Theo Rojas và Stanley (1992), những vấn đề tồn tại trong việc phân biệt và định loại các loài trên thực tế thường phức tạp hơn nhiều so với lý thuyết. Một loài có thể có rất nhiều phân loài mà ta có thể dễ dàng phân biệt dựa theo đặc điểm cấu tạo và hình thái. Nhưng, đôi khi các phân loài giống nhau đến mức tưởng như là chúng cùng một loài. Vì vậy nghiên cứu về phân loại học để xác định loài của một nhóm loài và định loài của những mẫu vật mới chưa được biết đến, nhằm tạo cơ sở xây dựng và bảo vệ sự đa dạng loài là rất cần thiết.
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI “NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC CÁC CHỈ THỊ SSR PHÂN BIỆT BÒ TÓT (BOS GAURUS) VÀ BÒ NHÀ (BOS TAURUS)” Tên sinh viên: Lê Thị Hoài Ngành : Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Lê Văn Sơn TS Nguyễn Hữu Đức Hà Nội, tháng năm 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan toàn kết khóa luận trực tiếp thực Các số liệu kết công bố khóa luận hoàn toàn trung thực, xác chưa công bố công trình khác Hà Nội, ngày tháng Lê Thị Hoài năm 2016 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Lê Văn Sơn – Trưởng phòng Công nghệ AND ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh Học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam TS Nguyễn Hữu Đức – Trưởng Bộ môn Công nghệ sinh học động vật – Học viện Nông nghiệp Việt Nam; người trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo tạo điều kiện tốt cho suốt trình học tập nghiên cứu khoa học Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Hữu Đức – Trưởng môn Công nghệ sinh học động vật – Học viện Nông nghiệp Việt Nam bên cạnh, bảo, hướng dẫn động viên suốt trình hoàn thành khoá luận Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới KS Phạm Thanh Tùng, thS Lê Hoàng Đức – cán nghiên cứu phòng Công nghệ ADN ứng dụng, , Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình bảo, động viên cho lời khuyên quý báu công việc sống Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cán nghiên cứu, kỹ thuật viên phòng Công nghệ AND ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành khoá luận tốt nghiệp Tiếp theo, xin gửi lời cảm ơn đến Thầy, Cô khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, tận tình bảo cho suốt trình học tập trường Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn đến Bố, Mẹ toàn thể người thân gia đình bạn bè hỗ trợ, động viên, khuyến khích suốt thời gian qua Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng 2016 Lê Thị Hoài năm TÓM TẮT MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 : Các loại marker DNA Bảng 2.2 Phân loại khoa học bò tót Bảng 3.1 Trang thiết bị dụng cụ thí nghiệm Bảng 3.2 Các dung dịch cần pha Bảng 3.3 Các hoá chất vai trò tách chiết ADN Bảng 3.4 Bảng trình tự mồi SSR Bảng 3.5 Các thành phần phản ứng đọc trình tự Bảng 3.6 Lượng khuôn DNA template sử dụng đọc trình tự Bảng 3.7 Bảng quy trình phản ứng thực với máy PCR DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cơ chế bắt lỗi chéo giảm phân Hình 2.2 Cơ chế trượt lỗi trình mã Hình 2.3 Nguyên tắc kỹ thuật PCR Hình 2.4 Nguyên lý kỹ thuật điện di Hình 2.5 Ảnh bò tót tự nhiên Hình 2.6 Bò nhà Việt Nam DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên Tên tiếng Anh µl Microlitre bp Base pair ADN Acid deoxyribonucleic SSR Simple Sequence Repeat 10 electron vòng purine pyrimidine Đỉnh hấp thụ protein 280 nm, ARN 230 nm Sự hấp thụ ánh sáng tính đơn vị OD (Optical Density) Đối với ADN tinh khiết đơn vị OD 260 nm tương ứng với: 50g/ml ADN sợi đôi, 40g/ml ADN sợi đơn hay ARN 20g/ml oligonucleotide sợi đơn Từ giá trị OD đo suy nồng độ acid nucleotide mẫu tách chiết Ngoài ra, cần xác định tỷ lệ OD 260 OD280, tỷ lệ nằm khoảng 1,72,2 mẫu tách chiết xem Nếu mẫu bị nhiễm protein ARN tỷ lệ thấp nhiều Tuy nhiên, việc định luợng phương pháp hấp thu mật độ quang lại không cho biết chất lượng ADN ly trích Để biết xác chất lượng DNA ly trích, người ta sử dụng phương pháp định tính ADN cách điện di gel 2.5.3 Định tính ADN phương pháp điện di Nguyên lý điện di dựa vào đặc điểm cấu trúc phân tử ADN Đó đại phân tử tích điện âm đồng khắp bề mặt nên chịu tác động điện trường có hiệu điện cường độ thích hợp, chúng di chuyển cực dương điện trường Các đoạn ADN di chuyển điện trường gel với tốc độ tương quan nghịch với kích thước chúng Các đoạn ADN lớn di chuyển chậm ngược lại Trong thời gian định, đoạn ADN bé di chuyển xa đoạn lớn, từ mà ADN tách thành vạch băng gel điện di Hình 2.4 Nguyên lý kỹ thuật điện di Đối với phân tử ADN, việc điện di thực giá thể bán rắn gel Gel môi trường xốp với lỗ nhỏ cho phép phân tử acid nucleotide qua Có hai loại gel sử dụng tùy theo kích thước mức độ phân tách phân tử acid nucleotide: gel 28 agarose gel polyacrylamide 2.6 Tổng quan bò tót Bò tót (danh pháp khoa học: Bos gaurus, tên địa phương min, trước gọi Bibos gauris) minh, gọi gaur, động vật thuộc Guốc chẵn (Artiodactyla), họ Trâu bò (Bovidae) có lông màu sẫm kích thước lớn, sinh sống chủ yếu vùng đồi Ấn Độ Đông Nam Á Chúng sinh sống dạng hoang dã hay người hóa Nó có tên gọi khác bò rừng Mã Lai hay bò rừng bizon Ấn Độ Trên thực tế, bò tót quan hệ gần với bò rừng bizon châu Âu Bắc Mỹ Phân loại khoa học: Bảng 2.2 Phân loại khoa học bò tót Bảng 2.2 Phân loại khoa học bò tót Giới (regnum) Animalia Ngành (phylum) Chordata Lớp (class) Mammalia Bộ (ordo) Artiodactyla Họ (familia) Bovidae Phân họ (subfamilia) Bovinae Chi (genus) Bos Loài (species) B gaurus Đặc điểm sinh học: Bò tót nhìn giống trâu phía trước giống bò phía sau Bò tót loài thú có tầm vóc khổng lồ Một bò đực trưởng thành cao trung bình 1,8-1,9m, dài trung bình khoảng m Khối lượng trung bình bò tót Ấn Độ vào khoảng 1,3 tấn, bò tót Mã lai khoảng tấn, bò tót Đông Nam Á 1,5 Những to cao tới 2,1 - 2,2m, dài 3,6 - 3,8m nặng 1,7 Với vóc dáng này, bò tót loài thú lớn thứ chiều cao, xếp sau hươu cao cổ voi, chúng cao loài tê giác Về khối lượng, bò 29 tót đứng thứ cạn, sau voi, tê giác trắng tê giác Ấn Độ hà mã Con thấp đực khoảng 20 cm nặng khoảng 60 - 70% khối lượng đực Bò đực có màu đen bóng, lông ngắn gần trụi hết già Bò có màu nâu sẫm, cá thể sống địa hình khô thưa có màu đỏ Bò đực có sừng Sừng to, chắc, uốn cong phía trước Chiều dài trung bình sừng thường từ 80 – 85 cm bò đực, sừng bò ngắn, nhỏ uốn cong Trên trán, gốc sừng chỏm lông, thường có màu vàng Mũi sừng có màu xanh xám, chuyền dần sang xám đen đen bóng bò già Gốc sừng có màu xám đen, có lằn rãnh nằm ngang, gọi Phần gốc sừng mũi sừng có màu vàng nhạt Đuôi dài ngang đến khuỷu chân sau Ở chân, từ khuỷu chân trở xuống có màu trắng, trông giống tất trắng Con đực có luống bắp chạy dọc sống lưng đến bả vai, yếm lớn trước ngực, tạo dáng vẻ kỳ vĩ Về mặt di truyền, trước người ta cho chúng có quan hệ họ hàng gần với trâu, phân tích gen gần cho thấy chúng gần với bò hơn, với bò chúng sinh lai có khả sinh sản Người ta cho họ hàng gần chúng bò banteng cho chúng sinh lai có khả sinh sản Hình 2.5 Ảnh bò tót tự nhiên Tập tính: 30 Trong tự nhiên, bò tót sống thành đàn từ 8-10 cá thể Những bò đực già thường sống đơn độc hợp với thành nhóm nhỏ Bò tót thích ăn non, mầm tre non, cỏ non mọc nương rẫy cháy Có thai khoảng 270 ngày, đẻ năm lứa, lứa So với bò rừng, bò tót hơn, nguy hiểm cho người Khi bị bắn, bò rừng phân tán chạy trốn bò tót sẵn sàng công kẻ thù Bò tót dữ, chúng hay húc tung chướng ngại vật húc chết người [2] Một số bò tót mò giao phối với bò nhà, Năm 2008, Việt Nam người dân địa phương phát bò tót đực cường tráng từ đại ngàn làng, đuổi theo bò nhà khu vực nương rẫy chân núi Tà Nin Đến mùa động dục, bò lại mò Nó sẵn sàng chiến đấu với đối thủ bò đực nhà chung bầy, hạ gục bò đực trưởng thành, đồng thời cho đời 36 bò tót lai vượt trội thể trọng có đặc điểm lông, sừng.[3][4] Các phân loài: Bos gaurus laosiensis hay Bos gaurus readei: Bò tót Đông Nam Á, (có mặt Myanma Trung Quốc), Việt Nam, Lào Campuchia Đây phân loài bò tót có tầm vóc to lớn nhất, đáng tiếc, giống bò tót bị tàn sát nhiều Một đực to cao tới 2,2 m nặng Hiện nay, Việt Nam khoảng 300 bò tót, phân bố chủ yếu vườn quốc gia Mường Nhé (Điện Biên), vùng rừng núi Tây Nguyên, vườn quốc gia Chư Mom Rây (Kon Tum) vườn quốc gia Cát Tiên (Lâm Đồng), sân bay Phú Bài (Huế).[5] Tuy nhiên, đàn bò tót đứng trước hiểm họa diệt chủng cao rừng bị chặt phá nạn săn trộm thú quý Bos gaurus gaurus (Ấn Độ, Nepal) gọi "bò rừng bizon Ấn Độ", phân loài phổ biến Phân bố Ấn Độ Nepal, Bhutan Rất to lớn, đực nặng tới 1,7 tấn, nhiên nhỏ bò tót Đông Nam Á Sừng chúng cong sừng bò tót Đông nam Á Bos gaurus hubbacki (Thái Lan, Malaysia) Đây phân loài bò tót nhỏ Bò đực yếm trước ngực Bos gaurus frontalis, bò tót hóa hay bò tót nhà, lai bò tót bò nhà; có khả sinh sản 31 2.7 Tổng quan bò nhà Bò nhà thuộc giống bò lai Sind Bò lai Sind lai tạo Việt Nam theo hai đường tự nhiên nhân tạo từ năm 30 thể kỉ XX, sở lai bò bò Vàng Việt Nam bò đực bò Sind đỏ Ấn Độ Hiện giống bò phân bố rải rác nhiều nơi đặc biệt Ba Vì, vùng phụ cận Hà Nội, Biên Hoà (Đồng Nai), Ninh Thuận… Đặc điểm: + Lông màu vàng, vàng đậm vàng cánh dán + Đầu dài, trán dô, tai cúp, yếm rộng nhiều nếp nhăn, có u vai (nhất đực) + Chân cao, ngắn, bầu vú phát triển vừa phải, âm hộ nhiều nếp nhăn + Bò lúc trưởng thành khối lượngkhoảng từ 250 – 300 kg, bò đực khoảng 400 – 500kg +Sản lượng sữa đạt 800 – 1000kg/chu kì + Tỷ lệ đẻ 55 – 57% + Bê sơ sinh nặng 18 – 22kg [4] A B Hình 2.6 Bò nhà Việt Nam A Con đực, B Con 32 Giống bò Lai Sind mang đặc điểm tốt bò Vàng bò Sind nên chúng có ưu điểm dễ nuôi: thích nghi tốt với điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, chị đựng kham khổ, bệnh tật…Mặt khác bò lai Sind cho tỉ lệ thịt xẻ cao với sản lượng sữa tương đối thường dung làm bò cho phối với tinh giống chuyên sữa cao sản, tạo lai có khả cho sữa tốt hơn, dễ nuôi sinh sản tốt 2.8 Tình hình nghiên cứu bò tót (Bos gaurus) Việt Nam Các chuỗi lặp lại đơn giản (Simple Sequence Repeats – SSR) đoạn DNA ngắn gồm số nucleotide lặp lại liên tiếp, đơn vị có chiều dài từ đến cặp base số lượng đơn vị lặp lại thay đổi từ đến 40 đơn vị Những đoạn SSR phân bố gần tâm động đầu mút nhiễm sắc thể, có vai trò bảo vệ liên quan đến di chuyển nhiễm sắc thể trình phân bào hệ gen tất sinh vật nhân thực [7] Kỹ thuật SSR dựa nguyên lý PCR dùng cặp mồi đặc hiệu để nhân đoạn trình tự SSR Sự khác cấu trúc đơn vị lặp lại dẫn đến thay đổi độ dài đoạn lặp lại nhân lên xác định kiểm tra chạy điện di gel agarose gel polyacrylamide Các đoạn SSR đa hình độ dài phát lai DNA tách dòng, xác định trình tự.Hiện nay, kỹ thuật sử dụng rộng rãi lĩnh vực di truyền phân tử loài bò lập đồ di truyền, nghiên cứu đa dạng quan hệ di truyền, chọn giống Bằng việc sử dụng thị SSR, kết hợp với thị RFLP, đồ liên kết nhiễm sắc thể số 17 19 dòng lai backcross lai Bos gaurus Bos taurus xác lập [9,13] Con lai cuả bò Banteng (Bos javanicus) bò Zebu (Bos indicus) Nijman cộng (2003) giám định thị AFLP SSR [6] Trên đối tượng bò tót (Bos gaurus), Nguyễn Trung Thành cộng (2007) sử dụng 130 thị SSR bò để đánh giá mức độ đa dạng di truyền loài bò tót Việt Nam Kết có 117 thị SSR khuếch đại thành công phản ứng PCR với DNA tổng số bò tót Nghiên cứu xác định thị SSR nhiễm sắc thể Y có tính đặc trưng cao cho loài bò tót với băng khuếch đại bò 33 tót đực Kết sở quan trọng giúp cho việc phân biệt bê đực nghi lai bò tót bê đực chủng thị SSR đặc trưng cho bò tót Phần III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu Thời gian Khoá luận tiến hành từ 08/2016 đến 01/2017 Địa điểm nghiên cứu Phòng công nghệ ADN ứng dụng thuộc Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam Khoa Công nghệ sinh học thuộc Học viện Nông nghiệp Việt Nam 3.2 Đối tượng nghiên cứu Bò tót (Bos gaurus) bò nhà (Bos taurus) 3.3 Vật liệu nghiên cứu 3.3.1 Vật liệu Mẫu mô bò tót thu nhận từ bò tót đực vườn quốc gia Phước Bình, huyện Bác Ái – Ninh Thuận Mẫu mô bò nhà thu nhận từ đàn bò nhà người dân thôn Bạc Rây, xã Phước Bình, huyện Bác Ái - Ninh thuận 3.3.2 Dụng cụ hoá chất Trang thiết bị, dụng cụ, hoá chất dung dịch đệm cần pha dung thí nghiệm đề tài trình bày bảng sau: Bảng 3.1 Trang thiết bị dụng cụ thí nghiệm Bảng 3.1 Trang thiết bị dụng cụ thí STT Tên thiết bị Xuất xứ Cân phân tích XB 1200C Thuỵ sỹ 34 Hệ thống máy điện di EPS 300 Thuỵ điển Hệ thống buồng chụp UV ECX-F15.M Pháp Máy li tâm lạnh Legend Micro 21R Eppendorf (Đức) NanoDrop Lite Thermo Fisher Scientific (Mỹ) Panh, kéo Việt Nam Pipette (Single) Eppendorf (Đức) Máy PCR Veriti™ 96-Well Thermal Cycler Applied Biosystems (Mỹ) Bể ổn nhiệt Memmert Đức 10 Lò vi sóng Sharp Nhật 11 Tủ cấy vô trùng Nu.400.406E NUAIRE (Mỹ) 12 Tủ lạnh sâu -200C Sanyo (Nhật bản) 13 Tủ lạnh -800C Panasonic (Nhật Bản) 14 Tủ lạnh 40C LG (Hàn Quốc) 15 Máy đọc trình tự ABI 3500XL Applied Biosystem (Mỹ) Bảng 3.2 Các dung dịch cần pha Bảng 3.2 Các dung dịch cần pha STT Dung dịch Thành phần Cell Lysis Solution 10 mM Tris HCl; EDTA 100 nM; SDS 1%; NaCl 20mM; pH = 8,0 Proteinase K 20 mg/ml 0,01g hòa tan vào 500 µl H2O Amonium acetate 7,5M 5,78g Amonium acetate hòa tan vào 10 ml H2O Ethanol 70% 70 ml Ethanol 100% 30 ml H2O Đệm TAE 1X 20ml TAE 50X 980ml nước deion Dung dịch Agarose 1% Hoà tan 1g agarose vào 100 ml dung dịch TAE 1X 3.4 Phương pháp nghiên cứu 3.4.1 Thu mẫu Mẫu mô mô tai thu nhận từ bò tót đực bò nhà bảo quản cồn 98% vận chuyển phòng thí nghiệm Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công 35 nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam, số 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Mẫu sau thấm khô cồn bảo quản tủ lạnh -80 0C 3.4.2 Tách chiết ADN Bảng 3.3 Các hoá chất vai trò tách chiết ADN Bảng 3.3 Các hoá chất vai trò Hoá chất Solution Vai trò Tris - HCl Liên kết với ion hoá trị hai, liên kết dẫn tới ức chế hoạt động enzym thuỷ phân axít nucleic, mà axít nucleic không bị phân huỷ EDTA Điều chỉnh pH dung dịch, tránh làm ảnh hưởng tới ADN Là chất tẩy, có nhiệm vụ loại bỏ phân tử lipid màng, làm đứt gãy màng tế bào màng nhân thành mảnh nhỏ cho phép ADN phóng thích bên SDS Protein K Solution Amoni acetate 7.5M Phân giải protein, giúp loại bỏ protein gắn kết với ADN phá hủy enzym tế bào đảm bảo ADN tách nguyên vẹn Làm cho protein kết tủa (CH3COONH4) Ethanol 100% Tủa ADN Ethanol 70% Rửa tủa ADN Nước deion vô trùng Hoà tan tủa ADN Tiến hành tách chiết ADN Phương pháp tách chiết mẫu ADN bò nhà từ mẫu mô tai Các mẫu máu mẫu mô tai sau thu thực địa bảo quản ống chống đông cồn 100% Với mẫu mô tai, trước tiến hành tách chiết DNA tổng số xử lý làm khô tự nhiên không khí Quy trình tách chiết 36 • Cân 0,2 g mô tai cho vào cối sứ vô trùng; • Đổ N2 lỏng vào cối, dùng chày nghiền mẫu mô tai thành dạng bột mịn Chuyển bột cối vào ống eppendorf ml; • Mỗi ống eppendorf chứa bột nghiền mô tai bổ sung 500 µl Lysis Buffer (50 mM Tris - HCl, 20 mM NaCl, mM EDTA 1% SDS, pH 8) Bổ sung 5µl Proteinase K (20mg/ml) vào hỗn hợp, ủ qua đêm 56oC; • Tinh DNA: + Thêm 500 µl CH3COONH4 7,5 M vào hỗn hợp sau ủ -20 oC, ly tâm 13000 vòng/phút 4oC 30 phút, thu dịch nổi; chuyển dịch sang ống eppendorf 1,5 ml + Tủa DNA cồn tuyệt đối tỷ lệ 2:1 -20 oC giờ, ly tâm thu tủa 13000 vòng/phút 4oC; + Rửa tủa cồn 70%, ly tâm thu tủa 13000 vòng/phút 4oC; + Thổi khô hòa tan tủa 40 µl H2O, bảo quản -200C Phương pháp tách chiết ADN bò tót từ mẫu mô • Cân 0.2 mô cho vào ống eppendorf ml vô trùng chứa viên bi sắt vô trùng • Đổ N2 lỏng vào bình có chứa ống eppendorf ml chứa mẫu, đưa mẫu lên máy nghiền với tố độ 250 vòng/ phút phút • Mỗi ống eppendorf chứa bột nghiền mô tai bổ sung 500µl Lysis Buffer (50 mM Tris - HCl, 20 mM NaCl, mM EDTA 1% SDS, pH 8) Bổ sung them 10 µl Proteinase K (20mg/ml) vào hỗn hợp ủ 56 0C 5-6 tiếng • bể ổn nhệt Tinh ADN: + Thêm 500 µl CH3COONH4 7,5 M vào hỗn hợp sau ủ -20oC, ly tâm 13000 vòng/phút 4oC 30 phút, thu dịch nổi; 37 + Tủa DNA cồn tuyệt đối tỷ lệ 2:1 -20oC giờ, ly tâm thu tủa 13000 vòng/phút 20 phút 4oC; + Rửa tủa cồn 70%, ly tâm thu tủa 13000 vòng/phút 20 phút 4oC + Thổi khô hòa tan tủa 40 µl H2O, bảo quản -200C Kiểm tra sản phẩm ADN tách chiết - Định tính ADN tổng số: Mẫu ADN tách chiết diện gel Agarose 1%, dung dịch đệm TAE 1X hiệu điện 110 V, cương độ dòng điện 40 mA 30 phút Nhuộm gel điện di với Ethidium Bromide 10 - 15 phút Dưới tia UV, Ethidium Bromide lien kết với sợi đôi ADN phát quang tạo thành băng (vạch) gel - Định lượng ADN tách chiết: Đo nồng độ ADN tách chiết kiểm tra độ tinh máy NanoDrop Lite Sau định lượng, tiến hành pha loãng với tỷ lệ thích hợp để đưa mẫu nồng độ 25 ng/µl nhằm đảm bảo cho phản ứng PCR 3.4.3 Chọn lọc điều kiện cho phản ứng PCR Lựa chọn thị SSR: Trong nghiên cứu này, sử dụng cặp mồi sau: Bảng 3.4 Bảng trình tự mồi SSR Bảng 3.4 Bảng trình tự mồi SSR Tên TGLA227f Trình tự mồi CGAATTCCAAATCTGTTAATTTGCT TGLA227r ACAGACAGAAACTCAATGAAAGCA BM2113f GCTGCCTTCTACCAAATACCC BM2113r CTTCCTGAGAGAAGCAACACC TGLA53f GCTTTCAGAAATAGTTTGCATTCA TGLA53r ATCTTCACATGATATTACAGCAGA 38 ETH10f GTTCAGGACTGGCCCTGCTAACA ETH10r CCTCCAGCCCACTTTCTCTTCTC SPS115f AAAGTGACACAACAGCTTCTCCAG SPS115r AACGAGTGTCCTAGTTTGGCTGTG TGLA126f CTAATTTAGAATGAGAGAGGCTTCT TGLA126r TTGGTCTCTATTCTCTGAATATTCC TGLA122f CCCTCCTCCAGGTAAATCAGC TGLA122r AATCACATGGCAAATAAGTACATAC INRA023f GAGTAGAGCTACAAGATAAACTTC INRA023r TAACTACAGGGTGTTAGATGAACTC ETH3f GAACCTGCCTCTCCTGCATTGG ETH3r ACTCTGCCTGTGGCCAAGTAGG ETH225f GATCACCTTGCCACTATTTCCT ETH225r ACATGACAGCCAGCTGCTACT BM1824f GAGCAAGGTGTTTTTCCAATC BM1824r CATTCTCCAACTGCTTCCTTG L15612f CGATCAATYCCYAAYAAACTAGG H15915r TCTCCATTTCTGGTTTACAAGAC HAUT27f AAC TGC TGA AAT CTC CAT CTT A HAUT27r TTT TAT GTT CAT TTT TTG ACT GG ILSTS006f TGT CTG TAT TTC TGC TGT GG ILSTS006r ACA CGG AAG CGA TGT AAA CG ETH185f TGC ATG GAC AGA GCA GCC TGG C ETH185r GCA CCC CAA CGA AAG CTC CCA G BM1818f AGC TGG GAA TAT AAC CAA AGG BM1818r AGT GCT TTC AAG GTC CAT GC HEL13f TAA GGA CTT GAG ATA AGG AG HEL13r CCA TCT ACC TCC ATC TTA AC Chọn lọc điều kiện phản ứng PCR (Chu trình nhiệt thành phần phản ứng): 39 • • • PCR đơn cho cặp mồi Kiểm tra sản phẩm PCR Thiết lập hỗn hợp PCR tiêu chuẩn kết hợp với thay đổi nồng độ MgCl2 Khuyếch đại sản phẩm phân tích sản phẩm Nếu sản phẩm lượng sản phẩm thấp Giữ nguyên nhiệt độ gắn mồi, tăng them 10 chu kỳ nhiệt kiểm tra lại Pha loãng sản phẩm PCR 10 lần, cố định nhiệt độ gắn mồi PCR lại Tăng lương ADN khuôn kiểm tra có mặt chất ức chế trình chuẩn bị mẫu cách sử dụng đối chứng dương • Tăng thời gian nhiệt độ bước biến tính mạch ADN khuôn 3.4.4 Phân tích kết điện di sản phẩm PCR Sản phẩm PCR ba mẫu với mồi nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu điện di máy điện di EPS 300 với điện trường 110V, 400mA 40 phút Bản điện di sau phuộm Ethidium Bromide 15 phút soi máy đo UV ECX-F15.M Các band, vạch ADN đa hình đặc trưng có bò tót bò nhà tách khỏi điện di tiến hành gel để tách ADN Qui trình gel thực theo Kit GeneJET Gel Extraction Kit • với bước tiến hành sau: Gel chứa đoạn ADN sau cắt khỏi điện di chuyển vào ống eppendorf 2ml xác định khối lượng, sau cân xác định khối lượng gel • có ống Bổ sung Binding Buffer vào ống eppendorf theo tỉ lệ 1:1 (Ví dụ 100mg gel bổ sung thêm 100 µl Binding Buffer) 560C 10 phút • Chuyển dịch sau ủ sang cột lọc ly tâm 13000 vòng/phút, phút 0C, loại bỏ dịch • Bổ sung vào cột lọc 700 µl Wash Buffer, ly tâm 13000 vòng/phút, phút, • loại bỏ dịch Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1,5 ml mở nắp phút để cồn bay hết • Thêm 50 µl H2O vào cột lọc, ly tâm 13000 vòng/phút, phút thu lấy dịch bảo quản -200C 40 3.4.5 Đọc trình tự đoạn ADN thu sau bước gel Sản phẩm ADN tinh đọc trình tự máy đọc trình tự ABI 3500 hãng Applied Biosystem (Mỹ) với thành phần mix theo tỷ lệ sau: Bảng 3.5 Các thành phần phản ứng đọc trình tự Bảng 3.5 Các thành phần phản ứng đọ Thành phần FC/Conc Lượng thể tích 2.5X 0.5 Bigdye buffer 5X DNA template Xem bảng Bigdye Terminator v3.1 Primer 3.2 pmol H2O Fill to 10 Bảng 3.6 Lượng khuôn DNA template sử dụng đọc trình tự Bảng 3.6 Lượng khuôn DNA template sử dụ Khuôn (bp) Lượng (ng/µl) 100-200 1-3 200-500 3-10 500-1000 5-20 1000-2000 10-40 >2000 20-50 Thực phản ứng Bảng 3.7 Bảng quy trình phản ứng thực với máy PCR Bảng 3.7 Bảng quy trình phản ứng thực h Chu trình Nhiệt độ (0C) Thời gian 96 30 96 10 sec 50 sec 41 60 ∞ Tinh sản phẩm cồn Lấy sản phẩm khỏi máy PCR, spin nhanh Bổ sung 5µl EDTA 125mM 60µl Ethanol 100%, đảo đều, ủ -20 0C 30 phút Ly tâm 13000 vòng/phút 15 phút 40C, sau đổ dịch Bổ sung 60µl Ethanol 70%, ly tâm 12000 vòng/phút phút 40C Đổ dịch, làm khô Biến tính sản phẩm Bổ sung 20 µl Hi-Di (1X), đảo Spin nhanh biến tính 950C phút Điện di mao quản đọc trình tự 3.4.6 Xử lý trình tự đoạn ADN đọc trình tự ADN đọc đem so sánh đối chiếu NCBI để xác định đoạn trình tự tương đồng NCBI 42