sau sinh tình trạng biểu bệnh hai mắt thấy tỷ lệ đột biến gen nhóm 34,5%, nhóm bệnh nhân khơng có lúc hai yếu tố tỷ lệ đột biến gen 14,3% Khả đột biến gen CYP1B1 nhóm bệnh nhân mang đồng thời hai đặc điểm bệnh biểu sớm sau sinh hai mắt cao gấp 3,16 lần so với khả đột biến nhóm bệnh nhân biểu bệnh muộn và/hoặc bệnh mắt, khác biệt có ý nghĩa thống kê với khoảng tin cậy 95% không chứa 64 Bảng 3.21 Mối liên quan thời gian xuất bệnh, số mắt bị bệnh giai đoạn bệnh với tình trạng đột biến 65 Khi xét ba yếu tố kết hợp thời gian xuất bệnh sau sinh, tình trạng biểu bệnh hai mắt thấy tỷ lệ đột biến gen nhóm 53,8% cao nhóm bệnh nhân khơng có đồng thời ba đặc điểm 15,3% Khả đột biến gen CYP1B1 nhóm bệnh nhân mang đồng thời ba đặc điểm bệnh biểu sớm sau sinh, hai mắt giai đoạn bệnh nặng cao gấp 6,47 lần so với khả đột biến nhóm bệnh nhân lại, khác biệt có ý nghĩa thống kê với khoảng tin cậy 95% không chứa 65 Bảng 3.22 Tỷ lệ phát đột biến gen CYP1B1 di truyền qua hệ Gia đình 66 Di truyền 66 Khơng di truyền 66 66 Tổng 66 Lấy máu bố mẹ BN 66 66 27,3% 66 66 72,3% 66 11 66 100% 66 Lấy máu bố mẹ BN 66 66 66 66 Không lấy máu bố mẹ BN 66 66 Tổng số 66 11 66 18 66 66 Bảng 3.23 Đột biến gen CYP1B1 thành viên gia đình bệnh nhân 67 Bảng 3.24 Kết phát đa hình gen số gia đình bệnh nhân 68 Bảng 4.1 Kết phát tỷ lệ đột biến bệnh nhân châu Á 85 Bên cạnh xét đến mối liên quan kết hợp đặc điểm lâm sàng với tình trạng đột biến gen CYP1B1 thấy khả đột biến gen cao nhóm mang nhiều yếu tố phối hợp bệnh biểu sớm sau sinh, hai mắt giai đoạn nặng Từ giúp đưa lời khuyên với bệnh nhân gia đình đưa đến với nhiều đặc điểm lâm sàng cần làm xét nghiệm tìm đột biến gen CYP1B1 96 Khả đột biến gen CYP1B1ở nhóm bệnh nhân mang đồng thời ba đặc điểm bệnh biểu sớm sau sinh, hai mắt giai đoạn bệnh nặng cao gấp 6,47 lần so với khả đột biến nhóm bệnh nhân lại 110 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Phát triển phần mống mắt bề mặt vùng bè Hình 1.2 Vị trí gen MYOC nhánh dài nhiễm sắc thể Hình 1.3 Vị trí gen LTBP2 nhánh dài nhiễm sắc thể 14 Hình 1.4 Vị trí gen CYP1B1 nhánh ngắn nhiễm sắc thể Hình 1.5 Hình ảnh khơng gian chiều vùng C' tận protein CYP1B1 Hình 1.6 Sơ đồ minh họa chế ảnh hưởng đột biến gen CYP1B1 Hình 1.7 Vết rạn giác mạc màng Descemet Hình 1.8 Hình ảnh soi góc tiền phòng Hình 1.9 Vị trí đột biến gen CYP1B1 thường gặp 11 12 20 Hình 1.10 Loại vị trí đột biến gen CYP1B1 thường gặp người châu Á 20 Hình 1.11 Loại vị trí đột biến gen CYP1B1 thường gặp người da trắng 21 Hình 1.12 Loại vị trí đột biến gen CYP1B1 thường gặp người Di-gan 22 Hình 1.13 Loại vị trí đột biến gen CYP1B1 gặp người Trung Đơng 22 Hình 1.14 PCR khuếch đại exon 2, gen CYP1B1 đột biến p.G61E Hình 1.15 Cấu trúc phân tử dNTP ddNTP 23 24 Hình 1.16 Quá trình tổng hợp DNA bình thường (A) DNA bị ức chế (B) 25 Hình 1.17 Quy trình giải trình tự theo phương pháp ddNTP Hình 1.18 Các giai đoạn Kỹ thuật MLPA 27 26 Hình 1.19 Tỷ lệ phẫu thuật thành cơng nhóm có khơng có đột biến 31 Hình 1.20 Hình ảnh giải trình tự gen đột biến p.E173K 32 Hình 1.21 Phả hệ gia đình bệnh nhân mang đột biến gen p.E173K 33 Hình 1.22 Phả hệ gia đình Nhật Bản mang đột biến Asp192Val Val364Met 34 Hình 1.23 Phả hệ gia đình bệnh nhân Việt Nam mang đột biến gen CYP1B1 34 Hình 1.24 Hình ảnh phả hệ gia đình bệnh nhân Tây Ban Nha 35 Hình 2.1 Hình ảnh minh họa kết MLPA sử dụng Kit MLPA P128CYP450 Hình 3.1 39 Hình ảnh sản phẩm PCR exon (A), exon (B) gen CYP1B1 (+) mẫu đối chứng dương, (-) mẫu đối chứng âm, (1-5) mẫu bệnh nhân, (MK) Marker 52 Hình 3.2 Hình ảnh cấu trúc gen CYP1B1 với đột biến p.E229K 54 Hình 3.3 Hình ảnh giải trình tự gen bệnh nhân mã G15 54 Hình 3.4 Hình ảnh giải trình tự bệnh nhân mã G09 Hình 3.5 Hình ảnh giải trình tự bệnh nhân mã G24 Hình 3.6 Hình ảnh MLPA (hình trái) kết tính tốn (Relative Peak 55 55 Area) phần mềm coffalyser (hình phải) bệnh nhân G40 G02 Hình 3.7 58 Hình ảnh MLPA (hình trái) kết tính tốn (Relative Peak Area) phần mềm coffalyser (hình phải) bệnh nhân G45 G56 Hình 3.8 59 Mối liên quan phương pháp phẫu thuật với đột biến gen 62 Hình 3.9 Sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhân mã số G40 69 Hình 3.10 Hình ảnh giải trình tự gia đình bệnh nhân mã số G40 70 Hình 3.11 Sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhân mã số G85 71 Hình 3.12 Hình ảnh giải trình tự gia đình bệnh nhân mã số G85 71 Hình 3.13 Sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhân mã số G02 72 Hình 3.14 Hình ảnh MLPA thành viên gia đình bệnh nhân mã số G02 Các đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, exon gen CYP1B1 73 Hình 3.15 Sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhân mã số G56 74 Hình 3.16 Hình ảnh phả hệ gia đình bệnh nhân G08 74 Hình 3.17 Hình ảnh đột biến p.Q86K bệnh nhân G08 75 Hình 3.18 Hình ảnh đa hình gen gia đình bệnh nhân G08 75 Hình 3.19 Hình ảnh phả hệ gia đình bệnh nhân mã số G11 76 Hình 3.20 Hình ảnh di truyền đa hình gen p.L432V gia đình G11 76 Hình 3.21 Hình ảnh phả hệ gia đình bệnh nhân mã số G19 77 Hình 3.22 Hình ảnh phả hệ gia đình bệnh nhân mã số G20 77 Hình 3.23 Hình ảnh phả hệ gia đình bệnh nhân mã số G21 78 Hình 3.24 Hình ảnh phả hệ gia đình bệnh nhân mã số G24 78 Hình 3.6 Hình ảnh cấu trúc gen CYP1B1 với 04 đột biến 162 PHỤ LỤC ? Hình 3.6 Hình ảnh cấu trúc gen CYP1B1 với 04 đột biến (p.D242N, p.D218H, p.Q86K, p.G365E) ... Á nghiên cứu đột biến gen CYP1B1 nhằm phát đột biến gen hay gặp khu vực góp phần tìm chế gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát Năm 2011, nghiên cứu Hàn Quốc phát 11 loại đột biến, loại đột biến. .. phát phát người lành mang gen bệnh" thực với hai mục tiêu: Xác định đột biến gen CYP1B1 mối liên quan với lâm sàng bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát Phát người lành mang gen bệnh thành viên... quan bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát với đột biến gen Các nghiên cứu giới trước đề cập đến số dấu hiệu lâm sàng kết điều trị liên quan đến đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát