ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY DÀI HẠN PHÁT HIỆN CÁC BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ Ở BỆNH NHÂN ĐA U TỦY XƯƠNG TẠI VIỆN HUYẾT HỌCTRUYỀN MÁU TW

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY DÀI HẠN PHÁT HIỆN CÁC BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ Ở BỆNH NHÂN ĐA U TỦY XƯƠNG TẠI VIỆN HUYẾT HỌCTRUYỀN MÁU TW  Xây dựng được quy trình nuôi cấy dài hạn cho bệnh nhân ĐUTX nghiên cứu tại NIHBT  Bước đầu khảo sát các bất thường di truyền ở bệnh nhân ĐUTX.

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -oOo - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY DÀI HẠN PHÁT HIỆN CÁC BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ Ở BỆNH NHÂN ĐA U TỦY XƯƠNG TẠI VIỆN HUYẾT HỌC-TRUYỀN MÁU TW Sinh viên thực : Lê Thị Bích Liên Ngành : Cơng nghệ sinh học Giáo viên hướng dẫn : ThS Trần Cơng Hồng TS Dương Quốc Chính Viện Huyết học-Truyền máu TW TS Nguyễn Hữu Đức Học viện Nông nghiệp Việt Nam HÀ NỘI, 2016 LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu khoá luận trung thực chưa sử dụng công bố Em xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực khoá luận cảm ơn thơng tin trích dẫn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Sinh viên Lê Thị Bích Liên LỜI CẢM ƠN Lời em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban lãnh đạo Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương cho phép tạo điều kiện cho em hồn thành Khóa luận Tốt nghiệp Tiếp theo cho em gửi lời chân thành cảm ơn đến TS Nguyễn Hữu Đức, Trưởng Bộ môn Công nghệ sinh học Động vật, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nơng nghiệp Việt Nam, ThS Trần Cơng Hồng, Phó trưởng khoa Di truyền Sinh học phân tử, TS Dương Quốc Chính, Trưởng Khoa Di truyền Sinh học phân tử, Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương Các Thầy tận tình hướng dẫn, dạy dỗ, giúp đỡ, bảo truyền đạt cho em kiến thức kinh nghiệm vô quý báu suốt thời gian em thực Khóa luận Tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn với tình cảm chân thành đến tập thể cán Khoa Di truyền Sinh học phân tử, đặc biệt ThS.Vũ Thị Bích Hường, CN Nguyễn Thị Hồng Vân CN Kim Thị Ngọc Vân Các anh chị ln nhiệt tình bảo, giúp đỡ, thông cảm tạo điều kiện cho em học tập, thực hành kỹ thí nghiệm Em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Cơng nghệ sinh học tồn thể thầy giáo truyền đạt cho em kiến thức vô bổ ích quý báu suốt bốn năm em học tập trường Cuối cho em gửi lời cảm ơn đến tất người thân gia đình, bạn bè ln dành tình cảm, ủng hộ, tạo điều kiện tốt để em học tập hồn thành tốt cơng việc suốt thời gian qua Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Sinh viên MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Đa u tủy xương (Multiple Myeloma - MM) bệnh tăng sinh ác tính dịng plasmo (Plasma cells), thuộc tuỷ xương với có mặt tổn thương xương, tăng tương bào non, xuất protein đơn dòng huyết tương nước tiểu, đau xương, tăng canxi máu thiếu máu Tỷ lệ ĐUTX chiếm khoảng 1% bệnh ung thư 10% ung thư máu, cho bệnh có tiên lượng xấu chưa có khả chữa khỏi Tuy nhiên, đặc tính tăng sinh dẫn đến chết theo chương trình tế bào plasmo ác tính tách khỏi vi mơi trường tủy xương nên việc phân tích cơng thức nhiễm sắc thể tủy xương thường cho kết bình thường (âm tính giả) Chính vậy, cần phải nuôi cấy dài ngày với bổ sung interleukin 4, interleukin nhằm đảm bảo tế bào plasmo ác tính phân chia thu cụm nhiễm sắc thể (NST) dòng tế bào Việc phát bất thường di truyền quan trọng việc tiên lượng xếp loại nhóm nguy bệnh nhân MM Một số nghiên cứu cập nhật cho với với nhóm nguy trung bình nhóm nguy chuẩn thời gian sống thêm trung bình 4-5 năm 8-10 năm cịn với nhóm nguy cao, thời gian sống thêm trung bình khoảng đến năm dù sử dụng phác đồ điều trị liều cao với thuốc Thêm vào đó, việc phát xác tổn thương di truyền đánh giá chúng không giúp tư vấn cho bệnh nhân mà hỗ trợ bác sỹ lâm sàng lựa chọn thuốc phác đồ điều trị phù hợp Do đó, để góp phần nâng cao chất lượng tiên lượng bệnh phục vụ cho việc điều trị, em hướng dẫn thực đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy dài hạn nhằm phát bất thường nhiễm sắc thể bệnh nhân đa u tuỷ xương Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương (NIHBT)” 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích  Xây dựng quy trình ni cấy dài hạn cho bệnh nhân ĐUTX nghiên cứu NIHBT  Bước đầu khảo sát bất thường di truyền bệnh nhân ĐUTX 1.2.2 u cầu  Xây dựng quy trình ni cấy dài hạn để áp dụng thường quy cho bệnh nhân đa u tuỷ xương NIHBT  Thử nghiệm quy trình mẫu nghiên cứu thu thập NIHBT  Xác định tỷ lệ bệnh nhân có bất thường NST PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái quát bệnh lý Đa u tủy xương (Multiple Myeloma - MM) Đa u tủy xương bệnh lý ác tính dịng tương bào (Plasma cells) đặc trưng tăng sinh tích lũy bất thường tế bào dòng tương bào tủy xương, thuộc tuỷ xương với có mặt tổn thương xương, tăng tương bào non, xuất protein đơn dòng huyết tương nước tiểu, đau xương, tăng canxi máu thiếu máu Đa u tủy xương thể tủy ung thư tương bào (plasma cell – neoplasma) Bệnh MM chiếm 1% bệnh ung thư nói chung, chiếm 13% bệnh máu ác tính người da trắng 3% bệnh máu ác tính người da đen (Longo D.L, 1998) Tương bào dạng tế bào trưởng thành lympho dòng B Nguồn gốc tế bào lympho B từ tế bào gốc vạn tủy xương trải qua giai đoạn biệt hóa từ tiền lympho B, lympho B chín, lympho B trưởng thành cuối biệt hóa thành tương bào có khả tổng hợp chế tiết globulin miễn dịch (Ig) kích thích kháng nguyên gây rối loạn đặc trưng Ngược với tương bào bình thường, tế bào plasmo ác tính MM khơng biệt hố hồn chỉnh có receptor với IL-6, kết hợp với IL-6 tạo thành yếu tố thuận lợi cho phát triển, kéo dài đời sống tế bào plasmo ác tính dẫn đến lấn át dịng tế bào sinh máu bình thường, đồng thời phá hủy xương gây tăng canxi, acid uric máu gây rối loạn tăng tiết Ig bệnh lý Hình 2.1 Tương bào tăng sinh tủy xương (http://emedicine.medscape.com) 2.2 Các bất thường di truyền ĐUTX Trong bệnh ĐUTX, bất thường di truyền chia thành nhóm: nhóm đa bội chiếm tỷ lệ 55 – 60% nhóm khơng đa bội chiếm khoảng 40 – 45% Gần nửa bệnh nhân MM thuộc nhóm đa bội có 48 – 75 NST xuất nhiều trisomie nhiễm sắc thể 3, 5, 7, 9, 11, 15, 19 21 (Fonseca R cộng sự, 2009) Các bất thường khác 17p đột biến p53, đột biến RAS, chuyển đoạn MYC có tần suất tương đương hai nhóm đa bội khơng đa bội Trong bệnh ĐUTX, nhóm bất thường khơng đa bội chủ yếu đột biến đột biến gene mã hóa Ig Dạng đột biến hay gặp chuyển đoạn nhiễm sắc thể xảy vùng chuyển đổi Ig nhiễm sắc thể 14q32 Đa số đột biến gene sai sót xảy ba q trình biến đổi gene đặc hiệu tế bào B: trình tái tổ hợp ba đoạn gene VDJ, trình tái tổ hợp chuyển đổi Ig đột biến soma mức Những bất thường di truyền đa bội thường liên quan đến tiên lượng không tốt gồm chuyển đoạn liên quan đến IgH, nhân đoạn 1q, đoạn 1p đoạn nhiễm sắc thể 13 Các gen liên quan đến chuyển đoạn IgH MMSET FGFR3 4p16, cyclin D3 6p21, cyclin D1 11q13, cMAF 16q23, MAFA 8q24 MAFB 20q11 Trong nghiên cứu trung tâm, tần suất chuyển đoạn gene IgH ĐUTX khoảng 55% - 70% (Avet-Loiseau H cộng sự, 2002) Cho đến nay, nghiên cứu phát dạng đột biến gene chuỗi nặng IgH, gặp khoảng 40% trường hợp ĐUTX Trong giai đoạn sớm bệnh thường gặp bốn dạng bất thường di truyền: chuyển đoạn gene IgH chủ yếu sai sót xảy trình tái tổ hợp chuyển đổi hoăc đột biến soma mức tế bào B trung tâm mầm gọi chuyển đoạn IgH nguyên phát, đa bội với trisomie, đoạn nhiễm sắc thể 13, rối loạn điều khiển gene cyclin D Các bất thường di truyền đột biến N-RAS, K-RAS FGFR3 trường hợp có chuyển đoạn t(4;14), chuyển đoạn gene MYC, bất hoạt gen p53 kiện xảy trình tiến triển bệnh, gọi chuyển đoạn IgH thứ phát Ngoài ra, số đột biến chuyển đoạn liên quan đến hoạt động đường truyền tín hiệu tế bào NF-κB (NFκB pathway) chống lại chết theo chương trình đóng vai trị quan trọng phát sinh bệnh lý ĐUTX Bảng 1.1 Một số bất thường di truyền ĐUTX Bất thường di truyền Tỷ lệ (%) del(13q) 50% t(11 ;14) 15-20% t(4 ;14) 15% t(6 ;14) 20-25% del(17p) 10% (Phạm Quang Vinh, 2013) 2.3 Tương tác với vi môi trường tủy xương 10 2.5.3.2 Cấu trúc siêu hiển vi nhiễm sắc thể Trong nhiễm sắc thể chứa phân tử AND mạch kép, có đường kính 2nm AND liên kết với protein tạo sợi nhiễm sắc (chromonema) có cấu trúc xoắn nhiều cấp Sợi nhiễm sắc có đường kính 11nm, chuỗi hạt cườm gọi sợi nucleosome (nucleosome fiber) Mỗi hạt cườm nucleosome có đường kính 11nm gồm lõi cấu tạo phân tử histon (2H2A, 2H2B, 2H3, 2H4), sợi AND xoắn kép quan lõi histon chứa khoảng 146 cặp nucleotide với vòng Giữa hai nucleosome đoạn ADN phân tử histon Các nucleosome nối qua sợi xoắn kép AND dài khoảng 60 nucleotid Chuỗi nucleosome tạo thành sợi có chiều ngang 11 nm Sợi cuộn xoắn bậc tạo thành sợi nhiễm sắc có đường kính khoảng 30 nm gọi sợi solenoid (solenoid fiber) Sợi nhiễm sắc lại xếp cuộn lần tạo nên sợi có cấp độ đường kính khoảng 300 nm chứa vịng bên (looped domains) Các sợi có đường kính 300 nm xoắn tiếp lại thành cromatit có đường kính khoảng 700 nm NST kỳ phân bào trạng thái kép có cromatit nên đường kính đạt đến 1400nm Với cấu trúc cuộn xoắn, chiều dài NST thu ngắn từ 15000 – 20000 lần Sự thu gọn cấu trúc không gian NST thuận lợi cho phân li tổ hợp nhNST trình phân bào, đảm bào trì ổn định cấu trúc qua hệ tế bào thể Ngồi protein histon, NST cịn có nhiều protein axit điều hòa hoạt động gen 15 Hình 2.5 Cấu trúc siêu hiển vi nhiễm sắc thể (https://candidscience.files.wordpress.com) 2.6 Kỹ thuật di truyền nuôi cấy dài hạn tế bào bệnh lý ĐUTX Kỹ thuật nuôi cấy tế bào phân tích cơng thức nhiễm sắc thể ứng dụng để phân tích biến đổi di truyền bệnh ĐUTX Việc phát nhiễm sắc thể bất thường phản ánh tăng sinh cao mà cho thấy phát triển không phụ thuộc vào tế bào đệm tủy xương tế bào plamo ác tính Tuy nhiên, đặc tính tăng sinh dẫn đến chết theo chương trình tương bào ác tính tách khỏi vi môi trường tủy xương nên việc phân tích cơng thức nhiễm sắc thể tủy xương thường cho kết bình thường (âm tính giả) Khi sử dụng kỹ thuật ni cấy dài hạn có bổ sung cytokine IL-6, IL-4 GM-CSF tỷ lệ phát bất thường nhiễm sắc thể cải thiện lên đến 40% Để tiến hành kỹ thuật này, cần tế bào kỳ trình phân bào kỳ trình phân chia tế bào, NST có số lượng hình dạng co xoắn, đặc, co ngắn tối đa, thời điểm quan sát hình dạng đặc trưng Với mẫu bệnh phẩm dùng heparin để chống đông, sử dụng môi trường nuôi cấy giàu chất dinh dưỡng, gồm nhiều acid amin, yếu tố vi lượng, huyết bê (FBS), tế bào nhân lên thực kỹ thuật chuẩn bị tiêu NST Nguyên lý kỹ thuật tế bào plasmo từ tuỷ xương phân chia kích thích IL-4 IL-6 Sự phân chia tế bào kích thích interleukin xảy mạnh sau 120 tiếng điều kiện nuôi cấy 37°C Môi trường nuôi cấy xử lý với colcemid để ức chế phân bào, giữ tế bào trung kỳ tế bào thu hoạch cách sử dụng phương pháp xử lý nhược trương cố định lên tiêu NST Tiến hành nhuộm NST để phân tích NST Các NST nhuộm Giemsa bắt màu nhuộm, phương pháp nhuộm Giemsa cổ điển cho phép phân tích NST kích thước số tâm động Tuy nhiên, có NST có kích thước số tâm gần giống người ta sử dụng kỹ thuật nhuộm băng G để nhận dạng cá NST phát bất thường NST Kỹ thuật nhuộm G sử dụng để nhuộm NST kỳ xử lý enzyme phân giải protein nhuộm với Giemsa Băng tối đoạn ADN giàu A, T, băng sang đoạn giàu G, C Phương pháp cho hình ảnh NST có băng đậm nhạt, số lượng, thứ tự đặc điểm băng đặc thù cho NST 16 Hình 2.6 Bộ NST người nhuộm băng G (http://www.cellgs.com) 2.7 Phân tích kết Lam sau nhuộm Giêmsa quét hệ thống Metafer, phân tích phần mềm Ikaros Hoặc lưu tọa độ, vẽ lại cụm nhiễm sắc thể quan sát kính hiển vi thường Sau phân tích số lượng cấu trúc NST 2.7.1 Phân loại NST Bộ nhiễm sắc thể người có 46 NST, chia thành 23 cặp, gồm 22 cặp NST thường ký hiệu từ đến 22 cặp NST giới tính XX nữ XY nam (A) (B) Hình 2.7 46, XX (A); 46, XY (B) 17 Việc xác định phân loại NST thực dựa đặc điểm sau NST: Chiều dài NST: 2.7.1.1 Căn xếp số thứ tự NST theo nguyên tắc chiều dài giảm dần Căn vào chiều dài số tâm NST (tỷ lệ phần trăm độ dài cánh ngắn độ dài toàn NST), NST chia thành nhóm, kí hiệu A, B, C, D, E, F G: - Nhóm A (NST 1-3): NST kích thước lớn NHẤT, tâm gần Nhóm B (NST 4-5): kích thước lớn không phân biệt chiều dài, tâm gần Nhóm C ( NST 6-12 NST X) : kích thước trung bình, tâm gần giữa, khó phân biệt NST với Nhóm D (13-15): kích thước trung bình, tâm đầu, có vệ tinh gắn vào cánh ngắn Nhóm E ( 16-18): kích thước nhỏ, tâm ( NST 16), tâm lệch ( NST 17 18) Nhóm F (19-20): NST nhỏ, tâm Nhóm G (21-22 NST Y): NST nhỏ, tâm đầu có vệ tinh NST Y khơng có vệ tinh Hình 2.8 Các nhóm NST (http://www.rerf.jp/dept/genetics/giemsa_4_e.html) 18 2.7.1.2 Sự phân bố băng sáng tối NST Sau nhuộm băng, NST có vùng đậm, nhạt đặc trưng cho NST, cánh có vùng, vùng đánh số từ trở từ tâm ngồi Trong vùng có băng, băng vùng đánh số từ từ phía tâm Ngồi ra, băng băng đánh số từ trở từ phía tâm ngồi Hình 2.9 Sự phân bố băng NST (http://www.mun.ca) Để biểu thị điểm NST, người ta dùng ký tự: số NST, ký hiệu cánh, số vùng, số băng Bốn ký tự viết liên tục, có thêm băng sau bốn ký tự dấu chấm đến số băng Ví dụ: 8q21.1 vị trị băng 1, băng 1, vùng 2, cánh dài NST số 2.7.1 Phân tích kết xét nghiệm cơng thức NST (bằng Karyotype) Để mơ tả tồn NST tế bào viết số lượng NST kể NST giới, tiếp dấu (,) đến NST giới Nêu có bất thường thêm dấu (,) đến ký hiệu bất thường NST bị bất thường Nếu nhiều NST bị bất thường bất thường liên quan tới nhiều NST thứ tự mơ tả bất thường là: NST giới, NST có số thứ tự nhỏ viết trước ( trừ xen đoạn chuyển đoạn liên quan tới ba NST trở lên) 2.7.2 Các bất thường NST ký hiệu: 19 Đến có nhiều loại bất thường NST mô tả, sau số kí hiệu bất thường hay gặp del (deletion): đoạn der (derivative chromosomes): hậu bất thường tạo ( chuyển đoạn, cấu tạo lại) dup (duplication) : Nhân đoạn i (isochromosome) ider( isoderivative chromosomes) đẳng NST: NST có cánh Ins (insertion) : chèn đoạn inv (inversion): đảo đoạn có hai điểm gãy NST đoạn đảo vòng 180° nối trở lại mar ( marker chromosomes): NST bất thường không rõ nguồn gốc phần NST r (ring chromosome): NST hình nhẫn ter : Đầu tận (cũng viết pter qter để mơ tả đầu tận nhánh ngắn nhánh dài) + / - : Được đặt trước số NST thêm (+) bớt (-) NST Nếu đặt sau ký hiệu cánh NST : tăng thêm giảm chiều dài cánh Ví dụ: 47, XY, +21: NST nam, thừa NST 21 46, XX, 5q-: NST nữ có 46 NST, độ dài cánh dài NST số ngăn bình thường t : Chuyển đoạn (translocation): hai NST bị gãy trao đổi phần không tâm cho ví dụ: t(8;21)(q22;q22): NST số bị gãy vị trí 8q22, NST 21 bị gãy 21q22, hai đoạn cuối rời trao đổi với (hình 3) 20 Hình 2.10 t(8;21) (q22;q22) thể M2 ( theo Heim Mitelman, 1987) 21 PHẦN III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu - Thời gian tiến hành: Khóa luận thực thời gian từ ngày 1/8/2016 đến ngày - Địa điểm nghiên cứu : Khoa Di truyền Sinh học phân tử - Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương – 14 Trần Thái Tơng, n Hồ, Cầu Giấy, Hà Nội 3.2 Vật liệu nghiên cứu Dịch tủy hút từ khoang tủy sinh máu cho vào ống chống đông Heparin Sodium 5000 UI/ml: từ 2- 4ml Khoa Tế bào- Tổ chức học, Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương Hình 3.1: Mẫu dịch hút tủy xương bệnh nhân 3.3 Thiết bị, dụng cụ hóa chất Trang thiết bị,dụng cụ hóa chất thí nghiệm trình bày bảng sau Bảng 3.1: Trang thiết bị, dụng cụ thí nghiệm STT Thiết bị, dụng cụ Hãng sản xuất (nước) Máy ly tâm centrifuge Eppendorf (Đức) Cân phân tích Mettler (Đức) Tủ lạnh sâu -20°C, tủ lạnh 4°C Sanyo (Nhật) Tủ an toàn sinh học cấp Esco (Mỹ) Ống Heparin Sodium Chai nuôi cấy vô trùng SPL (Hàn Quốc) Pipet nhựa vô trùng Samco Scientific (Mexico) Ống Falcon 15 ml 10 Ống Falcon 50 ml 11 Ống tan máu 12 Tuýp Eppendord 1.7ml 22 Bảng 3.2: Hóa chất thí nghiệm ST T Tên hóa chất Hãng sản xuất Môi trường RPMI 1640 Gibco Huyết bào thai bê Gibco Biowest Kháng sinh: Streptomicin – Penecillin Gibco Acid acetic % Demecolcine Solution 10µg / ml Sigma Dung dịch nhược trương KCL 0.075M (pH 7.4) Acid acetic đậm đặc Merk Methanol tuyệt đối Merk 3.4 Phương pháp nghiên cứu 3.4.1 Phương pháp nuôi cấy dài ngày tế bào Mẫu bệnh phẩm sau lấy chuyển đến phòng xét nghiệm vòng tiếng đồng hồ Cấy 0,5-1,2ml dịch tủy xương vào 10ml môi trường RPMI-1640 10% FBS, 1% kháng sinh, bổ sung 100 μl IL-4 100 μl IL-6 Chú ý phải lắc nhẹ sản phẩm nuôi cấy Mẫu nuôi cấy 37°C, 5% CO2 120 Trong thời gian nuôi cấy cần kiểm tra lắc nhẹ chai Rough từ đến hai lần Điều làm hồng cầu lắng xuống đáy tế bào plasma phân chia nhiều (Kannan cộng sự, 2006) 3.4.2 Kỹ thuật thu hoạch Sau 120 nuôi cấy đặt vào tủ ấm 370C tiến hành thu hoạch (1) Cho 50 μl Colcemid vào tuyp nuôi cấy ủ ấm 370C khoảng 35 phút (2) Chuyển toàn huyền dịch qua ống Corning 15 ml Ly tâm 1000 vòng/10 phút Loại bỏ dịch cách cặn 0,5 ml (3) Tái huyền dịch cho 10 ml nhược trương, trộn nhẹ ủ tủ ấm 37 0C 20 phút 23 (4) Cho 0,5 – ml dung dịch Cornoy II Trộn nhẹ nhàng Cho nhiệt độ 37 0C thêm - phút (5) Ly tâm 1000 vịng/10 phút lấy cặn, hút bỏ dịch phía Cho – 10 ml Cornoy II vào trộn Và chờ nhiệt độ phòng 10 phút (6) Ly tâm 1000 vòng/ 10 phút Tái huyền dịch thích hợp (7) Lặp lại bước đến cặn tế bào màu trắng  Nhỏ tiêu - Các lam kính rửa ngâm qua nước cất, ngâm lại vào cồn 100 0, chuyển sang ngâm nước cất để lên giá lam, lau lam cho - Đặt giá lam vào ngăn đá tủ lạnh khoảng 10 phút, sau lấy để nghiêng 20 – 30 giấy thấm - Nhỏ huyền dịch vừa pha lên lam Chú ý nhỏ tiêu để đầu pipet cao mặt phiến kính từ 10-20 cm - Để tiêu khô tự nhiên.nhuộm 3.4.3 Nhuộm NST với Giemsa  Nhuộm Giêmsa: - Pha Giêmsa 10% từ Giêmsa mẹ nhuộm lam 5-10phút - Rửa vòi nước - Sấy khô tủ sấy 60◦C  Nhuộm băng G: dung để nhận dạng NST bất thường chuyển đoạn NST dựa vào băng sang tối NST - Hóa chất: Trypsin; Đệm pH 6,8 (KH2PO4: 9,1g/l + N2HPO4.2H2O: 11,5g/l); Nước muối 0,9%, huyết bào thai bê - Chuẩn bị hóa chất: +) Cốc 1: pha trypsin 1g/50ml nước muối 0,9% +) Cốc 2: pha 100ml huyết bào thai bê 2% +) Cốc 3: Nước muối 0,9% 24 +) Cốc 4: Nước muối 0,9% +) Cốc 5: Pha Giêm sa 10% đệm Ph 6,8 +) Cốc 6: Đệm pH 6,8 - Tiến hành kĩ thuật +) Nhúng lam cốc từ 3-4 phút +) Chuyển lam sang cốc 30 giây +) Chuyển lam sang cốc 15 giây +) Chuyển lam sang cố 15 giây +) Chuyển lam sang cố 10 phút +) Chuyển lam sang cố 15 giây +) Rửa vòi nước chảy +) Sấy khô tủ sấy 60°C 3.4.4 Phân tích kết Lam sau nhuộm Giêmsa quét hệ thống Metafer, phân tích phần mềm Ikaros (MetaSystems, Đức) Sau phân tích số lượng cấu trúc NST Đối với mẫu bệnh nhân, trung bình 20 tế bào phân tích 25