Ứng dụng kỹ thuật flow cytometry khảo sát tần suất xuất hiện kháng thể đồng loài kháng hồng cầu ở bệnh nhân truyền máu nhiều lần tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của tài liệu.
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT FLOW CYTOMETRY KHẢO SÁT TẦN SUẤT XUẤT HIỆN KHÁNG THỂ ĐỒNG LOÀI KHÁNG HỒNG CẦU Ở BỆNH NHÂN TRUYỀN MÁU NHIỀU LẦN TẠI VIỆN HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU TRUNG ƢƠNG Lê Xuân Hải* CS TĨM TẮT Lần Việt Nam chúng tơi ứng dụng thành cơng kỹ thuật phân tích Flow Cytometry đơn màu để phát kháng thể bất thường kháng hồng cầu Khảo sát 261 bệnh nhân (BN) truyền máu nhiều lần Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, thấy tỷ lệ bắt gặp kháng thể đồng loại kháng hồng cầu 42.15% 100% BN truyền máu 10 lần có kháng thể bất thường kháng hồng cầu Tỷ lệ bắt gặp kháng thể đồng loài chống hồng cầu BN nữ cao nhiều so với BN nam tỷ lệ thuận với tuổi số lần nhận máu * Từ khóa: Kỹ thuật Flow Cytometry; Kháng thể đồng loài; Truyền máu nhiều lần APPLYING FLOW CYTOMETRY TO STUDY FREQUENCY OF APPEARANCE OF ALLOANTIBODY AGAINST RED BLOOD IN MULTIPLY TRANSFUSION PATIENTS AT NATIONAL INSTITUTE OF HEMATOLOGY AND BLOOD TRANSFUSION Summary It is the first time in Vietnam, an analysis technique based on flow cytometry has been applied successfully in dectecting alloantibodies against red blood cell in multiple transfusion patients Study on 261 patients with multiple transfusions, we discovered that 42.15% of the objects had developed alloantibodies Alloantibodies were detected in 100% of patients who have received transfusion more than 10 times The incidence of alloantibodies detected in women patients was higher than that in men and closely related with age and times of transfusion * Key words: Flow Cytometry technique; Alloantibodies; Multiple transfusions ĐẶT VẤN ĐỀ Máu quan trọng cần thiết cho sống, nhờ có truyền máu nhiều người bệnh cứu sống, truyền máu gây tai biến nghiêm trọng không tuân thủ nguyên tắc an toàn truyền máu Phát nhóm máu hệ ABO, Rh hệ nhóm máu hồng cầu khác giúp việc truyền máu hiệu an toàn * Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: TS Nguyễn Đặng Dũng TS Phạm Văn Trân 19 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 Tại nước tiên tiến, an toàn truyền máu thực cách triệt để hòa hợp nhóm máu hệ ABO, Rh số nhóm máu khác phải thực sàng lọc kháng thể bất thường Tại Việt Nam, thực an toàn truyền máu miễn dịch hạn chế Chúng ta định nhóm máu hệ ABO, làm phản ứng chéo điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm mà chưa có điều kiện quan tâm nghiên cứu tới nhóm máu khác ngồi ABO Do vậy, BN truyền máu nhiều lần việc sinh kháng thể bất thường khó tránh khỏi Về chất, kháng thể gọi “bất thường” kháng thể miễn dịch đồng loài (chủ yếu kháng thể lớp IgG) chống lại kháng nguyên lạ có bề mặt hồng cầu, bạch cầu (hệ HLA) tiểu cầu (hệ HPA) người cho Có nhiều cách để phát kháng thể với mức độ xác, độ nhạy khác Các kỹ thuật khác độ phức tạp Hiện nay, phát kháng thể bất thường người truyền máu nhiều lần chủ yếu tập trung vào kháng thể đồng loài kháng hồng cầu Phương pháp truyền thống hay sử dụng phương pháp huyết học dựa nguyên tắc phản ứng ngưng kết Coombs gián tiếp Phương pháp độ nhạy không cao, có ưu điểm đơn giản, giá rẻ nên dễ ứng dụng triển khai diện rộng Ngày nay, với phổ biến phương pháp flow cytometry dựa nguyên lý phân tích tự động phản ứng đặc hiệu kháng nguyên-kháng thể có đánh dấu huỳnh quang, nghiên cứu phát kháng thể bất thường thực với độ nhạy cao phương pháp truyền thống Flow cytometry ứng dụng xác định kháng thể đồng loài kháng HLA [3], tiểu cầu [4] hồng cầu [5, 6] Việc phát kháng thể bất thường BN truyền máu nhiều lần cần thiết để đảm bảo an toàn truyền máu mặt miễn dịch, qua đó, chọn đơn vị máu phù hợp, nhằm nâng cao hiệu lần truyền máu Trong nghiên cứu này, ứng dụng kỹ thuật Flow Cytometry để: Phát tỷ lệ mang kháng thể miễn dịch đồng loài kháng hồng cầu BN truyền máu nhiều lần (≥ lần) ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu 261 BN truyền máu nhiều lần Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, đó, 175 BN chẩn đoán thalassaemia, 49 BN suy tủy xương, 37 BN xuất huyết giảm tiểu cầu Các BN thỏa mãn tiêu chuẩn sau: - Được chẩn đoán thalassaemia, suy tủy xương xuất huyết giảm tiểu cầu theo tiêu chuẩn chẩn đoán Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương - Truyền máu nhiều lần (≥ lần) - Lấy mẫu máu cho nghiên cứu sau lần truyền máu cuối tối thiểu tuần Phƣơng pháp nghiên cứu * Thiết kế nghiên cứu: lấy mẫu thuận tiện, nghiên cứu mô tả cắt ngang * Chuẩn bị bệnh phẩm: Lấy ml máu ngoại vi vào ống không chống đông, ly tâm tách huyết lưu trữ -600C làm thí nghiệm sàng lọc kháng thể đồng lồi kháng hồng cầu phương pháp Flow Cytometry * Chuẩn bị hồng cầu nhóm O: lấy ngẫu nhiên 20 mẫu hồng cầu nhóm O (mỗi mẫu ml) từ người cho máu tính nguyện Ly tâm lấy khối hồng cầu, từ khối hồng cầu O pha thành huyền dịch hồng cầu 1%, trộn pool 20 mẫu hồng cầu O thành huyền dịch “pool 1% O” Với cách chuẩn bị huyền dịch hồng cầu vậy, mẫu hồng cầu O ban đầu đại diện cho 5% “pool 1% O” 21 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 Do vậy, chúng tơi lấy ngưỡng dương tính 5% Flow Cytometry [6] * Phân tích phát kháng thể kháng hồng cầu Flow Cytometry: theo phương pháp Won mô tả [6]; ủ 100 ul huyền dịch hồng cầu “pool 1% O” với 200 ul huyết BN 45 phút 370C Rửa lần PBS, tái tạo huyền dịch cặn tế bào 100 ul PBS Tiếp tục ủ với ul antihuman IgG-FITC (Beckman Coulter, Mỹ) 20 phút, tránh ánh sáng Thêm ml PBS, phân tích chương trình “kháng thể kháng hồng cầu” lập sẵn phần mềm CXP 2.0 máy Cytomics FC500 Lấy ngưỡng âm tính mẫu huyền dịch hồng cầu ủ với anti mouse IgG-FITC * Xử lý số liệu: phương pháp thống kê y học sử dụng thuật toán 2 test (Chi test) KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Chƣơng trình kết phân tích Dùng phần mềm CXP cytometer 2.2 có sẵn máy Cytomics FC500, lập chương trình phân tích kháng thể bất thường hồng cầu với bước phân tích sau: - Thiết lập đồ hình thơng số FS line Vs SS line, chọn khoanh vùng đại diện hồng cầu vùng E (hình 1A) - Thiết lập chế độ phân tích đơn màu cho kháng thể anti-human IgG-FITC theo kênh huỳnh quang -FL1 log xác lập điện để chỉnh ngưỡng cut off mức 100 (hình 1B) Với mức POS ≥ 5% coi mẫu dương tính [6] Hình 1: Minh họa trường hợp dương tính với kháng thể miễn dịch đồng loài kháng hồng cầu BN truyền máu > 10 lần (A) Khoanh vùng phân tích vùng quần thể hồng cầu đại diện (vùng E) (B) Phân tích vùng E thấy 77,4% quần thể có biểu dương tính với anti-human IgG-FITC, chứng tỏ có tồn kháng thể miễn dịch đồng lớp IgG bám bề mặt hồng cầu, nói cách khác mẫu huyết BN có kháng thể “bất thường” kháng hồng cầu thử 22 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 Chúng thiết lập chương trình phân tích sử dụng chương trình phân tích mẫu huyết BN lưu trữ Trong 261 mẫu phân tích, mẫu phát dương tính thấp thu 5,2% mẫu phát dương tính cao thu 97,8% Đặc điểm kháng thể đồng loài lớp IgG kháng hồng cầu BN truyền máu nhiều lần * Tỷ lệ kháng thể đồng loài kháng hồng cầu (%) BN truyền máu nhiều lần: Số mẫu nghiên cứu: 261; số mẫu dương tính: 110 Kết nghiên cứu (42,15%) cao nhiều so với Nguyễn Thị Thanh Mai (2005: 27,4%) [2] Bùi Mai An (2006: 9,8%) [1] Điều sử dụng phương pháp Flow Cytometry để phát kháng thể đồng lồi có mặt, tác giả khác dùng phương pháp ngưng kết thông qua phản ứng Coomb gián tiếp Flow Cytometry phương pháp phân tích lượng lớn cho kết xác, có độ nhạy cao nhiều so với phản ứng Coomb gián tiếp, Fow Cytometry phát kháng thể trường hợp không phát phương pháp huyết học thông thường [3, 4] Tỷ lệ kháng thể đồng loài liên quan đến tuổi, giới, chẩn đoán lâm sàng số lần truyền máu Bảng 1: Tỷ lệ gặp kháng thể đồng loài kháng hồng cầu (%) BN truyền máu nhiều lần theo chẩn đốn lâm sàng ĐỐI TƯỢNG SỐ MẪU CĨ SỐ MẪU TỶ LỆ KHÁNG THỂ NGHIÊN (%) ĐỒNG LOẠI CỨU KHÁNG HỒNG CẦU (1) (2) (3) (4) Xuất huyết giảm tiểu cầu 37 15 40,54 Cộng chung 261 110 42,15 Chi test: p 0,454 Nhóm bệnh thalassemia có tỷ lệ bắt gặp cao (44,57%), sau nhóm xuất huyết giảm tiểu cầu (40,54%) Nhóm suy tủy xương có tỷ lệ bắt gặp thấp (34,69%) Sở dĩ tỷ lệ thấp suy tủy xương, tế bào dòng lympho giảm nên khả đáp ứng miễn dịch tiết kháng thể giảm Bảng 2: Một số yếu tố liên quan đến tỷ lệ xuất kháng thể đồng loại kháng hồng cầu BN thalassaemia GIỚI SỐ MẪU NGHIÊN CỨU SỐ MẪU CÓ KHÁNG THỂ ĐỒNG LOẠI KHÁNG HỒNG CẦU TỶ LỆ (%) Nam 135 49 36,30 Nữ 126 61 48,41 Cộng chung 261 110 42,15 Chi test: p = 0,047 Tỷ lệ gặp kháng thể đồng loài kháng hồng cầu lớp IgG nữ cao nam có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so sánh thuật toán 2, phù hợp với nhận xét Bùi Mai An [1], Nguyễn Thị Thanh Mai [2] nghiên cứu kháng thể bất thường kháng hồng cầu BN truyền máu nhiều lần Sở dĩ có chênh lệch nữ, yếu tố truyền máu, kháng thể Thalassaemia 175 78 44,57 kháng đồng loài kháng hồng cầu lớp IgG Suy tủy xương 49 17 34,69 xuất q trình chửa đẻ 23 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 Bảng 3: Tỷ lệ xuất kháng thể đồng loại kháng hồng cầu liên quan đến tuổi NHÓM TUỔI SỐ MẪU NGHIÊN CỨU SỐ MẪU CÓ KHÁNG THỂ ĐỒNG LOẠI KHÁNG HỒNG CẦU TỶ LỆ (%) 10 - 20 29 31,03 21 - 40 98 30 34,69 41 - 60 73 34 41,10 > 60 61 367 60,66 Tổng 261 110 42,15 thường BN truyền máu từ - 10 lần 70%, BN truyền máu lần 11,34% Tỷ lệ bắt gặp kháng thể bất thường tăng lên theo số lần truyền máu, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,001) Chi test KẾT LUẬN Với phần mềm CXP Cytometer 2.2, thiết lập chương trình phân tích Chi test: p = 0,006 máy Flow Cytometry Cytomics FC500 để phát kháng thể đồng loại lớp IgG Nhóm BN > 60 tuổi, tỷ lệ kháng thể đồng loài kháng hồng cầu cao (66,66%), sau đến nhóm 41 - 60 tuổi (41,10%) Ở nhóm tuổi 10 - 20 21 - 41, tỷ lệ bắt gặp kháng thể bất thường tương ứng 31,03% 34,69% Nhận xét phù hợp với kết Bùi Thị Mai An [1] Sự khác biệt tỷ lệ bắt gặp kháng thể đồng loại kháng hồng cầu nhóm tuổi rõ rệt, có ý nghĩa thống kê, với p < 0,05 so sánh thuật toán Chi test kháng hồng cầu huyết BN Bảng 4: Tỷ lệ xuất kháng thể đồng loại kháng hồng cầu liên quan đến số lần truyền máu 42,15% truyền máu nhiều lần Qua sàng lọc kháng thể kháng hồng cầu huyết 261 BN truyền máu nhiều lần Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương thấy: - Tỷ lệ phát kháng thể đồng loài lớp IgG kháng hồng cầu kỹ thuật Flow Cytometry BN truyền máu nhiều lần - Tỷ lệ bắt gặp kháng thể cao nhóm truyền máu > lần (70% nhóm truyền máu - 10 lần), 100% nhóm SỐ LẦN NHẬN MÁU SỐ MẪU NGHIÊN CỨU SỐ MẪU CÓ KHÁNG THỂ ĐỒNG LOẠI KHÁNG HỒNG CẦU TỶ LỆ (%) lần 95 17 11,34 - Tỷ lệ bắt gặp kháng thể đồng loại - lần 107 46 42,99 chống hồng cầu BN truyền máu nhiều lần - 10 lần 40 28 70,00 nữ cao nam tỷ lệ thuận với tuổi > 10 lần 19 19 100,00 Céng chung 261 110 42,15 Chi test: p = (2,479)-13 truyền máu > 10 lần số lần nhận máu TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi Thị Mai An, Bạch Quốc Khánh, Hoàng 100% BN truyền máu > 10 lần có kháng Thị Thanh Nga, Hồng Nhật Lệ CS Nghiên thể bất thường Tỷ lệ bắt gặp kháng thể bất cứu sàng lọc kháng thể bất thường hệ hồng cầu 24 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 BN bị bệnh máu Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương (2009 - 2010) Y học Việt Nam 2010, số 2, tập 373, tr.409-413 Nguyễn Thị Thanh Mai Nghiên cứu kháng thể bất thường kháng hồng cầu số đối tượng Bệnh viện Chợ Rẫy Y học thực hành 2005, số 5, tập 228, tr.14-15 Robert AB, Howard MG, Thomas ME Flow cytometric assessment of HLA alloantibodies 2006 Scornik JC Detection of alloantibodies by flow cytometry: relevance to clinical transplantation Cytometry 1995, 22 (4), pp.259-263 Stussi G, Huggel K, Lutz HU, Schanz U, Rieben R, Seebach JD Iso-type-specific detection of ABO blood group antibodies using a novel flow cytometric method Br J Haematol 2005.130, pp.954-963 Won DI, Jung OJ, Lee YS, Kim SG, Suh JS (2010) Flow cytometry antibody screening using pooled red cells Cytometry B Clin Cytom 2010, 78 (2), pp.96-104 Ngày nhận bài: 23/11/2012 Ngày giao phản biện: 5/1/2013 Ngày giao thảo in: 6/2/2013 25 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013 26 ... lần truyền máu 42,15% truyền máu nhiều lần Qua sàng lọc kháng thể kháng hồng cầu huyết 261 BN truyền máu nhiều lần Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương thấy: - Tỷ lệ phát kháng thể đồng loài. .. 97,8% Đặc điểm kháng thể đồng loài lớp IgG kháng hồng cầu BN truyền máu nhiều lần * Tỷ lệ kháng thể đồng loài kháng hồng cầu (%) BN truyền máu nhiều lần: Số mẫu nghiên cứu: 261; số mẫu dương tính:... kháng thể miễn dịch đồng loài kháng hồng cầu BN truyền máu nhiều lần (≥ lần) ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu 261 BN truyền máu nhiều lần Viện Huyết học - Truyền máu Trung